Name: Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Poznaj metodę HDX-MS do badania dynamiki konformacyjnej syntetaz lantypeptydowych. Ta technika umożliwia identyfikację kluczowych regionów enzymów w warunkach zbliżonych do natywnych bez konieczności etykietowania białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kanadyjską Radę Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią, Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, Kanadyjską Fundację Innowacji oraz fundusze start-upowe Uniwersytetu McGill.

<ol><li>Karplus, M., McCammon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+simulations+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics simulations of biomolecules.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).</li>
<li>Campbell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+dynamics+in+the+evolution+of+new+enzyme+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).</li>
<li>Tokuriki, N., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamism+and+evolvability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protein dynamism and evolvability.</a> Science. 324 (5924), 203-207 (2009).</li>
<li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).</li>
<li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224(2011).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214(1991).</li>
<li>Zhang, Z., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+amide+hydrogen+exchange+by+mass+spectrometry%3A+a+new+tool+for+protein+structure+elucidation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation.</a> Protein Science. 2 (4), 522(1993).</li>
<li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li>
<li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).</li>
<li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+architecture+of+protein+complexes+by+an+orthogonal+approach+combining+HDXMS%2C+CXMS%2C+and+disulfide+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).</li>
<li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li>
<li>Masson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+performing%2C+interpreting+and+reporting+hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+%28HDX-MS%29+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments.</a> Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Site-Specific+Method+for+Irreversible+Covalent+Labeling+of+Proteins+with+a+Fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore.</a> Scientific Reports. 5, 16883(2015).</li>
<li>Marion, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+the+overlap+problem+in+the+assignment+of+proton+NMR+spectra+of+larger+proteins+by+use+of+three-dimensional+heteronuclear+proton-nitrogen-15+Hartmann-Hahn-multiple+quantum+coherence+and+nuclear+Overhauser-multiple+quantum+coherence+spectroscopy%3A+application+to+interleukin+1.beta%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta.</a> Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).</li>
<li>Balasubramaniam, D., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-exchange+mass+spectrometry+for+the+study+of+intrinsic+disorder+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Goswami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+window+expansion+for+HDX+analysis+of+an+intrinsically+disordered+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).</li>
<li>Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Unstructured+Regions+and+Synergistic+Folding+in+Intrinsically+Disordered+Proteins+with+Amide+H%2FD+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).</li>
<li>Mitchell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+and+Conformational+Analysis+of+the+Herpesvirus+saimiri+Tip-C484+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein.</a> Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).</li>
<li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+with+top-down+electron+capture+dissociation+for+characterizing+structural+transitions+of+a+17+kDa+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).</li>
<li>Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Dynamic+Structural+Properties+of+a+Lanthipeptide+Synthetase+using+Hydrogen-Deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).</li>
<li>Hebling, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).</li>
<li>Duc, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+application+of+bicelles+for+conformational+analysis+of+G+protein-coupled+receptors+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).</li>
<li>Canul-Tec, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+allosteric+inhibition+of+excitatory+amino+acid+transporter+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1.</a> Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).</li>
<li>Reading, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+Membrane+Protein+Conformational+Dynamics+within+Native+Lipid+Compositions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).</li>
<li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50839(2013).</li>
<li>Lento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+ElectroSpray+Ionization+Hydrogen-deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry+for+Studying+Protein+Structure+and+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).</li>
<li>Schowen, K. B., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+isotope+effects+on+enzyme+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Solvent isotope effects on enzyme systems.</a> Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).</li>
<li>Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deuteros%3A+software+for+rapid+analysis+and+visualization+of+data+from+differential+hydrogen+deuterium+exchange-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).</li>
<li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071(2011).</li>
<li>Burkitt, W., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).</li>
<li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przepływ pracy HDX-MS przedstawiony w tym protokole zapewnia niezwykle solidną platformę do mapowania przestrzennego rozkładu strukturalnie dynamicznych elementów w białkach oraz do badania, jak ta dynamika zmienia się w odpowiedzi na zaburzenia (wiązanie ligandów, mutageneza enzymatyczną itp.). HDX-MS ma kilka wyraźnych zalet w porównaniu z innymi podejściami biologii strukturalnej, które są powszechnie stosowane do badania dynamiki konformacji. Przede wszystkim potrzebne są tylko niewielkie ilości białka. Korzystając z...

Białka to strukturalnie dynamiczne cząsteczki, które próbkują różne konformacje w skalach czasowych, począwszy od wibracji wiązań w skali femtosekundowej, a skończywszy na rearanżacjach całych domen białkowych, które mogą wystąpić w ciągu wielu sekund1. Te fluktuacje konformacyjne są często krytycznymi aspektami funkcji enzymu/białka. Na przykład zmiany konformacyjne wywołane wiązaniem ligandów są często krytycznie ważne dla modulacji funkcji enzymu, albo poprzez organizowanie reszt miejsca aktywnego potrzebnych do katalizy, definiowanie miejsc wiązania substratu w sekwencyjnych mechanizmach kinetycznych, osłanianie reaktywnych produktów pośrednich przed środowiskiem, albo poprzez modulowanie funkcji enzymu za pośrednictwem sieci allosterycznych. Ostatnie badania wykazały również, że dynamika konformacyjna może być zachowana w trakcie ewolucji i że zakłócenia zachowanych ruchów molekularnych mogą być skorelowane ze zmianami specyficzności substratu i pojawieniem się nowych funkcji enzymów2,3.
W ostatnich latach spektrometria mas wymiany wodorowo-deuterowej (HDX-MS) szybko stała się potężną techniką do badania, jak krajobrazy konformacyjne białek reagują na zakłócenia, takie jak wiązanie ligandów lub mutageneza4,5,6,7. W typowym eksperymencie HDX-MS (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), interesujące białko umieszcza się w buforze przygotowanym w D2O, co powoduje zastąpienie protonów wymiennych w rozpuszczalniku deuterią. Szybkość wymiany ugrupowania amidowego wiązań peptydowych zależy silnie od pH, lokalnej sekwencji aminokwasów oraz od lokalnego środowiska strukturalnego amidu8. Amidy, które są zaangażowane w interakcje wiązań wodorowych (takie jak te obecne w α-helisach i β-arkuszach) wymieniają się wolniej niż amidy w niestrukturalnych obszarach białka, które są wystawione na działanie rozpuszczalnika luzem. Tak więc stopień wychwytu deuteru jest odzwierciedleniem struktury enzymu. Oczekuje się, że enzymy, które są konformacyjnie dynamiczne lub które przechodzą przemiany strukturalne po związaniu liganda, dadzą mierzalną odpowiedź HDX.
Mechanistyczne podstawy powolnego kursu wymiany amidu strukturalnego są pokazane w Rysunek 25,8,9. Aby przejść HDX, region strukturalny musi najpierw przejściowo pobrać próbkę niesfałdowanej konformacji, tak aby cząsteczki rozpuszczalnika, które katalizują HDX wymieniać się poprzez określony mechanizm chemiczny kwas/zasada, miały dostęp do wymiennego amidu. Ostatecznie, względne wielkości chemicznego kursu wymiany (kchem) oraz szybkości składania i ponownego składania (kotwarcia i kzamknięcia) determinują szybkość HDX zmierzoną w eksperymencie5,8. Z tego prostego modelu kinetycznego jasno wynika, że zakres absorpcji deuteru będzie odzwierciedlał leżącą u jego podstaw dynamikę konformacyjną (zdefiniowaną przez kotwarcia i kzamknięcia). Większość eksperymentów HDX-MS jest przeprowadzana w przepływie pracy oddolnej, w którym, po reakcji wymiany, białko będące przedmiotem zainteresowania jest trawione na peptydy, a wychwyt deuteru przez każdy peptyd jest mierzony jako wzrost masy7. W ten sposób HDX-MS umożliwia mapowanie perturbacji dynamiki konformacyjnej enzymu w lokalnej skali przestrzennej peptydów, co pozwala badaczowi ocenić, w jaki sposób perturbacja zmienia dynamikę w różnych regionach enzymu będącego przedmiotem zainteresowania.
Korzyści płynące z podejścia HDX-MS do wyjaśnienia dynamiki strukturalnej białek są liczne. Po pierwsze, metoda może być wykonywana z małymi ilościami białka natywnego lub na kompleksach białkowych w układach o budowie czwartorzędowej10. Nie jest nawet konieczne, aby preparat enzymatyczny użyty w teście był wysoce oczyszczony11,12, o ile oddolny przepływ pracy HDX-MS zapewnia wystarczającą liczbę pewnie zidentyfikowanych peptydów, które pokrywają sekwencję białka będącą przedmiotem zainteresowania. Co więcej, HDX-MS może dostarczyć informacji na temat dynamiki konformacji w warunkach zbliżonych do natywnych bez konieczności znakowania białek specyficznego dla miejsca, co byłoby stosowane w badaniach fluorescencji pojedynczych cząsteczek13, i nie ma ograniczeń co do wielkości białka lub kompleksu białkowego, który można badać (co sprawia, że podejścia takie jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego [NMR] są trudne)7, 14. Wreszcie, metody HDX-MS z rozdzielczością czasową mogą być stosowane do badania wewnętrznie nieuporządkowanych białek, które są trudne do zbadania za pomocą krystalografii rentgenowskiej15,16,17,18. Głównym ograniczeniem HDX-MS jest to, że dane mają niską rozdzielczość strukturalną. Dane HDX-MS są przydatne do wskazywania miejsc, w których zmienia się dynamika konformacyjna i do ujawniania sprzężonych zmian konformacyjnych, ale często nie dostarczają zbyt wiele wglądu w dokładny mechanizm molekularny napędzający obserwowaną zmianę. Ostatnie postępy w połączeniu metod dysocjacji wychwytu elektronów z danymi HDX-MS białek okazały się obiecujące dla mapowania miejsc wymiany do reszt pojedynczych aminokwasów19, ale nadal często potrzebne są dalsze badania biochemiczne i strukturalne, aby zapewnić przejrzystość modeli strukturalnych przekazywanych przez dane HDX-MS.
Poniżej przedstawiono szczegółowy protokół rozwoju testu HDX-MS20. Przedstawione poniżej protokoły przygotowania próbek powinny mieć ogólne zastosowanie do każdego białka, które wykazuje dobrą rozpuszczalność w wodnych. Dla białek dostępne są bardziej specjalistyczne metody przygotowania próbek i przepływy pracy HDX-MS, niż te, które muszą być oznaczane w obecności detergentu lub fosfolipidów21,22,23,24. Instrumentalne ustawienia do zbierania danych HDX-MS są opisane dla kwadrupolowego spektrometru masowego czasu przelotu o wysokiej rozdzielczości sprzężonego z systemem chromatografii cieczowej. Dane o podobnej złożoności i rozdzielczości mogą być gromadzone w każdym z wielu dostępnych na rynku systemów chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS). Przedstawiono również kluczowe aspekty przetwarzania danych za pomocą dostępnego na rynku pakietu oprogramowania. Przedstawiamy również wytyczne dotyczące zbierania i analizy danych, które są zgodne z zaleceniami szerszej społeczności HDX-MS12. Opisany protokół służy do badania dynamicznych właściwości strukturalnych HalM2, syntetazy lantipeptydu, która katalizuje wieloetapowe dojrzewanie naturalnego produktu peptydu przeciwdrobnoustrojowego20. Pokazujemy, w jaki sposób HDX-MS może być wykorzystany do ujawnienia miejsc wiązania substratu i właściwości allosterycznych, które wymknęły się wcześniejszej charakterystyce. W ostatnich latach opublikowano kilka innych protokołów dotyczących białka HDX-MS25,26. Wraz z niniejszą pracą, te wcześniejsze wkłady powinny zapewnić czytelnikowi pewną elastyczność w projektowaniu eksperymentalnym.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>[glu-1]-fibrynopeptyd B (Glu-Fib)</td><td>BioBasic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Urządzenie do filtracji odśrodkowej Amicon Ultracel 10k (Millipore)</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>acetonitryl</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>SIGMA</td><td>a2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>ALDRICH</td><td>435767-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>guanidyna-HCl</td><td>VWR</td><td>97063-764</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>SiGMA-Aldrich</td><td>63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>potasuBioBasic</td><td>PB0440</td><td></td></tr><tr><td>fosforan potasu</td><td>BioBasic</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Chlorowodorek</td><td>TRC Canada</td><td>T012500</td><td>peptyd został zsyntetyzowany na żądanie</td></tr><tr><td>Nazwa materiału<</td><td>strong>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi/Opis</td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deuteros</td><td>Andy M C Lau, et al</td><td>wersja 1.08</td><td></td></tr><tr><td>DynamX</td><td>Waters</td><td>wersja 3.0</td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters</td><td>wersja 4.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lynx Global Server (PLGS)</td><td>Waters</td><td>wersja 3.0.3</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml; dinger</td><td>wersja 2.2.2</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa materiału</Wyposażenie/strong></td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze/Opis</td></tr><tr><td>Przyrząd i wyposażenie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18 analityczny Wody kolumnowe</td><td></td><td>186002346</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Wody przedkolumnowe</td><td></td><td>186003978</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class HDX System</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX Manager</td><td>Waters</td> mikrokońcówka Elektroda <td></td><td></td></tr><tr><td>pH</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-620-291</td><td></td></tr><tr><td>Waters Enzymat Kolumna BEH lub solumn pepsyny</td><td>Wody</td><td>186007233</td><td></td></tr><tr><td>Wody Synapt Wody</td><td></td><td></td><td></td> G2-Si</tr></tbody></table>

platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (hdx-ms) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Spektrometria mas wymiany wodorowo-deuterowej (HDX-MS) jest potężną metodą biofizycznej charakterystyki zmian konformacyjnych enzymów i interakcji enzym-substrat. Wśród wielu zalet HDX-MS jest to, że zużywa tylko niewielkie ilości materiału, może być wykonywany w warunkach zbliżonych do natywnych bez konieczności znakowania enzymów/substratów i może dostarczyć przestrzennie rozdzielczych informacji na temat dynamiki konformacji enzymów - nawet w przypadku dużych enzymów i kompleksów wielobiałkowych. Metodę rozpoczyna się od rozcieńczenia enzymu będącego przedmiotem zainteresowania w buforze przygotowanym wD2O. Powoduje to wymianę protu w amidach wiązań peptydowych (N-H) z deuterem (N-D). W pożądanych punktach czasowych wymiany podwielokrotności reakcji są hartowane, enzym jest proteolizowany do peptydów, peptydy są rozdzielane za pomocą ultra-sprawnej chromatografii cieczowej (UPLC), a zmiana masy każdego peptydu (w wyniku wymiany wodoru na deuter) jest rejestrowana przez MS. Ilość wychwytu deuteru przez każdy peptyd jest silnie zależna od lokalnego środowiska wiązań wodorowych tego peptydu. Peptydy obecne w bardzo dynamicznych regionach enzymu bardzo szybko wymieniają deuter, podczas gdy peptydy pochodzące z dobrze uporządkowanych regionów ulegają wymianie znacznie wolniej. W ten sposób wskaźnik HDX informuje o lokalnej dynamice konformacyjnej enzymów. Zaburzenia poziomów wychwytu deuteru w obecności różnych ligandów można następnie wykorzystać do mapowania miejsc wiązania ligandów, identyfikacji sieci allosterycznych i zrozumienia roli dynamiki konformacyjnej w funkcji enzymu. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy HDX-MS, aby lepiej zrozumieć biosyntezę rodzaju naturalnych produktów peptydowych zwanych lantipeptydami. Lantipeptydy to genetycznie kodowane peptydy, które są modyfikowane potranslacyjnie przez duże, wielofunkcyjne, konformacyjnie dynamiczne enzymy, które są trudne do zbadania za pomocą tradycyjnych podejść biologii strukturalnej. HDX-MS stanowi idealną i adaptowalną platformę do badania właściwości mechanistycznych tego typu enzymów.

Konieczna jest ocena jakości trawienia proteolitycznego oraz powtarzalności procedury dla każdego zestawu wstrzykiwanych próbek. Dlatego przed przeprowadzeniem analiz HDX-MS niezbędne jest ustalenie optymalnych warunków proteolizy badanego białka, rozdziału peptydów przy użyciu chromatografii cieczowej w fazie odwróconej i mobilności jonowej w fazie gazowej oraz detekcji peptydów za pomocą MS. W tym celu w pierwszej kolejności należy zbadać próbki referencyjne badanego białka (pobrane w obecności deuteru) (sekcja 3). Dan...

Syntetazy lantipeptydu katalizują wieloetapowe reakcje podczas biosyntezy naturalnych produktów peptydowych. W tym miejscu opisujemy ciągły, oddolny przepływ pracy spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS), który można wykorzystać do badania dynamiki konformacyjnej syntetaz lantipeptydów, a także innych podobnych enzymów zaangażowanych w biosyntezę naturalnych produktów peptydowych.

Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Protokół ten może dostarczyć specjalnie rozwiązanych informacji na temat dynamiki konformacji białek. Co może pomóc w identyfikacji funkcjonalnie ważnych regionów w białku będącym przedmiotem zainteresowania. Technika ta bada dynamikę konformacyjną białek w warunkach zbliżonych do natywnych.Bez konieczności znakowania białek przy użyciu nanomolowej ilości materiału dla każdej reakcji. Rozpocznij od przygotowania niedeuterowanych próbek referencyjnych dla białka będącego przedmiotem zainteresowania w trzech egzemplarzach, w probówkach o pojemności 500 mikrolitrów. Stłumić próbki odpowiednią objętością buforu hartującego na probówkę, aby uzyskać odczyt pH-metru 2,5.Próbki należy błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie w celu przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu ich analizy. Następnie należy przeanalizować próbki referencyjne sproszkowanych enzymów przy użyciu przepływu pracy spektrometrii mas chromatografii cieczowej od dołu do góry zgodnie ze standardowymi protokołami. Analiza surowych danych spektrometrii mas w odpowiednim oprogramowaniu proteomicznym.Przejdź do bibliotek i baz danych sekwencji białek, aby zaimportować sekwencję aminokwasów interesującego Cię białka. Wprowadź nazwę interesującej Cię sekwencji białka i zaimportuj sekwencję białka w formacie FASTA. Aby zdefiniować parametry przetwarzania w menu Biblioteka, wybierz Electrospray MSE jako typ akwizycji danych.W polu Zablokuj masę dla ładunku 2 wprowadź 785.8426 dla współczynnika ładunku głównego dla dwóch plus jon glukanu jedno włókno bez peptydu B i kliknij przycisk Zakończ. Aby zdefiniować parametry przepływu pracy, wybierz Electrospray MSE jako typ wyszukiwania. Pod nagłówkiem Kwerenda wyszukiwania w przepływie pracy i bazie danych wybierz białko bazy danych utworzone w polu Baza danych i zmień podstawowy odczynnik skrótu na niespecyficzny.Aby wyczyścić pole odczynnika o stałym modyfikatorze, przytrzymaj przycisk kontrolny podczas klikania Carbamidomethyl C.To określić katalog wyjściowy, wybierz Opcje, Ustawienia automatyzacji i Identyfikuj E. Następnie sprawdź pola wyjściowe wierzchołka 3D i peptydu 3D oraz wyjścia rozliczania jonów. I określ żądany katalog. Aby przetworzyć przywołane dane próbki, kliknij prawym przyciskiem myszy płytkę mikromiareczkowania, aby utworzyć nową płytkę.Kliknij lewym przyciskiem myszy w jednym dołku i przeciągnij do trzech innych studzienek, aby podświetlić jedno dołek dla każdej próbki, do której się odwołuje. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Dodaj surowe dane. W oknie przejdź do katalogu zawierającego trzy pliki, do których się odwołuje, i wybierz wszystkie trzy pliki w tym samym czasie.Kliknij przycisk Dalej i wybierz zdefiniowane parametry przetwarzania. Kliknij ponownie przycisk Dalej i wybierz zdefiniowane parametry przepływu pracy. Następnie kliknij przycisk Zakończ.Po przypisaniu surowych danych, parametrów przetwarzania i parametrów przepływu pracy do każdego dołka na płycie, dołki zmienią kolor na niebieski. Wybierz dołki, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Przetwarzaj najnowsze dane surowe. Aby śledzić przetwarzanie danych, kliknij prawy dolny róg okna.Jeśli nie pojawi się żadne zadanie do uruchomienia, przetwarzanie jest zakończone, a dołki w płytce mikromiareczkowania zmienią kolor na zielony. Kliknij prawym przyciskiem myszy dołki i wybierz opcję Wyświetl wyniki przepływu pracy. Dla każdego pliku danych, do którego się odwołuje, otworzy się osobne okno.Należy sprawdzić dane, aby upewnić się, że większość sygnałów spektrometrii mas w danych próbki odniesienia została pomyślnie zmapowana do peptydów przewidywanych na podstawie trawienia in silico białka będącego przedmiotem zainteresowania. Dopasowane peptydy pojawią się na niebiesko w widmie wyjściowym. Kliknij dwukrotnie filtr OK i sprawdź, czy procentowe pokrycie jest większe niż 99%Zaimportuj dane wyjściowe oprogramowania proteomicznego do oprogramowania do przetwarzania wymiany wodoru i deuteru w celu dodatkowego progowania.I kliknij Dane i zaimportuj wyniki PLGS. Kliknij ikonę Dodaj i przejdź do odpowiedniego katalogu, aby wybrać przetworzone pliki danych. Kliknij przycisk Dalej i ustaw minimalną liczbę kolejnych jonów na większą lub równą dwie.Błąd masy do pięciu części na milion. I próg pliku do trzech, a następnie kliknij przycisk Zakończ. Aby przeprowadzić reakcje wymiany wodorowo-deuterowej, podwielokrotny bufor hartowniczy w probówkach o pojemności 500 mikrolitrów.I krótko odwirować, aby przenieść cały bufor hartowniczy na dno każdej probówki. Umieścić probówki z roztworem hartowanym na lodzie. Następnie wymieszaj wszystkie zdeuterowane składniki reakcji w osobnej probówce o pojemności 1,5 mililitra.Następnie przenieś mieszaninę reakcyjną do łaźni wodnej o temperaturze 25 stopni Celsjusza na 10-minutową inkubację. Dodaj enzym do zdeuterowanych składników reakcji, aby zainicjować reakcję wymiany. Dokładnie wymieszać zawartość reakcji, pipetując w górę i w dół.W odpowiednich eksperymentalnych punktach czasowych wymiany usunąć 50 mikrolitrów podwielokrotności z każdej reakcji wymiany wodorowo-deuterowej. I szybko i równomiernie wymieszać reakcje z jedną porcją lodowatego buforu hartowniczego w pojedynczych probówkach o pojemności 500 mikrolitrów. Następnie natychmiast zakryj probówki do błyskawicznego zamrażania w ciekłym azocie.Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu, gdy będą gotowe do analizy. Po rozmrożeniu zamrożonych próbek należy przeanalizować próbki referencyjne deuterowanego enzymu przy użyciu tego samego przepływu pracy chromatografii cieczowej z oddolną chromatografią cieczową, który został opracowany dla niedeuterowanych próbek referencyjnych. Po zebraniu danych LCMS dla próbek deuterowanych, należy zaimportować dane do wcześniej utworzonego projektu wymiany wodorowo-deuterowej w celu przetworzenia danych.Kliknij Nowy stan i Nowa ekspozycja, aby zdefiniować stany biochemiczne i czasy ekspozycji na deuter odpowiednio istotne dla analizy. Kliknij przycisk New Raw (Nowy surowiec), aby wybrać pliki danych wymiany wodoru i deuteru do analizy. I przypisz odpowiednie czasy wymiany i stan biochemiczny do każdego importowanego pliku danych surowych.W celu analizy i wizualizacji danych wybierz pierwszy peptyd z listy Peptydów i otwórz skumulowany wykres spektralny z menu Widoki. Kliknij myszą, aby przypisać i cofnąć przypisanie patyczków zgodnie z potrzebami, aby upewnić się, że w danych znajduje się prawidłowy rozkład izotopów. I że każdy pik izotopowy został przypisany.Aby sprawdzić przypisania drążków dla każdego stanu naładowania, przełącz stan naładowania w górnej części okna wykresu widmowego. Aby sprawdzić odchylenie standardowe wartości wychwytu peptydu deuteru w menu Widoki, wybierz mapę pokrycia. Który wyświetla każdy peptyd na liście peptydów zmapowany wzdłuż sekwencji aminokwasów interesującego białka.Pokoloruj peptydy zgodnie ze względnym odchyleniem standardowym i wizualnie wyszukaj na mapie peptydy odstające o wysokim względnym odchyleniu standardowym. Kliknij peptydy odstające na mapie pokrycia, aby wypełnić skumulowane wykresy spektralne i okno przeglądarki danych peptydem docelowym. Wyświetl różnicę interesów na mapie pokrycia i kliknij prawym przyciskiem myszy mapę, aby wyeksportować dane o różnicy do pliku CSV.Zaimportuj dane o różnicach i stanach oraz plik PDB interesującego Cię białka do Deuteros. Następnie wybierz 99% przedział ufności i włącz sumę i przetwórz dane. Następnie w obszarze pi mol wybierz opcję Eksportuj, Wychwyt i Eksport, aby wygenerować skrypt PyMOL w celu odwzorowania regionów o znaczącej różnicy wymiany na strukturę PDB białka będącego przedmiotem zainteresowania w oprogramowaniu PyMOL.Te reprezentatywne chromatogramy jonów całkowitych dla trzech próbek referencyjnych syntetazy peptydu lambda Hal-M2 pokazują zależne od czasu zmiany sumy wszystkich liczb jonów przy wszystkich wartościach stosunku masy do ładunku zawartych w skanowaniu widma masowego. Kształt i intensywność profilu chromatogramu jonów całkowitych powinny być podobne. Wskazuje to, że trawienie proteolityczne Hal-M2 jest powtarzalne.I ma podobną skuteczność we wszystkich trzech próbkach referencyjnych. Widma masowe w danym przedziale czasowym również powinny być podobne. Daje to pewność, że podobne peptydy są obecne w każdej próbce i nawiązują w podobnym czasie do kolumny C18.Większość peptydów w próbkach wymienianych deuterem powinna wykazywać oczywiste przesunięcia w rozkładach izotopowych w kierunku wyższych wartości stosunku masy do ładunku. Na przykład dane te wskazują, że znaczna część znacznika deuteru była utrzymywana przez cały czas trwania procesu wygaszania kwasem, trawienia pepsyny i zbierania danych ze spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej. Po scharakteryzowaniu właściwości biochemicznych enzymu, jak wykazano, można uzyskać reprezentatywne wyniki spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej, takie jak te.Aby zilustrować wiązanie peptydu prekursorowego Hal-A2 z kompleksem Hal-M2 AMP, PMP. Reakcje wymiany wodorowo-deuterowej muszą być przygotowywane i gaszone w spójny sposób. I musisz być metodyczny przy określaniu wartości wymiany deuteru dla wielu wykrytych peptydów.Spektrometria mas wymiany wodorowo-deuterowej dostarcza informacji na poziomie peptydów i dynamicznych zmian konformacyjnych białek. Funkcjonalne znaczenie każdej wymiany wodorowo-deuterowej powinno zostać zweryfikowane dla Meter Genesis. I ortogonalne testy aktywności.

a-hydrogen-deuterium-exchange-mass-spectrometry-hdx-ms-platform-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Spektrometria mas MALDI-TOF została z powodzeniem wykorzystana do monitorowania wymiany wodoru/deuteru w wiązaniach amidowych podczas aktywacji kinazy białkowej Pak2.

Analiza aktywacji Pak2 za pomocą wymiany wodoru na deuter w wiązaniach amidowych oraz spektrometrii mas MALDI-TOF

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły dla spektrometrii mas z wymianą amidu i deuteru w stanie stałym (ssHDX-MS) oraz spektrometrii mas znakowania fotolitycznego w stanie stałym (ssPL-MS) dla białek w stałych proszkach. Metody te dostarczają informacji o wysokiej rozdzielczości na temat konformacji i oddziaływań białek w amorficznym stanie stałym, które mogą być przydatne w projektowaniu preparatów.

Podejścia spektrometrii mas do badania struktury i interakcji białek w liofilizowanych proszkach

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Jednym z najtrudniejszych warunków stresowych, z jakimi organizmy spotykają się w ciągu swojego życia, jest akumulacja utleniaczy. Podczas stresu oksydacyjnego komórki w dużym stopniu polegają na molekularnych białkach opiekuńczych. W tym miejscu przedstawiono metody wykorzystywane do badania regulowanej przez redoks aktywności antyagregacyjnej, a także do monitorowania zmian strukturalnych regulujących funkcję opiekuńczą za pomocą HDX-MS.

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Prezentowany tutaj jest protokół metody wymiany wodoru i deuteru (HDX) opartej na elektroforezie kapilarnej w połączeniu ze spektrometrią mas z góry na dół. Podejście to charakteryzuje różnicę w strukturach wyższego rzędu między różnymi gatunkami białek, w tym białkami w różnych stanach i różnymi proteoformami, poprzez prowadzenie jednoczesnej różnicowej separacji HDX i elektroforetycznej.

Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

Strukturalny zespół monomerycznej alfa-synukleiny wpływa na jej fizjologiczne funkcje i właściwości fizykochemiczne. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzić spektrometrię mas z wymianą milisekundową wodór/deuter i późniejsze analizy danych w celu określenia informacji konformacyjnych na monomerze tego wewnętrznie nieuporządkowanego białka w warunkach fizjologicznych.

Spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

Poznaj metodę HDX-MS do badania dynamiki konformacyjnej syntetaz lantypeptydowych. Ta technika umożliwia identyfikację kluczowych regionów enzymów w warunkach zbliżonych do natywnych bez konieczności etykietowania białek.

Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych

Przeglądaj więcej filmów