Name: Konfiguracja spektrometrii mas z elektroforezą kapilarną i indukcyjnie sprzężoną plazmą (CE-ICP-MS) do oznaczania ilościowego gatunków redoks żelaza (Fe(II), Fe(III)) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: Poznaj metodę CE-ICP-MS do szybkiego oznaczania gatunków redoks żelaza Fe(II) i Fe(III) w próbkach biologicznych. Technika ta umożliwia badanie procesów zależnych od żelaza w kontekście chorób neurodegeneracyjnych i nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VV było wspierane przez grant badawczy (Forschungsförderung) Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Getyndze oraz program badawczy Else Kröner Else Kröner-Fresenius-Stiftung.

<ol><li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+early-life+iron+exposure+critical+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (9), 536-544 (2015).</li>
<li>Ashraf, A., Clark, M., So, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aging+of+Iron+Man%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Aging of Iron Man.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, (2018).</li>
<li>Hare, D. J., Cardoso, B. R., Szymlek-Gay, E. A., Biggs, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+effects+of+iron+supplementation+in+infancy%3A+finding+the+balance+between+health+and+harm+in+iron-replete+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Child+Adolesc+Health%22%5BJournal%5D)">Neurological effects of iron supplementation in infancy: finding the balance between health and harm in iron-replete infants.</a> Lancet Child Adolesc Health. 2 (2), 144-156 (2018).</li>
<li>Torti, S. V., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%3A+more+ore+to+be+mined%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer: more ore to be mined.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).</li>
<li>Kehrer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Haber-Weiss+reaction+and+mechanisms+of+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity.</a> Toxicology. 149 (1), 43-50 (2000).</li>
<li>Gaschler, M. M., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxidation+in+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxidation in cell death.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 482 (3), 419-425 (2017).</li>
<li>Michalke, B., Halbach, S., Nischwitz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JEM+Spotlight%3A+Metal+speciation+related+to+neurotoxicity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Monitoring%22%5BJournal%5D)">JEM Spotlight: Metal speciation related to neurotoxicity in humans.</a> Journal of Environmental Monitoring. 11 (5), 939-954 (2009).</li>
<li>Solovyev, N., Vinceti, M., Grill, P., Mandrioli, J., Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+speciation+of+iron%2C+manganese%2C+and+copper+in+cerebrospinal+fluid+by+strong+cation+exchange+chromatography+-+sector+field+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Redox speciation of iron, manganese, and copper in cerebrospinal fluid by strong cation exchange chromatography - sector field inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 973, 25-33 (2017).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+excess+iron+on+oxidative+stress+and+gluconeogenesis+through+hepcidin+during+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutritional+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of excess iron on oxidative stress and gluconeogenesis through hepcidin during mitochondrial dysfunction.</a> Journal of Nutritional Biochemistry. 26 (12), 1414-1423 (2015).</li>
<li>Dixon, S. J., Lemberg, K. M., Lamprecht, M. R., Skouta, R., Zaitsev, E. M., Gleason, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+an+iron-dependent+form+of+nonapoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death.</a> Cell. 149 (5), 1060-1072 (2012).</li>
<li>Stockwell, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+A+Regulated+Cell+Death+Nexus+Linking+Metabolism%2C+Redox+Biology%2C+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease.</a> Cell. 171 (2), 273-285 (2017).</li>
<li>Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Halbach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+speciation+in+human+cerebrospinal+fluid+using+CZE+coupled+to+inductively+coupled+plasma+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS.</a> Electrophoresis. 28 (9), 1380-1386 (2007).</li>
<li>Fernsebner, K., Zorn, J., Kanawati, B., Walker, A., Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+leads+to+an+increase+in+markers+of+oxidative+stress+as+well+as+to+a+shift+in+the+ratio+of+Fe%28II%29%2F%28III%29+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Manganese leads to an increase in markers of oxidative stress as well as to a shift in the ratio of Fe(II)/(III) in rat brain tissue.</a> Metallomics. 6 (4), 921-931 (2014).</li>
<li>Neth, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manganese%3A+Species+Pattern+and+Mechanisms+of+Brain+Injury%22">Manganese: Species Pattern and Mechanisms of Brain Injury</a>. , Technical University of Munich, Analytical Food Chemistry. Doctoral Dissertation (2015).</li>
<li>Neth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Brain+Metallome%2FMetabolome+Pattern+due+to+a+Single+i.v.+Injection+of+Manganese+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Changes in Brain Metallome/Metabolome Pattern due to a Single i.v. Injection of Manganese in Rats.</a> Plos One. 10 (9), (2015).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+causes+neurotoxic+iron+accumulation+via+translational+repression+of+Amyloid+Precursor+Protein+%28APP%29+and+H-Ferritin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Manganese causes neurotoxic iron accumulation via translational repression of Amyloid Precursor Protein (APP) and H-Ferritin.</a> Journal of Neurochemistry. 147 (6), 831-848 (2018).</li>
<li>Willkommen, D., Lucio, M., Schmitt-Kopplin, P., Gazzaz, M., Schroeter, M., Sigaroudi, A., Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+fractionation+in+a+case-control+study+concerning+Parkinson%27s+disease%3A+Cu-amino+acids+discriminate+CSF+of+PD+from+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Trace+Elements+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Species fractionation in a case-control study concerning Parkinson's disease: Cu-amino acids discriminate CSF of PD from controls.</a> Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 164-170 (2018).</li>
<li>Thibault, P., Dovichi, N. J. General instrumentation and detection systems including mass spectrometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThibault%2C+P+%22Capillary+Electrophoresis+-+Theory+and+Practice%22">Capillary Electrophoresis - Theory and Practice</a>. Camilleri, P. , CRC Press. Boca Raton, Boston, New York, Washington D.C., London. 23-89 (1998).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Paravascular+Pathway+Facilitates+CSF+Flow+Through+the+Brain+Parenchyma+and+the+Clearance+of+Interstitial+Solutes%2C+Including+Amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Paravascular Pathway Facilitates CSF Flow Through the Brain Parenchyma and the Clearance of Interstitial Solutes, Including Amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li>
<li>Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+speciation+using+capillary+electrophoresis-ICP-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1050 (1), 69-76 (2004).</li>
<li>Kuhn, R., Hofstetter-Kuhn, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuhn%2C+R+%22Capillary+electrophoresis%3A+Principles+and+practice%22">Capillary electrophoresis: Principles and practice</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1993).</li>
<li>Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoretic+methods+for+a+clear+identification+of+selenoamino+acids+in+complex+matrices+such+as+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoretic methods for a clear identification of selenoamino acids in complex matrices such as human milk.</a> Journal of Chromatography A. 716 (1-2), 323-329 (1995).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156 (1-2), 317-331 (2014).</li>
<li>Shimada, K., Hayano, M., Pagano, N. C., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Line+Selectivity+Improves+the+Predictive+Power+of+Pharmacogenomic+Analyses+and+Helps+Identify+NADPH+as+Biomarker+for+Ferroptosis+Sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity.</a> Cell Chemical Biology. 23 (2), 225-235 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ żelazo odgrywa znaczącą rolę w progresji OS, ułatwiając w ten sposób dysfunkcję mitochondriów lub FTP, w artykule przedstawiono wszechstronną metodę ilościową opartą na CE-ICP-MS do jednoczesnej specjacji Fe(II)/Fe(III), a jej zastosowanie zostało przykładowo wykazane w lizatach komórkowych. Metoda ta zapewniła krótki czas analizy, a wartości liczbowe (LOQ, precyzja, odzysk) są odpowiednie dla próbek istotnych dla specjacji redoks żelaza, szczególnie w badaniach nad neurodegeneracją i rakiem. W porównaniu z poprzednimi metodami opartymi na LC, ta metoda oparta na CE jest praktycznie niezależna od partii kolumn i wcześniej obserwowanych problemów z odtwarzalnością po zmianie kolumny LC. Przygotowanie kapilarne przed każdym serią trwa <4 minuty, a czas analizy na próbkę o umiarkowanym zasoleniu do 3 minut. Oprócz ładunku i wielkości cząsteczki, czas migracji w CZE zależy od przewodności w czopie próbki, co powoduje zmiany w czasie migracji lub przesunięcia, gdy same próbki mają znaczny wpływ na przewodność. Takie przesunięcia w czasie migracji są dobrze znane w elektroforezie kapilarnej. Jest to problem CZE-immanentny, znany z literatury 21,22. Wzorce i lizaty komórkowe SH-SY5Y charakteryzowały się umiarkowaną i jednorodną przewodnością. W związku z tym czasy migracji wykazały tylko niewielkie zmiany z dobrą precyzją. Jednak w przypadku próbek o wysokiej przewodności można zaobserwować wydłużony czas migracji do 5 minut. W związku z tym zaleca się stosowanie standardowych dodatków w celu jednoznacznej identyfikacji gatunków.
Krytycznym zagadnieniem w specjacji żelaza redoks jest stabilność gatunkowa (tj. utrzymanie równowagi Fe(II)/(III)) podczas przygotowywania próbki 8,13. Niewłaściwe pH lub chelatujące chemikalia, a także niewłaściwe warunki przechowywania, takie jak tlen (powietrze) w kontakcie z próbką lub przerwa w przechowywaniu w głębokim mrożeniu, mogą łatwo zmienić równowagę Fe(II)/(III). Dlatego do przygotowania lizatów komórkowych SH-SY5Y wybrano bufor do lizy bez żadnych chelatujących substancji chemicznych, fizjologicznego pH, ale nałożono gaz obojętny podczas przygotowania próbki, w pojemnikach na próbki, a do tych próbek zastosowano natychmiastowe głębokie mrożenie.
W piśmiennictwie można znaleźć półilościowe podejścia do monitorowania Fe(II). Aby lepiej zrozumieć rolę żelaza w stresie oksydacyjnym, kilka grup badawczych opracowało sondy specyficzne dla Fe(II) do półilościowego monitorowania i wizualizacji nieprawidłowego wzrostu żelaza żelazowego in vitro. Należy jednak zauważyć, że takie sondy nie uwzględniają Fe(III) i nie określają ilościowo, ale podają tylko "więcej" lub "mniej" Fe(II)). Do tej pory dostępnych jest tylko kilka biomarkerów do określenia OS i FPT, co wynika z braku wiarygodnych metod jednoczesnego ilościowego oznaczania gatunków redoks Fe(II)/Fe(III)23,24. Mając to na uwadze, przedstawiona metoda - ułatwiająca szybkie oznaczanie ilościowe zarówno Fe(III), jak i Fe(II) w jednym przebiegu - może stać się obiecującym narzędziem do pogłębienia wglądu w procesy molekularne zależne od żelaza.

Dzisiaj najbardziej oczywiste jest, że stres oksydacyjny (OS) za pośrednictwem żelaza odgrywa kluczową rolę w wielu zaburzeniach, szczególnie w neurodegeneracyjnych zaburzeniach mózgu, takich jak choroba Alzheimera i Parkinsona, a także w raku1,2,3,4. OS jest ściśle związany ze stanem i równowagą pary redoks Fe(II)/Fe(III). Podczas gdy Fe(III) jest nieaktywny redoks, Fe(II) silnie generuje reaktywne formy tlenu (ROS) poprzez katalizowanie rozkładuH2O2, po którym następuje produkcja rodników hydroksylowych i peroksydacja lipidów błonowych5,6. Na poziomie molekularnym ROS generowane przez Fe(II) i peroksydowane fosfolipidy stanowią silny atak na integralność białek, lipidów i DNA7,8. Wykazano, że taka szkodliwa dysfunkcja komórkowa indukuje dysfunkcję mitochondriów ze zmniejszoną zawartością ATP9 i może nawet wywołać zaprogramowaną martwiczą śmierć komórki, znaną jako ferroptoza (FPT)10,11. Dlatego ilościowa specjacja redoks Fe(II)/(III) ma ogromne znaczenie w szerokim spektrum zaburzeń związanych z redoks.
Specjacja chemiczna jest sprawdzonym narzędziem do badania biologicznej roli pierwiastków śladowych i metabolizmu w ogóle7,8 jak również w stanach neurodegeneracyjnych12,13,14,15,16,17. Metody specjacji Fe-redoks znalezione w literaturze są zwykle oparte na rozdzielaniu metodą chromatografii cieczowej (LC). W części literatury wykorzystuje się spektrometrię mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) jako detektor selektywny pierwiastków. Jednak w rutynowych pracach LC konieczne były zbyt długie czasy czyszczenia między cyklami. Jeszcze bardziej problematyczne jest to, że zmienność kolumn LC z partii na partię wymusiła ponowną optymalizację warunków elucji po każdej zmianie kolumny. Problemy te utrudniają wysoką przepustowość. Potrzebny jest dodatkowy czas, aby uzyskać akceptowalną wiarygodność i ponownie dokładnie ocenić metodę.
Aby obejść te wady, przedstawiono tutaj metodę specjacji redoks Fe(II)/Fe(III) opartą na elektroforezie kapilarnej ze spektrometrią mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (CE-ICP-MS). CE oferuje różne zalety w porównaniu do LC18. Kapilary nie mają fazy stacjonarnej, a zatem nie zależą (prawie) od tożsamości partii. Po starzeniu lub zablokowaniu są szybko wymieniane, wykazując zwykle niezmienioną wydajność. Etapy przedmuchiwania i czyszczenia między próbkami są skuteczne i krótkie, a czas analizy na próbkę jest również krótki.
Przedstawiona metoda jest wiarygodna z dobrymi wartościami merytorycznymi. Jako dowód słuszności zasady, metoda ta została zastosowana do lizatu komórkowego ludzkiego nerwiaka dopaminergicznego (SH-SY5Y), rodzaju próbki ważnej w neurodegeneracji, a także w badaniach nad rakiem19.

<table><tbody><tr><td>Serwis chromatografii kapilarnej CE</td>, <td>Langerwehe, Niemcy</td><td>105180-25</td><td></td></tr><tr><td>System CE</td><td>Technologie PrinCe</td><td>0005.263</td><td>model PrinCe 760</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki Superclear 15 ml</td><td>Analytics-shop.com firmy Altmann Analytik</td><td>PEN0777704</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki Superclear 50 ml</td><td>Analytics-shop.com firmy Altmann Analytik</td><td>PEN0777694</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2 * 4H2O</td><td>Merck</td><td>103861</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Merck</td><td>803945</td><td></td></tr><tr><td>Fluidflex Silikon HG-Schlauch</td><td>ProLiquid</td><td>4001106HG</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara z topionej krzemionki OD 360 &micro; m, ID 50 i mikro; m</td><td>Chromatographie Service GmbH</td><td>105180-25</td><td></td></tr><tr><td>kwas solny, 1 M</td><td>Merck</td><td>1101652500</td><td></td></tr><tr><td>ICP-MS</td><td>Perkin Elmer</td><td>N814003</td><td></td></tr><tr><td>Luer, 3-drożny żeński</td><td>BioRad</td><td>7318229</td><td></td></tr><tr><td>Luer, stożek męski</td><td>neoLab Migge</td><td>2-1895</td><td></td></tr><tr><td>Luer, męski</td><td>neoLab Migge</td><td>2-1880</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do oceny wartości szczytowych Peakfit</td><td>Systat</td><td>PeakFit 4.12</td><td></td></tr><tr><td>Pt-wire</td><td>Carl Roth</td><td>0737.1</td><td></td></tr><tr><td>Rura PVC</td><td>ProLiquid</td><td>6000002</td><td></td></tr><tr><td>bufor RIPA</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek tetrametyloamonu, 25 %</td> <td>Merck</td><td>814748</td><td></td></tr><tr><td>rura TYGON R-3607</td><td>ProLiquid</td><td>3700203A</td><td></td></tr></tbody></table>

konfiguracja spektrometrii mas z elektroforezą kapilarną i indukcyjnie sprzężoną plazmą (ce-icp-ms) do oznaczania ilościowego gatunków redoks żelaza (fe(ii), fe(iii))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostaza metabolizmu żelaza jest uwzględniona w patofizjologicznych ramach wielu chorób, w tym raka i kilku schorzeń neurodegeneracyjnych. Nadmiar żelaza powoduje powstawanie wolnego redoks aktywnego Fe(II) i może powodować niszczące skutki w komórce, takie jak stres oksydacyjny (OS) i śmierć w wyniku peroksydacji lipidów, znanej jako ferroptoza (FPT). Dlatego ilościowe pomiary żelaza (Fe(II)) i żelaza (Fe(III)) zamiast całkowitego oznaczania żelaza jest kluczem do bliższego wglądu w te szkodliwe procesy. Ponieważ oznaczanie Fe(II)/(III) może być utrudnione przez szybkie zmiany stanu redoks i niskie stężenia w odpowiednich próbkach, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), powinny być dostępne metody, które szybko analizują i zapewniają niskie granice oznaczalności (LOQ). Elektroforeza kapilarna (CE) ma tę zaletę, że umożliwia szybkie oddzielanie Fe(II)/Fe(III) i działa bez fazy stacjonarnej, która mogłaby zakłócać równowagę redoks lub powodować przywieranie analitu. CE w połączeniu ze spektrometrią mas ze wzbudzeniem w plazmie sprzężonej indukcyjnie (ICP-MS) jako detektorem zapewnia dalszą poprawę czułości i selektywności wykrywania. W prezentowanej metodzie wykorzystuje się 20 mM HCl jako elektrolit tła i napięcie +25 kV. Kształty pików i granice wykrywalności stężeń są ulepszane dzięki układaniu w stosy przewodności i pH. W celu redukcji 56[ArO]+, ICP-MS operowano w trybie dynamicznej komory reakcyjnej (DRC) z NH3 jako gazem reakcyjnym. Metoda ta pozwala osiągnąć granicę wykrywalności (LOD) na poziomie 3 μg/L. Ze względu na układanie w stosy, możliwe było uzyskanie większych objętości iniekcji bez utrudniania separacji, ale z poprawą LOD. Kalibracje związane z powierzchnią piku były liniowe do 150 μg/L. Precyzja pomiaru wynosiła od 2,2% (Fe(III)) do 3,5% (Fe(II)). Precyzja czasu migracji wynosiła <3% dla obu gatunków, oznaczona w rozcieńczonych w stosunku 1:2 lizatach komórek ludzkiego nerwiaka zarodkowego (SH-SY5Y). Eksperymenty z odzyskiem z dodatkiem wzorca wykazały dokładność 97% Fe(III) i 105% Fe(II). W rzeczywistych próbkach biologicznych, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy, czas migracji może się różnić w zależności od różnej przewodności (tj. zasolenia). W ten sposób identyfikacja piku jest potwierdzona przez dodanie wzorca.

Pomiary wzorców i kalibracja 
Czasy migracji określono poprzez pojedyncze wtryski wzorców: wzorzec Fe(III) monitorowano przy czasie migracji 118 s, a wzorzec Fe(II) przy czasie migracji 136 s. Granice wykrywalności obliczono z zastosowaniem kryterium 3σ w odniesieniu do szumu linii bazowej i stężenia wzorca 50 µg/L. LOD(Fe(II) wyniosła 3,1 µg/L, a LOD(Fe(III) wyniosła 3,2 µg/L. Kalibracja oparta na powierzchni piku dla obu form żelaza była liniowa od poziomu LOD do 150 µg/L. Chociaż liniowość Fe(III) została potwierdzona również dla wyższych stężeń, nachylenie krzywej kalibracyjnej dla Fe(II) uległo zmniejszeniu. Górną granicę stężenia 150 µg/L uznano za wystarczającą, ponieważ próbki biologiczne istotne dla oznaczania Fe(II)/(III) zazwyczaj charakteryzują się niższym stężeniem Fe. W przypadku wyższych stężeń próbki można odpowiednio rozcieńczyć. Kalibrację opartą na wysokości piku sprawdzono do stężenia 600 µg/L, co wykazało liniowość w całym badanym zakresie. Przedstawiono to na Rysunku 2.
<img alt="Krzywa kalibracyjna stężenia Fe III i Fe II w funkcji wysokości piku; wykres regresji liniowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61055/61055fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Krzywe kalibracyjne (wysokość piku) dla Fe(III) i Fe(II). Kalibracje związane z wysokością piku dla obu form redoks Fe są liniowe, ze nachyleniem ok. 161 *X <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61055/61055fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Analiza lizatu komórek SH-SY5Y 
Analiza lizatu komórek SH-SY5Y wykazała nieco wolniejszą migrację form redoks żelaza ze względu na nieco wyższą przewodność. Fe(III) monitorowano w 124 s czasu migracji, a Fe(II) w 158 s czasu migracji. Precyzja czasu migracji w lizacie komórek SH-SY5Y wyniosła 2% dla Fe(III) oraz 3% dla Fe(II). Ilościowe pomiary Fe(II) i Fe(III) z wykorzystaniem tej metody ujawniły stężenie Fe(III) na poziomie 330 µg/L oraz stężenie Fe(II) na poziomie 84 µg/L, co w obu przypadkach dało stosunek Fe(II)/Fe(III) wynoszący 0,25. Odpowiedni elektroferogram selektywny dla 56Fe przedstawiono na Rysunku 3.
<img alt="Wyniki elektroforezy; wykres lizatu komórek SH-SY5Y pokazujący piki Fe(III) i Fe(II) w czasie migracji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61055/61055fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Elektroferogram lizatu komórek SH-SY5Y specyficzny dla 56Fe. Fe(III) jest monitorowane w 123 s, osiągając wysokość piku 58025 cps, i jest wyraźnie oddzielone od Fe(II) w 158 s, które osiąga 22800 cps <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61055/61055fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Ta metoda specjacji żelaza redoks opiera się na elektroforezie kapilarnej - spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie z układaniem próbek połączonym z krótką analizą w jednym przebiegu. Metoda szybko analizuje i zapewnia niskie limity oznaczalności dla form redoks żelaza w różnych próbkach tkanek i płynów biologicznych.

Konfiguracja spektrometrii mas z elektroforezą kapilarną i indukcyjnie sprzężoną plazmą (CE-ICP-MS) do oznaczania ilościowego gatunków redoks żelaza (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Nadmiar żelaza powoduje powstawanie wolnego redoks-aktywnego żelaza dwa plusy, które może powodować niszczące skutki w komórce, takie jak stres oksydacyjny i śmierć komórek w wyniku peroksydacji lipidów znanej jako ferroptoza. Pomiary ilościowe żelaza i żelaza są kluczem do bliższego wglądu w te szkodliwe procesy. Ta technika CE-ICP-Ms zapewnia zarówno szybką analizę, jak i niskie limity kwantyfikacji, które są niezbędne do ilościowego oznaczania gatunków żelaza i redoks.Zacznij od wybrania nebulizatora o małej objętości samozasysającej i przygotowania odpowiednich części do montażu domowego interfejsu. Połącz dwa trójdrożne żeńskie złącza luer z męskim złączem stożkowym luer, łącząc lewy koniec dolnego trójdrożnego złącza luer ze złączem męskim, a złącze męskie ze środkowym złączem górnego trójdrożnego luer. Następnie umieść jednocentymetrową rurkę na platynowym drucie i użyj jednocentymetrowej silikonowej rurki, aby połączyć pierwszą rurkę i dyszę męskiego złącza luer.Przymocuj zespół do środkowego połączenia dolnego trójdrożnego złącza luer poprzez obrót. Przesuń jednocentymetrową rurkę przez wylot kapilary CE i umieść ją w odległości od ośmiu do dziewięciu centymetrów od końca, a następnie podłącz ją do dyszy męskiego złącza luer za pomocą silikonowej rurki. Przełóż cały zespół przez pręt górnego trójdrożnego złącza T i zamocuj męskie złącze luer oraz lewy koniec żeńskiego trójdrożnego złącza luer za pomocą obrotu.Następnie przymocuj 25-centymetrową silikonową rurkę do dyszy męskiego złącza luer i zamocuj cały zespół na dole pręta od dolnego trójdrożnego łącznika przynęty. Mocno dociśnij jednocentymetrową silikonową rurkę, pięć milimetrów nad końcem nebulizatora. Podczas gdy drugie męskie złącze stożkowe luer jest wpięte w wystającą część rurki.Przesuń część interfejsu z wystającą kapilarą CE do męskiego stożka przy nebulizatorze, a następnie ostrożnie włóż kapilatę przez męski stożek i szerszą część kapilary nebulizatora. W razie potrzeby wyreguluj długość wystającej kapilary, odkręcając lewy męski luer, przesuwając luer z dołączonymi rurkami do wymaganej pozycji i ponownie go montując. Górne żeńskie trójdrożne złącza luer powinny ściśle przylegać do męskiego stożka.Po zakończeniu instalacji kontynuuj korzystanie z ICP-Ms. Krzywe kalibracyjne stworzono dla żelaza 3 i żelaza 2 gatunków redoks. Granice wykrywalności wynosiły 3,1 mikrograma na litr dla żelaza drugiego i 3,2 mikrograma na litr dla żelaza trzeciego, a liniowość wykazano do 150 mikrogramów na litr.Analiza lizatu komórkowego SH-SY5Y wykazała nieco wolniejszą migrację dla form redoks żelaza ze względu na nieco wyższą przewodność. Zmierzone stężenia żelaza 3 i żelaza 2 wynosiły odpowiednio 330 mikrogramów na litr i 84 mikrogramy na litr. Daje to stosunek żelaza dwa do trzech wynoszący 0,25.Najważniejszym krokiem tego protokołu jest staranne wprowadzenie wystającej kapilary CE przez zamontowany interfejs i jej odpowiednie ustawienie względem kapilary nebulizatora. Przedstawione tu metody mogą stać się obiecującym narzędziem do pogłębienia wiedzy na temat procesów molekularnych zależnych od żelaza. Potrzebne są starannie zaprojektowane badania, aby zweryfikować, czy oznaczanie ilościowe żelaza dwa plus, żelazo trzy plus może służyć jako potencjalny biomarker do wskazania tkanki zagrożonej śmiertelnym uszkodzeniem za pośrednictwem żelaza w kontekście chorób neurodegeneracyjnych i nowotworowych.

setup-capillary-electrophoresis-inductively-coupled-plasma-mass

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Chromatografia wykluczania wielkości z łącznikiem plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometria mas (ICP-MS) to potężne narzędzie do pomiaru zmian w obfitości metaloprotein bezpośrednio z próbek biologicznych. W tym miejscu opisujemy zestaw wzorców metaloprotein używanych do szacowania masy cząsteczkowej i ilości metalu związanego z nieznanymi białkami.

Standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości ICP-MS

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

W tej pracy znajduje się praktyczny przewodnik, opisujący różne kroki do ustanowienia sprzężenia systemów SMPS i ICPMS oraz jak z nich korzystać. Przedstawiono trzy przykłady opisowe.

Praktyczny przewodnik na temat sprzężenia skanera mobilności skanera i spektrometru mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (SMPS-ICPMS)

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową metodę kompleksowego nadzoru nad narkotykami, która pozwala na lepszą rozdzielczość i wykrywanie dużych paneli nadużywanych narkotyków i ich metabolitów, z kontrolą jakości opartą na wielosegmentowej elektroforezie kapilarnej i spektrometrii mas.

Wysokowydajny i kompleksowy nadzór nad lekami za pomocą wielosegmentowej elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy protokół do scharakteryzowania kompletnej korony biomolekularnej, białek i metabolitów, uzyskanych przez nanomateriały z biopłynów przy użyciu elektroforezy kapilarnej - podejścia spektrometrii mas.

Metody spektrometrii mas elektroforezy kapilarnej do charakteryzowania korony białkowej i metabolitowej uzyskanej przez nanomateriały

Opisano procedurę elektroforezy kapilarnej, spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania do bezwzględnego oznaczania ilościowego pirofosforanów inozytolu z ekstraktów komórkowych ssaków.

Bezwzględna ocena ilościowa pirofosforanów inozytolu za pomocą elektroforezy kapilarnej Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylania

Prezentowany protokół opisuje homogenizację próbki za pomocą laboratoryjnego miksera, trawienie kwasem próbek żywności przy użyciu mieszaniny 68% wagowych HNO3 i 30% wagowych H2O2 poprzez mikrofalowo wspomagane trawienie kwasem na mokro oraz oznaczanie wielopierwiastkowe wykonywane za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie.

Przygotowanie próbek żywności z wykorzystaniem homogenizacji i roztwarzania kwasowego na mokro wspomaganego mikrofalami w celu oznaczania wielu pierwiastków za pomocą ICP-MS

Przedstawiono metodę identyfikacji gatunków materiału botanicznego poprzez bezpośrednią analizę w czasie rzeczywistym - spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości i wielowymiarowa analiza statystyczna.

Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Pokazano protokół charakteryzujący skład chemiczny wydychanego powietrza w czasie rzeczywistym za pomocą wtórnej jonizacji nanoelectrospray sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.

Analiza oddechu w czasie rzeczywistym przy użyciu wtórnej jonizacji nanoelektronizacyjnej sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości

Poznaj metodę CE-ICP-MS do szybkiego oznaczania gatunków redoks żelaza Fe(II) i Fe(III) w próbkach biologicznych. Technika ta umożliwia badanie procesów zależnych od żelaza w kontekście chorób neurodegeneracyjnych i nowotworowych.

Konfiguracja spektrometrii mas z elektroforezą kapilarną i indukcyjnie sprzężoną plazmą (CE-ICP-MS) do oznaczania ilościowego gatunków redoks żelaza (Fe(II), Fe(III)) (Wideo) | JoVE Journal

Konfiguracja spektrometrii mas z elektroforezą kapilarną i indukcyjnie sprzężoną plazmą (CE-ICP-MS) do oznaczania ilościowego gatunków redoks żelaza (Fe(II), Fe(III))

Przeglądaj więcej filmów