Name: Test oparty na elektrochemiluminescencji dla wariantów białka MeCP2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj metodę ECLIA do ilościowego oznaczania wariantów białka MeCP2 w formacie 96-well. Ta technika oferuje wyższą czułość i powtarzalność niż tradycyjne Western blot, wspierając badania neurobiologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy bardzo wdzięczni dr Brigitte Sturm za jej wsparcie przy użyciu instrumentu ECLIA.

Zgoda na pobieranie biopsji skóry do celów badawczych została uzyskana od Komitetu Etyki Badań Klinicznych Szpitala Dziecięcego w Westmead, Australia. Austriackie Federalne Ministerstwo Nauki, Badań Naukowych i Gospodarki uzyskało zgodę na przeprowadzanie doświadczeń na zwierzętach, które zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
UWAGA: Zasada działania systemu ECLIA jest przedstawiona w Rysunek 1.
1. Wybór przeciwciał
<ol>
	<li>Oceń stosunek sygnału do szumu dla szeregu różnych przeciwciał MeCP2 i zidentyfikuj najlepszą siłę sygnału i najwyższą swoistość w połączeniu pierwotnego mysiego przeciwciała monoklonalnego MeCP2 (klon Mec-168) i króliczego poliklonalnego przeciwciała wykrywającego MeCP2 (wykonane na zamówienie). W przypadku przeciwciała drugorzędowego należy użyć przeciwciała swoistego dla układu (tabela materiałów), które również zostało zweryfikowane doświadczalnie. 
	UWAGA: Tabela 1 zawiera przegląd wszystkich zweryfikowanych przeciwciał podczas opracowywania MeCP2-ECLIA oraz ich testowanych zakresów rozcieńczenia.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>funkcja</td>
			<td>nazwa</td>
			<td>klon</td>
			<td>Rozcieńczeniu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>podstawowy</td>
			<td>Mysz anty-MeCP2</td>
			<td>Zobacz materiał MEC-168</td>
			<td>1:500−1:10 000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>podstawowy</td>
			<td>Mysz anty-MeCP2</td>
			<td>Pozycja 4B6</td>
			<td>1:250−1:4,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>podstawowy</td>
			<td>Mysz anty-MeCP2</td>
			<td>Mężczyźni-8</td>
			<td>1:500−1:4,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>podstawowy</td>
			<td>Mysz anty-MeCP2</td>
			<td>pozycji 1B11</td>
			<td>1:500−1:4,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>podstawowy</td>
			<td>Królik, anty-MeCP2</td>
			<td>D4F3</td>
			<td>1:500−1:4,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wtórny</td>
			<td>Królik, anty-MeCP2</td>
			<td>poliklonalny</td>
			<td>1:2 000−1:20 000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wtórny</td>
			<td>Królik, anty-MeCP2</td>
			<td>poliklonalny</td>
			<td>1:2 000−1:20 000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wykrywanie</td>
			<td>SULFO-TAG oznaczony anty-królikiem</td>
			<td>poliklonalny</td>
			<td>1:500−1:1,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista przeciwciał i użytych rozcieńczeń roboczych.
<ol start="2">
	<li>Alternatywnie, użyj każdej pary przeciwciał MeCP2, która dobrze współpracuje z konwencjonalnym testem ELISA.</li>
</ol>
2. Leczenie HDF białkiem fuzyjnym TAT-MeCP2
UWAGA: TAT-MeCP2 był rekombinowany w Escherichia coli i oczyszczany przy użyciu standardowych technik chromatograficznych, jak wcześniej opisano8 i przechowywany w temperaturze -80 °C.
<ol>
	<li>Umieść 1 x 106 ludzkich komórek fibroblastów skórnych (HDF) na 100 mm szalkach i hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aż osiągną około 90% zbieżności.</li>
	<li>Wyjąć jedną fiolkę z białkiem fuzyjnym TAT-MeCP2. Rozmrozić na lodzie i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Rozcieńczyć TAT-MeCP2 do końcowego stężenia 500 nM w 50 ml pożywki hodowlanej HDF.</li>
	<li>Wyjąć pożywkę z szalek o średnicy 100 mm i inkubować komórki z 500 nM TAT-MeCP2 w temperaturze 37 °C przez różne okresy inkubacji do 24 godzin.</li>
	<li>Usunąć roztwór TAT-MeCP2 z komórek. Umyj komórki 2x wstępnie podgrzaną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.</li>
	<li>Potraktuj komórki 2 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C10.</li>
	<li>Dodaj 6 ml pożywki hodowlanej HDF, aby dezaktywować trypsynę i zebrać komórki w probówkach o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń supernatant i umyj komórki 2x lodowatym DPBS. Przechowuj granulki na lodzie i przystąp do przygotowania próbki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Lizaty HDF
	<ol>
		<li>Określ najwyższe poziomy białka MeCP2 za pomocą metody REAP do subkomórkowego frakcjonowania do cytoplazmatycznych i jądrowych przedziałów subkomórkowych zgodnie z Suzuki et al.11. Ogranicz frakcjonowanie do nie więcej niż sześciu próbek na eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lizaty mózgu myszy
	<ol>
		<li>Przygotować 100 ml każdego hipotonicznego odczynnika do lizy i buforu ekstrakcyjnego.
		<ol>
			<li>W przypadku odczynnika do lizy hipotonicznej dobrze wymieszaj 10 mM HEPES, 1,5 mM chlorku magnezu i 10 mM chlorku potasu.</li>
			<li>W celu uzyskania buforu ekstrakcyjnego dobrze wymieszaj 20 mM HEPES, 1,5 mM chlorku magnezu, 0,42 M chlorku sodu, 0,2 mM EDTA i 25% (v/v) glicerolu.</li>
			<li>Dostosować pH obu do 7,9.</li>
			<li>Dodaj 1 mM ditiotreitol (DTT) i 1x koktajl inhibitorów proteazy do obu na świeżo. Przed użyciem schłodzić na lodzie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zawiesić 100 mg całkowitego mózgu myszy (szczep: C57BL/6J, samiec i samica typu dzikiego oraz B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygotyczny samiec i heterozygotyczna samica; wiek: 4−8 tygodni) w 1 ml lodowatego hipotonicznego odczynnika do lizy</li>.
		<li>Homogenizuj mózg za pomocą wstępnie schłodzonego, całkowicie szklanego homogenizatora tkankowego Dounce za pomocą 15 pociągnięć homogenizatora A (luźny, dla dużego klirensu) i B (ciasny, dla małego prześwitu).</li>
		<li>Przenieść homogenizowane komórki do czystej probówki i odwirować przy 10 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant (lub zachować go jako frakcję cytoplazmatyczną do dalszego wykorzystania).</li>
		<li>Zawiesić osad w 140 μl buforu ekstrakcyjnego na 100 mg materiału wyjściowego. Umieścić probówkę we wstępnie schłodzonym termobloku i delikatnie mieszać przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwirować probówkę o masie 16 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant (tj. frakcję jądrową) do nowej, wstępnie schłodzonej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia><.
		UWAGA: Stężenie białek w lizatach pochodzących z mózgu myszy i HDF można ocenić za pomocą testu białka BCA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Protokół MeCP2-ECLIA
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu myjącego, buforu blokującego i roztworu rozcieńczalnika do oznaczania (dzień 1)
	<ol>
		<li>Dodaj 500 μL Tween 20 do 1 L PBS, aby przygotować 0,05% roztwór Tween 20 in PBS, energicznie wymieszaj i oznacz jako "roztwór myjący". 
		UWAGA: Upewnij się, że używany jest tylko świeżo przygotowany bufor myjący.</li>
		<li>Przygotować roztwór blokujący 3% blokera A (tabela materiałów) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Wymieszaj delikatnie mieszając, przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w lodówce do czasu użycia przez maksymalnie dwa tygodnie.</li>
		<li>Dodać 5 ml roztworu blokującego do 10 ml PBS, aby przygotować roztwór rozcieńczalnika do oznaczania (1% bloker A w PBS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powlekanie płyt o wysokim stopniu wiązania
	<ol>
		<li>Wyjmij 96-dołkową, wielomacierzową płytkę z pojedynczym miejscem wiązania. 
		UWAGA: Płyty o wysokim wiązaniu mają większą zdolność wiązania, a tym samym większy zakres dynamiki niż standardowe płyty z powierzchniami hydrofobowymi.</li>
		<li>Rozmrozić mysie przeciwciało monoklonalne anty-MeCP2 na lodzie i zmieszać 0,67 μl przeciwciała z 4 ml PBS (rozcieńczenie przeciwciała 1:6 000 w PBS). Zmieszaj roztwór przeciwciała, aby dobrze wymieszał i oznacz probówkę jako "roztwór powlekający".</li>
		<li>Ostrożnie dozować 25 μl roztworu powlekającego w dolnym rogu każdej studzienki za pomocą pipetora wielokanałowego; nazywa się to metodą powlekania roztworem. Delikatnie postukaj w 96-dołkową płytkę z każdej strony, aby upewnić się, że roztwór powlekający pokrywa dno każdej studzienki.</li>
		<li>Uszczelnić płytkę folią samoprzylepną i inkubować płytkę w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc (12−16 godzin).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie (dzień 2)
	<ol>
		<li>Wyjmij talerz z lodówki i zdejmij folię.</li>
		<li>Usuń roztwór powlekający przeciwciało, wrzucając go do kosza na śmieci i postukaj płytką o ręcznik papierowy, aby usunąć cały roztwór powlekający z dołków.</li>
		<li>Dodać 125 μl roztworu blokującego do studzienki. Ponownie uszczelnij płytkę i umieść ją na orbitalnej wytrząsarce do mikropłytek.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 90 minut w temperaturze pokojowej ze stałym wytrząsaniem przy 800 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wzorców i próbek
	<ol>
		<li>W czasie inkubacji należy przygotować wzorce białkowe MeCP2 i/lub TAT-MeCP2 oraz różne próbki. 
		UWAGA: Bufor do lizy stosowany do rozcieńczania standardowego musi być taki sam, jak stosowany w analizowanych próbkach.</li>
		<li>Wyjąć jedną fiolkę z roztworem podstawowym białka MePC2 i/lub TAT-MeCP2 (250 μg/ml), lizatami mózgu myszy i lizatami HDF w temperaturze od -80 °C. Rozmrozić je na lodzie.</li>
		<li>Rozcieńczyć wzorcowy roztwór podstawowy (MeCP2 i/lub TAT-MeCP2) w czystych probówkach zgodnie z tabelą 2.</li>
		<li>Rozcieńczyć próbki w buforze do lizy w następujący sposób: 1−20 μg lizatu mózgu myszy na 25 μl buforu do lizy i 0,25−1 μg lizatu HDF na 25 μl buforu do lizy. Przygotować objętość każdej próbki wystarczającą do przeprowadzenia analizy w trzech egzemplarzach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>norma</td>
			<td>koncentracja</td>
			<td>Rozcieńczeniu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norma 1</td>
			<td>1 800 ng/ml</td>
			<td>1,08 μl wzorcowego roztworu podstawowego + 148,92 μl buforu do lizy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standardowy 2</td>
			<td>600 ng/ml</td>
			<td>50 μL Standard 1 + 100 μL Bufor do lizy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norma 3</td>
			<td>200 ng/ml</td>
			<td>50 μL Standard 2 + 100 μL Bufor do lizy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standardowy 4</td>
			<td>66,67 ng/ml</td>
			<td>50 μL Standard 3 + 100 μL Bufor do lizy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standardowy 5</td>
			<td>22,22 ng/ml</td>
			<td>50 μL Standard 4 + 100 μL Bufor do lizy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standardowy 6</td>
			<td>7,41 ng/ml</td>
			<td>50 μL Standard 5 + 100 μL Bufor do lizy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standardowy 7</td>
			<td>2,47 ng/ml</td>
			<td>50 μL Standard 6 + 100 μL Bufor do lizy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standardowy 8</td>
			<td>0,82 ng/ml</td>
			<td>50 μL Standard 7 + 100 μL Bufor do lizy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standardowy 9</td>
			<td>0,27 ng/ml</td>
			<td>50 μL Standard 8 + 100 μL Bufor do lizy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standardowy 10</td>
			<td>0 ng/ml</td>
			<td>150 μl Bufor do lizy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Standardowe serie od 0 do 1,800 ng/ml.
<ol start="5">
	<li>Dodawanie próbek i roztworów wzorcowych
	<ol>
		<li>Usuń roztwór blokujący, wrzucając go do kosza na śmieci i postukaj talerzem o ręcznik papierowy, aby usunąć cały roztwór blokujący z dołków.</li>
		<li>Umyj płytkę 3x 150 μL roztworu myjącego, dodając roztwór myjący i natychmiast go usuwając.</li>
		<li>Dodaj 25 μl wzorców i próbek do dolnego rogu studzienki za pomocą pipety jednokanałowej.</li>
		<li>Uszczelnić płytkę i inkubować ją przez 4 godziny w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając przy 800 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nieznakowane przeciwciało wykrywające
	<ol>
		<li>Rozmrozić poliklonalne królicze przeciwciało anty-MeCP2 na lodzie. Rozcieńczyć przeciwciało w stosunku 1:6 000 w roztworze rozcieńczalnika do oznaczania.</li>
		<li>Wyjmij wzorce i próbki, wrzucając je do kosza na śmieci i postukając talerzem o ręcznik papierowy.</li>
		<li>Umyj płytkę 3x 150 μL roztworu myjącego, dodając roztwór myjący i natychmiast go usuwając.</li>
		<li>Dodać 25 μl nieznakowanego przeciwciała detekcyjnego do każdej studzienki za pomocą pipetora wielokanałowego. Uszczelnić płytkę i inkubować ją przez 1 godzinę z ciągłym wstrząsaniem przy 800 obr./min w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Swoiste przeciwciało sprzężone
	<ol>
		<li>Wyjmij określone przeciwciało drugorzędowe (tabela materiałów) z lodówki i umieść je na lodzie. Rozcieńczyć przeciwciało w stosunku 1:666.67 w roztworze rozcieńczalnika do oznaczania i delikatnie wymieszać.</li>
		<li>Usuń wolne, nieoznakowane przeciwciało drugorzędowe, wrzucając je do kosza na śmieci i postukając w płytkę o ręcznik papierowy.</li>
		<li>Umyj płytkę 3x 150 μL roztworu myjącego, dodając roztwór myjący i natychmiast go usuwając.</li>
		<li>Dodać 25 μl specyficznego sprzężonego przeciwciała (tabela materiałów) do każdej studzienki za pomocą pipetora wielokanałowego. Uszczelnić płytkę i inkubować przez 1 godzinę z ciągłym wytrząsaniem przy 800 obr./min w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczytywanie tabliczki
	<ol>
		<li>Usuń wolne sprzężone przeciwciało (tabela materiałów), wrzucając je do kosza na śmieci i postukając płytką o ręcznik papierowy.</li>
		<li>Umyj płytkę 3x 150 μL roztworu myjącego.</li>
		<li>Dodaj 150 μl 1x bufor do odczytu złota na bazie Tris (tabela materiałów) ze środkiem powierzchniowo czynnym zawierającym tripropyloaminę jako koreagent do wytwarzania światła do płytki. Należy unikać pęcherzyków powietrza, stosując techniki pipetowania wstecznego.</li>
		<li>Umieść płytkę na platformie do wykrywania mikropłytek (Tabela materiałów) i natychmiast rozpocznij pomiar. Użyj ustawień do akwizycji płytki 96-dołkowej.</li>
		<li>Przechwytywanie sygnałów elektrochemiluminescencyjnych przez wbudowaną kamerę CCD w systemie detekcji elektrochemiluminescencji (Tabela materiałów) i rejestrowanie liczby sygnałów, które odpowiadają względnym jednostkom światła (RLU) i są wprost proporcjonalne do natężenia światła. 
		UWAGA: Po stymulacji elektrochemicznej etykieta rutenu związana z elektrodą węglową emituje światło luminescencyjne o długości fali 620 nm. Analizuj dane za pomocą oprogramowania dołączonego do przyrządu (tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDebad%2C+JD+%22Electrogenerated+Chemiluminescence%22">Electrogenerated Chemiluminescence</a>. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).</li>
<li>Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+Electrochemiluminescence+Immunoassay+Using+the+Ruthenium+Chelate-Labeled+Antibody+Bound+on+the+Magnetic+Micro+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads.</a> Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).</li>
<li>Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+immunoassays+for+quantification+of+hepatitis+B+surface+antigen+in+Chinese+patients+with+concomitant+hepatitis+B+surface+antigen+and+hepatitis+B+surface+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies.</a> Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).</li>
<li>Shah, R. R., Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeCP2+mutations%3A+progress+towards+understanding+and+treating+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome.</a> Genome Medicine. 9 (1), 17(2017).</li>
<li>Chahrour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeCP2%2C+a+key+contributor+to+neurological+disease%2C+activates+and+represses+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription.</a> Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).</li>
<li>Lyst, M. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome%3A+a+complex+disorder+with+simple+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome: a complex disorder with simple roots.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).</li>
<li>Katz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+Syndrome%3A+Crossing+the+Threshold+to+Clinical+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation.</a> Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).</li>
<li>Steinkellner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrochemiluminescence+based+assay+for+quantitative+detection+of+endogenous+and+exogenously+applied+MeCP2+protein+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7929(2019).</li>
<li>Laccone, F. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLaccone%2C+FA+%22Synthetic+MeCP2+sequence+for+protein+substitution+therapy%22">Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy</a>. , Canada. CA2647125C (2007).</li>
<li>Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+and+uptake+of+TAT-fusion+proteins+produced+by+engineered+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).</li>
<li>Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REAP%3A+A+two+minute+cell+fractionation+method%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">REAP: A two minute cell fractionation method.</a> BMC Research Notes. 3, 294(2010).</li>
<li>Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV+Tat+protein+transduction+domain+improves+the+biodistribution+of+beta-glucuronidase+expressed+from+recombinant+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors.</a> Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).</li>
<li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+transduction%3A+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li>
<li>Nagahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+full-length+TAT+fusion+proteins+into+mammalian+cells%3A+TAT-p27Kip1+induces+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration.</a> Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).</li>
<li>Trazzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDKL5+protein+substitution+therapy+rescues+neurological+phenotypes+of+a+mouse+model+of+CDKL5+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder.</a> Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).</li>
<li>Van Esch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MECP2+Duplication+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Syndromology%22%5BJournal%5D)">MECP2 Duplication Syndrome.</a> Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).</li>
<li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li>
<li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby zmierzyć endogenne poziomy MeCP2, rekombinowanego MeCP2 i TAT-MeCP2, opracowano 96-dołkową płytkę ECLIA. Wykazano, że utrata funkcji białka MeCP2 prowadzi do zespołu RTT6, w przypadku którego leczenie jest obecnie ograniczone do leczenia objawów i fizjoterapii. Jedną z obiecujących metod leczenia jest tak zwana terapia zastępcza białkami, w której poziom MeCP2 może być miareczkowany do wymaganego stężenia 12,13,14,15.<sup cl...

Test immunologiczny elektrochemiluminescencji (ECLIA) opiera się na procesie, który wykorzystuje etykiety zaprojektowane do emitowania luminescencji podczas stymulacji elektrochemicznej. Jest to technika o szerokim zastosowaniu do ilościowego wykrywania analitów biologicznych w przemyśle podstawowym i badaniach akademickich, przemyśle spożywczym, a także w diagnostyce klinicznej1. Zwykle stosuje się jednorazową 96-dołkową płytkę z elektrodami z tuszem węglowym. Elektrody te działają jako nośnik fazy stałej dla testu immunologicznego. Przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone ze znacznikiem elektrochemiluminescencyjnym, a po przyłożeniu energii elektrycznej do systemu wyzwalana jest emisja światła znacznika chemicznego. Urządzenie sprzężone z ładunkiem o bardzo niskim poziomie szumów (CCD) rejestruje natężenie światła, które jest wprost proporcjonalne do antygenu związanego z przeciwciałem wychwytującym, co skutkuje kwantyfikacją docelowego analitu próbki2. W porównaniu z testem immunoenzymatycznym (ELISA), ECLIA jest uważana za korzystną, ponieważ oferuje wyższą czułość i odtwarzalność, a także lepszą automatyzację i spójność3.
Tutaj przeanalizowaliśmy poziomy białka wiążącego metylo-CpG 2 (MeCP2) w próbkach ludzkiego i mysiego pochodzenia, a także różne warianty rekombinowanego białka, korzystając z nowo opracowanego systemu ECLIA. MecP2 jest białkiem wiążącym kwasy nukleinowe sprzężonym z chromosomem X, o którym wiadomo, że oddziałuje z metylowanymi sekwencjami DNA. Białko to jest zaangażowane w regulację ekspresji genów4,5. Mutacje powodujące utratę funkcji w genie kodującym to białko są głównymi winowajcami powodującymi zespół Retta (RTT), poważne zaburzenie neurorozwojowe6. Inne zaburzenie związane z MeCP2, zespół duplikacji MECP2, również prowadzi do objawów neurologicznych, które mogą pokrywać się z objawami RTT7. Warto zauważyć, że kobiety są najczęściej dotknięte RTT, podczas gdy mężczyźni są głównie dotknięci zespołem duplikacji MECP26,7.
Te zaburzenia są związane z niewystarczającym lub nadmiernym poziomem MeCP2 odpowiednio w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W związku z tym opcje leczenia RTT, które obejmują zwiększenie poziomu MeCP2 w OUN, musiałyby unikać szkodliwych skutków związanych z nadmiarem MeCP27. Z tego powodu bardzo czuła i dokładna kwantyfikacja poziomów białka MeCP2, dostarczana przez system ECLIA, ma kluczowe znaczenie dla postępu badań nad RTT oraz zespołem duplikacji MECP2. W niniejszej pracy przedstawiono precyzyjne pomiary endogennych i egzogennych poziomów MeCP2 z ludzkich linii komórkowych i próbek tkanek myszy, a także rekombinowanego białka składającego się z ludzkiej izoformy B MeCP2 (znanej również jako izoforma e1) oraz minimalnej N-końcowej domeny transdukcji HIV-TAT (TAT-MeCP2), która ma potencjał do przekraczania bariery krew-mózg8,9.

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td>Odczynnik do lizy hipotonicznej, Bufor ekstrakcyjny</td></tr><tr><td>Bio-Rad Test białkowy Koncentrat odczynnika barwnika</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>500-0006</td><td>Przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>Wykrywanie AB SULFO-TAG oznakowane anty-króliczym</td><td>Mezo Scale Diagnostics</td><td>R32AB-1</td><td></td></tr><tr><td>Środowisko pracy do odkrywania przeciwciał 4.0</td><td>Oprogramowanie</td>do odkrywania <td></td><td>skali Mezo</td></tr><tr><td>DMEM (1X)</td> <td>gibco firmy Life Technologies</td><td>41966-029</td><td>Przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (sterylne)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Przygotowanie próbki, roztwór myjący, roztwór powlekający</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>Bufor ekstrakcyjny</td>EDS</tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>Przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td>Bufor ekstrakcyjny</td></tr><tr><td>do odczytu złota T (1x) ze środkiem powierzchniowo czynnym</td><td>Meso Scale Diagnostyka</td><td>R92TG</td><td>MeCP2 Protokół ECLIA</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Odczynnik do lizy hipotonicznej, Bufor ekstrakcyjny</td></tr><tr><td>Zestaw młynków do tkanek KIMBLE Dounce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>Przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>Wytrząsarka laboratoryjna, ruch kołyszący (niska prędkość)</td><td>GFL</td><td>3014</td><td>Protokół MeCP2 ECLIA</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl*6H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Odczynnik do lizy hipotonicznej, Bufor ekstrakcyjny</td></tr><tr><td>MeCP2 (Human) Rekombinowane białko (P01)</td><td>Abnova Corporation</td><td>H00004204-P01</td><td>Leczenie komórkami</td></tr><tr><td>Pieczęć Microseal B</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>MSB1001</td><td>do uszczelniania płytek</td></tr><tr><td>Monoklonalny anty-MeCP2, produkowany w myszy, klon Mec-168, oczyszczona immunoglobulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td><td>Przeciwciało, roztwór powlekający</td></tr><tr><td>Bloker MSD Diagnostyka</td> w <td>skali mezo Bloker</td><td>R93BA-4</td><td>Imager</td></tr><tr><td>MSD SECTOR Diagnostyka w</td><td>skali mezo</td> 2400 Protokół ECLIA <td>I30AA-0</td><td>MeCP2</td></tr><tr><td>Wielomacierzowa 96-dołkowa płytka</td><td>Diagnostyka w skali mezo</td><td>L15XB-3/L11BX-3</td><td>MeCP2 Protokół ECLIA</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>gibco firmy Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>Poliklonalny anty-MeCP2, wyprodukowany w króliku</td><td>Eurogentec S.A.</td><td>specjalnie zaprojektowane</td><td>przeciwciało</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Merck KGaA</td><td>1049361000</td><td>Odczynnik do lizy hipotonicznej</td></tr><tr><td>Primary AB Mouse, anty-MeCP2 (1B11)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>pierwotne AB Mouse, anty-MeCP2 (4B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne AB Mouse, anty-MeCP2 (Mec-168)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818; RRID:AB_262075</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne AB Mouse, anty-MeCP2 (Men-8)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M7443; RRID:AB_477235</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne AB Rabbit, anty-MeCP2 (D4F3)</td> <td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3456S; RRID:AB_2143849</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy przeciwciał (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8340</td><td>Odczynnik do lizy hipotonicznej, Bufor ekstrakcyjny</td></tr><tr><td>wtórny AB, Królik, anty-MeCP2</td><td>Eurogentec S.A.</td><td>niestandardowe</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Wtórne AB, Królik, anty-MeCP2</td><td>Przeciwciało Merck</td><td>07-013</td><td>Chlorek</td></tr><tr><td>sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>Bufor ekstrakcyjny</td></tr><tr><td>SULFO-TAG Znakowane przeciwciało anty-królicze (koza)</td><td>Diagnostyka w skali mezo Przeciwciało</td><td>W0015528S</td><td></td></tr><tr><td>Białko fuzyjne TAT-MeCP2</td><td>własnej produkcji</td><td></td><td>Leczenie komórkowe</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA 0,25% (1X)</td><td>gibco firmy Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Leczenie komórkowe</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>Roztwór myjący</td></tr></tbody></table>

test oparty na elektrochemiluminescencji dla wariantów białka mecp2

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

ECLIA to wszechstronna metoda, która jest w stanie określić ilościowo ilości endogennych i rekombinowanych białek w formacie 96-dołkowym. Aby wykazać skuteczność ECLIA, test ten wykorzystano do analizy wewnętrznych poziomów MeCP2 w tkance mózgowej myszy oraz wychwytu TAT-MeCP2 w ludzkich fibroblastach skóry. MeCP2-ECLIA zapewnia bardzo dokładne i powtarzalne pomiary z niskim błędem wewnątrz i między testami. Podsumowując, opracowaliśmy ilościową metodę oceny wariantów białka MeCP2, która może być wykorzystana w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych.

Zasadę działania systemu ECLIA przedstawiono na Rysunku 1. Krzywe wzorcowe dla dwóch wariantów MeCP2 pokazano na Rysunku 2. Dokładna kwantyfikacja była możliwa w szerokim zakresie stężeń (1−1 800 ng/mL). Na Rysunku 3 zanalizowano poziomy białka MeCP2 w lizatach pochodzących z mózgu myszy i z HDF. Porównano ekspresję MeCP2 w lizatach jądrowych mózgu myszy heterozygotycznych, typu dzikiego oraz z linii knock-out na <strong class="xfig...

Test immunologiczny elektrochemiluminescencji (ECLIA) to nowatorskie podejście do ilościowego wykrywania endogennych i egzogennie stosowanych wariantów białka MeCP2, które daje wysoce ilościowe, dokładne i powtarzalne pomiary z niskim błędem wewnątrz- i międzytestowym w szerokim zakresie roboczym. W tym miejscu opisano protokół dla MeCP2-ECLIA w formacie 96-dołkowym.

Test oparty na elektrochemiluminescencji dla wariantów białka MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

ECLIA jest prostą, ale skuteczną metodą ilościowego określania poziomów MeCP2 w komórkach. ECLIA jest szybka, bardziej czuła i łatwiejsza w obsłudze w porównaniu z innymi metodami oznaczania ilościowego, takimi jak Western blot i ELISA. Aby przygotować roztwór myjący, który wynosi 0,5%Tween 20 w PBS, dodaj 500 mikrolitrów Tween 20 do jednego litra PBS i energicznie wymieszaj.Przygotować roztwór blokujący składający się z 3%Blokera A i PBS i delikatnie wymieszać. Wysterylizuj roztwór blokujący przez filtrację. Aby przygotować roztwór rozcieńczalnika do oznaczania, 1% Bloker A i PBS, dodaj pięć mililitrów roztworu blokującego do 10 mililitrów PBS.Następnie rozmrozić mysie przeciwciało monoklonalne anty-MeCP2 na lodzie. Wymieszaj 0,67 mikrolitra przeciwciała z czterema mililitrami PBS, a następnie zwiruj roztwór. Aby pokryć roztworem 96-dołkową płytkę o wysokim spoiwie, ostrożnie dozuj 25 mikrolitrów roztworu powlekającego do dolnego rogu każdej studzienki za pomocą pipetera wielokanałowego.Delikatnie przetrzyj 96-dołkową płytkę z każdej strony, aby upewnić się, że roztwór powlekający pokrywa dno każdego dołka. Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyjmij 96-dołkową płytkę z lodówki i usuń folię.Usunąć roztwór powlekający przeciwciała ze studzienek, wrzucając go do pojemnika na odpady. Następnie postukaj w talerz o ręcznik papierowy, aby usunąć pozostały roztwór. Następnie dodaj 125 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki.Następnie ponownie uszczelnij płytkę folią samoprzylepną. Umieścić płytkę na orbitalnej wytrząsarce do mikropłytek, ustawionej na 800 obr./min i inkubować przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Rozmrozić na lodzie jedną fiolkę z roztworem podstawowym białka MeCP2 lub Tat-MeCP2, lizatami mózgu myszy i lizatami HDF.Rozcieńczyć podstawowy roztwór białka w czystych probówkach, jak opisano w tabeli drugiej manuskryptu. Następnie rozcieńczyć próbki lizatu. W przypadku lizatów mózgu myszy użyj od jednego do 20 mikrogramów na 25 mikrolitrów buforu do lizy.W przypadku lizatu HDF dodać 0,25 do jednego mikrograma na 25 mikrolitrów buforu do lizy. Po 90 minutach inkubacji na 96-dołkowej płytce, należy usunąć roztwór blokujący z dołków, wrzucając go do pojemnika na odpady. Następnie postukaj w talerz o ręcznik papierowy, aby usunąć pozostały roztwór.Następnie umyj płytkę trzykrotnie 150 mikrolitrami roztworu myjącego, dodając roztwór myjący i natychmiast go usuwając. Dodać 25 mikrolitrów wzorców i próbek do dołków 96-dołkowej płytki. Zamknąć płytkę i inkubować ją przez kolejne cztery godziny w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu z prędkością 800 obr./min.Rozmrozić nieznakowane przeciwciało wykrywające, poliklonalne królicze anty-MeCP2, na lodzie. Używając roztworu rozcieńczalnika do oznaczania, rozcieńczyć przeciwciało w stosunku jeden do 6 000. Po zakończeniu inkubacji płytki 96-dołkowej na wytrząsarce, należy usunąć wzorce i próbki, wrzucając płytkę do pojemnika na odpady.Następnie postukaj w talerz o ręcznik papierowy, aby usunąć pozostały roztwór. Umyj płytkę trzykrotnie 150 mikrolitrami roztworu myjącego, dodając roztwór myjący i natychmiast go usuwając. Dodać 25 mikrolitrów nieznakowanego roztworu przeciwciała detekcyjnego do każdej studzienki za pomocą pipetera wielokanałowego.Uszczelnić płytkę i inkubować ją przez godzinę w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając przy 800 obr./min. Pobrać specyficzne przeciwciało drugorzędowe z lodówki i umieścić w nim jeden lód. Rozcieńczyć ciało drugorzędowe w roztworze rozcieńczalnika do oznaczania i delikatnie wymieszać.Aby usunąć wolne, nieoznakowane przeciwciało wykrywające z płytki 96-dołkowej, wsuń je do pojemnika na odpady, a następnie postukaj w płytkę o ręcznik papierowy. Po umyciu płytki trzykrotnie w stosunku do poprzednio opisanego, dodać 25 mikrolitrów przeciwciał wtórnych do każdej studzienki za pomocą pipetera wielokanałowego. Uszczelnić płytkę i inkubować ją przez godzinę w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając przy 800 obr./min.Usunąć wolne przeciwciało drugorzędowe, wsuwając je do pojemnika na odpady i stukając płytką o ręcznik papierowy, a następnie umyj płytkę trzy razy, jak opisano wcześniej. Do każdej studzienki płytki dodaj 150 mikrolitrów 1X Tris base Gold Read Buffer ze środkiem powierzchniowo czynnym, zawierającym tripropyloaminę jako koreaktant do wytwarzania światła. Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, należy stosować techniki pipetowania odwrotnego.Umieść 96-dołkową płytkę na platformie mikropłytki z systemem detekcji elektrochemiluminescencji. Korzystając z wbudowanej kamery CCD, natychmiast rozpocznij przechwytywanie danych. Rejestruj liczbę sygnałów, które odpowiadają względnym jednostkom światła i są wprost proporcjonalne do natężenia światła.Standardowe krzywe MeCP2 zostały wygenerowane z ludzkiego MeCP2 w wielu pomiarach. ECLIA może dokładnie określić ilościowo rekombinowany ludzki MeCP2 w zakresie od jednego nanograma na mililitr do 1800 nanogramów na mililitr. Za pomocą ECLIA zmierzono poziomy białka MeCP2 w lizatach jądra mózgu od heterozygotycznych i samic myszy typu dzikiego oraz od jednej myszy z nokautem MeCP2.ECLIA przeprowadzono na lizatach komórkowych pochodzących od zdrowej grupy kontrolnej oraz z linii komórkowej c. 806delG wykorzystanej jako model zespołu Retta. Nie wykryto białka MeCP2 w zmutowanych liniach komórkowych za pomocą ECLIA lub immunofluorescencji.ECLIA wykorzystano również do zbadania wychwytu Tat-MeCP2 przez linię komórkową z niedoborem MeCP2 w miarę upływu czasu. Precyzja testu wewnętrznego i wewnętrznego ECLIA została określona w ciągu trzech kolejnych dni. W przypadku przyszłej terapii zastępczej białka, dostarczanie MeCP2 może być wielokrotnie optymalizowane po ocenie poziomu białka przez ECLIA.

an-electrochemiluminescence-based-assay-for-mecp2-protein-variants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano niedrogą, wysokoprzepustową metodę jednoczesnego wykrywania do 43 celów molekularnych. Zastosowania mPCR/RLB obejmują typowanie mikrobiologiczne oraz wykrywanie wielu patogenów w próbkach klinicznych.

Wielokrotna reakcja łańcuchowa polimerazy i analiza hybrydyzacji w układzie reverse line blot (mPCR/RLB)

W tym filmie demonstrujemy test immunologiczny elektrochemiluminescencji do ilościowego oznaczania docelowych poziomów białka w różnych próbkach. Test ten opiera się na luminescencji wytwarzanej w reakcji elektrochemicznej. Natężenie emitowanego światła jest proporcjonalne do ilości białka docelowego w próbce.

Test elektrochemiluminescencji do ilościowego oznaczania docelowych poziomów białka w lizacie mózgu

Ten film opisuje oparte na chemiluminescencji western blot immunoprecypitowanych lizatów. Technika ta pomaga określić przetwarzanie i aktywację białek. Wykryty sygnał chemiluminescencyjny jest proporcjonalny do poziomu przetworzenia białka podczas jego aktywacji.

Chemiluminescencyjny test Western Blot do przetwarzania białek

Pomiar biomarkerów w złożonych próbkach biologicznych coraz częściej pomaga w podejmowaniu decyzji klinicznych. Opisujemy wysoce czułą metodę jednoczesnego pomiaru białka C wiążącego miozynę sercową, kinazy kreatynowej MB i troponiny sercowej I w próbkach surowicy od osób z zawałem mięśnia sercowego i zdrowych osób z grupy kontrolnej.

Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego

Opisujemy wysokoprzepustowy, multipleksowy i celowany test proteomicznego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), opracowany z potencjałem do klinicznego tłumaczenia. Test może określić ilościowo potencjalne markery i czynniki ryzyka neurodegeneracji, takie jak warianty apolipoproteiny E (E2, E3 i E4), oraz zmierzyć ich ekspresję alleli.

Wysokoprzepustowy, multipleksowany i ukierunkowany test proteomiczny, płyn mózgowo-rdzeniowy do ilościowego określania biomarkerów neurodegeneracyjnych i statusu izoform apolipoproteiny E

Informujemy o małym RNA spinki do włosów (shRNA) i protokole sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji regulatorów inaktywacji chromosomu X w linii komórkowej myszy z genami oporności na lucyferazy świetlika i higromycynę połączonymi z genem białka wiążącego metylo CpG 2 (MeCP2) na nieaktywnym chromosomie X.

Zbiorcze badanie przesiewowe shRNA w celu reaktywacji MeCP2 na nieaktywnym chromosomie X

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego jednoetapowego oczyszczania aktywnej, nieoznakowanej, ludzkiej translokacji 10-jedenaście (TET2) 5-metylocytozynowej dioksygenazy za pomocą chromatografii jonowymiennej i jej testu opartego na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS).

Skuteczne oczyszczanie i opracowywanie testów opartych na LC-MS/MS dla dioksygenazy 5-metylocytozynowej translokacji Ten-Eleven-2

Tutaj opisujemy protokół generowania realnego modelu samicy mysiej z nielosową inaktywacją chromosomu X, tzn. chromosom X odziedziczony po matce jest nieaktywny w 100% komórek. Opisujemy również protokół testowania wykonalności, tolerancji i bezpieczeństwa farmakologicznej reaktywacji nieaktywnego chromosomu X in vivo.

Nielosowy mysi model do farmakologicznej reaktywacji Mecp2 na nieaktywnym chromosomie X

Ubikwitylacja CENP-A jest ważnym wymogiem dla depozycji CENP-A w centromerze, dziedziczonym przez dimeryzację między podziałami komórkowymi i nieodzownym dla żywotności komórki. Tutaj opisujemy analizę spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji białka CENP-A (EYFP-CENP-A) znakowanego EYFP.

Analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji CENP-A znakowanego EYFP (EYFP-CENP-A)

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Poznaj metodę ECLIA do ilościowego oznaczania wariantów białka MeCP2 w formacie 96-well. Ta technika oferuje wyższą czułość i powtarzalność niż tradycyjne Western blot, wspierając badania neurobiologiczne.

Test oparty na elektrochemiluminescencji dla wariantów białka MeCP2

Przeglądaj więcej filmów