Konfiguracja spektrometrii mas z elektroforezą kapilarną i indukcyjnie sprzężoną plazmą (CE-ICP-MS) do oznaczania ilościowego gatunków redoks żelaza (Fe(II), Fe(III))
4 maja 2020
Ta metoda specjacji żelaza redoks opiera się na elektroforezie kapilarnej - spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie z układaniem próbek połączonym z krótką analizą w jednym przebiegu. Metoda szybko analizuje i zapewnia niskie limity oznaczalności dla form redoks żelaza w różnych próbkach tkanek i płynów biologicznych.
Nadmiar żelaza powoduje powstawanie wolnego redoks-aktywnego żelaza dwa plusy, które może powodować niszczące skutki w komórce, takie jak stres oksydacyjny i śmierć komórek w wyniku peroksydacji lipidów znanej jako ferroptoza. Pomiary ilościowe żelaza i żelaza są kluczem do bliższego wglądu w te szkodliwe procesy. Ta technika CE-ICP-Ms zapewnia zarówno szybką analizę, jak i niskie limity kwantyfikacji, które są niezbędne do ilościowego oznaczania gatunków żelaza i redoks.
Zacznij od wybrania nebulizatora o małej objętości samozasysającej i przygotowania odpowiednich części do montażu domowego interfejsu. Połącz dwa trójdrożne żeńskie złącza luer z męskim złączem stożkowym luer, łącząc lewy koniec dolnego trójdrożnego złącza luer ze złączem męskim, a złącze męskie ze środkowym złączem górnego trójdrożnego luer. Następnie umieść jednocentymetrową rurkę na platynowym drucie i użyj jednocentymetrowej silikonowej rurki, aby połączyć pierwszą rurkę i dyszę męskiego złącza luer.
Przymocuj zespół do środkowego połączenia dolnego trójdrożnego złącza luer poprzez obrót. Przesuń jednocentymetrową rurkę przez wylot kapilary CE i umieść ją w odległości od ośmiu do dziewięciu centymetrów od końca, a następnie podłącz ją do dyszy męskiego złącza luer za pomocą silikonowej rurki. Przełóż cały zespół przez pręt górnego trójdrożnego złącza T i zamocuj męskie złącze luer oraz lewy koniec żeńskiego trójdrożnego złącza luer za pomocą obrotu.
Następnie przymocuj 25-centymetrową silikonową rurkę do dyszy męskiego złącza luer i zamocuj cały zespół na dole pręta od dolnego trójdrożnego łącznika przynęty. Mocno dociśnij jednocentymetrową silikonową rurkę, pięć milimetrów nad końcem nebulizatora. Podczas gdy drugie męskie złącze stożkowe luer jest wpięte w wystającą część rurki.
Przesuń część interfejsu z wystającą kapilarą CE do męskiego stożka przy nebulizatorze, a następnie ostrożnie włóż kapilatę przez męski stożek i szerszą część kapilary nebulizatora. W razie potrzeby wyreguluj długość wystającej kapilary, odkręcając lewy męski luer, przesuwając luer z dołączonymi rurkami do wymaganej pozycji i ponownie go montując. Górne żeńskie trójdrożne złącza luer powinny ściśle przylegać do męskiego stożka.
Po zakończeniu instalacji kontynuuj korzystanie z ICP-Ms. Krzywe kalibracyjne stworzono dla żelaza 3 i żelaza 2 gatunków redoks. Granice wykrywalności wynosiły 3,1 mikrograma na litr dla żelaza drugiego i 3,2 mikrograma na litr dla żelaza trzeciego, a liniowość wykazano do 150 mikrogramów na litr.
Analiza lizatu komórkowego SH-SY5Y wykazała nieco wolniejszą migrację dla form redoks żelaza ze względu na nieco wyższą przewodność. Zmierzone stężenia żelaza 3 i żelaza 2 wynosiły odpowiednio 330 mikrogramów na litr i 84 mikrogramy na litr. Daje to stosunek żelaza dwa do trzech wynoszący 0,25.
Najważniejszym krokiem tego protokołu jest staranne wprowadzenie wystającej kapilary CE przez zamontowany interfejs i jej odpowiednie ustawienie względem kapilary nebulizatora. Przedstawione tu metody mogą stać się obiecującym narzędziem do pogłębienia wiedzy na temat procesów molekularnych zależnych od żelaza. Potrzebne są starannie zaprojektowane badania, aby zweryfikować, czy oznaczanie ilościowe żelaza dwa plus, żelazo trzy plus może służyć jako potencjalny biomarker do wskazania tkanki zagrożonej śmiertelnym uszkodzeniem za pośrednictwem żelaza w kontekście chorób neurodegeneracyjnych i nowotworowych.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowatorską metodę określania specjacji redoks żelaza z wykorzystaniem elektroforezy kapilarnej sprzężonej z spektrometrią mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną (CE-ICP-MS). Technika ta umożliwia szybką analizę oraz osiągnięcie niskich granic oznaczania dla form redoks żelaza w różnych tkankach i płynach ustrojowych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Chemia analityczna
Wstęp
- Nadmiar żelaza może prowadzić do stresu oksydacyjnego i śmierci komórek.
- Ilościowe pomiary żelaza dwu- i trójwartościowego są kluczowe dla zrozumienia tych procesów.
- Ferroptoza jest formą śmierci komórkowej powiązaną z przeciążeniem organizmu żelazem.
- Istniejące metody mogą nie zapewniać szybkości i czułości niezbędnej do ilościowego oznaczenia żelaza.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej i czułej metody ilościowego oznaczania form redoks żelaza.
- Zbadanie znaczenia ilościowego oznaczania żelaza w chorobach neurodegeneracyjnych i nowotworowych.
- Walidacja potencjału ilościowego oznaczania żelaza jako biomarkera uszkodzenia tkanek.
Zastosowane metody
- Elektroforeza kapilarna sprzężona z spektrometrią mas z jonizacją w indukcyjnie sprzężonej plazmie (CE-ICP-MS).
- Przygotowanie próbek z wykorzystaniem własnoręcznie wykonanego zestawu interfejsu.
- Krzywe kalibracyjne dla gatunków redoks żelaza(II) i żelaza(III).
- Analiza lizatu komórek SH-SY5Y w celu pomiaru stężenia żelaza.
Główne wyniki
- Granice wykrywalności wynosiły 3,1 µg/L dla żelaza(II) oraz 3,2 µg/L dla żelaza(III).
- Liniowa odpowiedź była obserwowana do stężenia 150 µg/L.
- Zmierzone stężenia wynosiły 330 µg/L dla żelaza(III) oraz 84 µg/L dla żelaza(II).
- Stosunek żelaza(II) do żelaza(III) wyniósł 0,25.
Wnioski
- Opracowana metoda jest obiecująca w badaniu molekularnych procesów zależnych od żelaza.
- Staranne przygotowanie układu jest kluczowe dla uzyskania dokładnych pomiarów.
- Dalsze badania są niezbędne do zgłębienia roli ilościowego oznaczania żelaza w kontekście chorób.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dokładne ilościowe oznaczenie form redoks żelaza (Fe(II)/Fe(III)) ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia uszkodzeń komórkowych pośredniczących w procesach żelazowych w kontekstach neurodegeneracyjnych i onkologicznych. Metoda CE-ICP-MS umożliwia szybką i czułą detekcję tych form w złożonych macierzach biologicznych, wspierając wczesną weryfikację mechanistyczną hipotez terapeutycznych obejmujących stres oksydacyjny i szlaki ferroptozy. Możliwość ta usprawnia walidację celów poprzez dostarczanie ilościowych, specyficznych dla stanu redoks biomarkerów, służących do selekcji projektów w programach na etapie odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie homeostazy redoks żelaza jako hipotezy terapeutycznej w modelach chorób.
- Wartość operacyjna: Zapewnia specyficzne dla stanu redoks ilościowe odczyty w celu wyjaśnienia mechanizmów szlaków śmierci komórkowej indukowanej przez żelazo.
- Wartość prognostyczna: Wspiera pewność wyboru celu na podstawie biomarkerów poprzez korelację stosunku Fe(II)/Fe(III) ze stresem oksydacyjnym i efektami ferroptozy.
Przesiew i opracowanie testu
- Gotowość analizy: Zapewnia niskie granice wykrywalności (3,1–3,2 µg/L) i odpowiedź liniową do 150 µg/L, co umożliwia wiarygodne oznaczenie ilościowe w rozcieńczonych lizatach i płynach ustrojowych.
- Powtarzalność: Wykazuje precyzję czasu migracji <3% oraz precyzję pomiaru 2,2–3,5%, co gwarantuje spójne wyniki przesiewania związków.
- Skalowalność: Stosowanie stosowania gradientu przewodności i pH (conductivity-pH-stacking) pozwala na zastosowanie większych objętości wstrzykiwanych bez pogorszenia rozdziału, co zwiększa przepustowość walidacji analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia pomiar gatunków redoks żelaza w lizatach komórek SH-SY5Y oraz w płynie mózgowo-rdzeniowym, łącząc etap odkryć z systemami istotnymi dla przebiegu choroby.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Dokładność odzysku (97–105%) oraz potwierdzenie metodą dodatku standardowego wspierają wiarygodną kwantyfikację biomarkerów dla kryteriów go/no-go.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Ułatwia ocenę strategii modulacji żelaza poprzez dostarczenie bezpośrednich odczytów gatunków Fe(II) i Fe(III) w modelach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda CE-ICP-MS integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając specyficznych dla procesów redox danych ilościowych, które stanowią podstawę dla etapów walidacji celu i identyfikacji związku wiodącego, szczególnie w przypadku szlaków obejmujących stres oksydacyjny zależny od żelaza.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących dysregulacji żelaza w modelach nowotworowych i neurodegeneracyjnych poprzez ilościowe oznaczenia z rozdzielczością specjacyjną.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację analizy dzięki niskiej granicy oznaczalności (LOQ) i wysokiej precyzji, co ułatwia wiarygodną ocenę wpływu związków na stany redoks żelaza.
- Analityka: Generuje wyniki ilościowe oparte na powierzchniach pików oraz parametry czasu migracji, które pozwalają na porównania między różnymi warunkami i analizę trendów.
- Badania translacyjne: Łączy się z walidacją przedkliniczną poprzez pomiar gatunków żelaza w lizatach komórkowych i płynach biologicznych, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Detekcja niezależna od platformy za pomocą ICP-MS umożliwia ponowne wykorzystanie metody dla wielu innych pierwiastków poza żelazem, zwiększając jej długoterminową użyteczność.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez rozróżnienie wpływu Fe(II) i Fe(III) na stres oksydacyjny oraz ferroptozę.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki rozdzielaniu wspomaganemu przez tworzenie warstw oraz redukcji zakłóceń w trybie DRC.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie ilościowych biomarkerów redoks powiązanych z patologicznymi stanami żelaza.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich wpływ na specjację żelaza w modelach istotnych dla danej choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w konfiguracji elektroforezy kapilarnej oraz optymalizacji ICP-MS, w szczególności w trybie DRC z użyciem gazu reakcyjnego NH3.
- Zależy od stabilnego montażu interfejsu między kapilarą CE a nebulizatorem w celu zachowania integralności sygnału i zapobiegania przesunięciom redoks.
- Wymaga standaryzacji między zespołami w zakresie parametrów elektrolitu tła (20 mM HCl) i napięcia (+25 kV) w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wymaga adaptacji dla próbek o zmiennej przewodności (np. CSF) z wykorzystaniem metody dodatku standardowego w celu potwierdzenia identyfikacji piku.
- Ograniczenie praktyczne: Podatność metody na efekty matrycowe próbek wymusza rozcieńczenie lub standaryzację dla dokładnego oznaczenia ilościowego w złożonych płynach ustrojowych.
