Name: Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj optymalizację sekwencjonowania RNA z próbek FFPE w neurobiologii i biologii. Ta metoda poprawia jakość i ilość danych ekspresji genów z degradowanych próbek klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni dr Danielle Carrick (Division of Cancer Control and Population Sciences, National Cancer Institute) za nieustającą pomoc, szczególnie za rozpoczęcie tego badania, dostarczenie nam próbek i za pomocne sugestie podczas analizy danych. Serdecznie dziękujemy wszystkim członkom Zakładu Sekwencjonowania CCR w Frederick National Laboratory for Cancer Research za ich pomoc podczas przygotowywania i sekwencjonowania próbek, w szczególności Brendzie Ho za pomoc w kontroli jakości próbek, Oksanie German za kontrolę jakości biblioteki, Tatyanie Smirnovej za uruchomienie sekwencerów. Chcielibyśmy również podziękować Tsai-wei Shen i Ashley Walton z Sequencing Facility Bioinformatics Group za pomoc w analizie danych i wdrożeniu potoku sekwencyjnego RNA. Dziękujemy również CCBR i NCBR za pomoc w opracowaniu procesu analizy RNaseq i najlepszych praktyk.

<ol><li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353(2015).</li>
<li>Hedegaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+RNA+and+DNA+isolated+from+paired+fresh-frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples+of+human+cancer+and+normal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.</a> PLoS One. 9 (5), 98187(2014).</li>
<li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304(2017).</li>
<li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li>
<li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLoS One. 2 (12), 1261(2007).</li>
<li>Esteve-Codina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+RNA-Seq+Results+from+Paired+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+and+Fresh-Frozen+Glioblastoma+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples.</a> PLoS One. 12 (1), 0170632(2017).</li>
<li>Vukmirovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+differentially+expressed+transcripts+by+RNA-sequencing+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+%28FFPE%29+lung+tissue+from+patients+with+Idiopathic+Pulmonary+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15(2017).</li>
<li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li>
<li>Sinicropi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+RNA-Seq+analysis+of+breast+cancer+recurrence+risk+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue.</a> PLoS One. 7 (7), 40092(2012).</li>
<li>Altekruse, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEER+cancer+registry+biospecimen+research%3A+yesterday+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+%26+Prevention%22%5BJournal%5D)">SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+RNA+sequencing+on+older+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+from+high-grade+ovarian+serous+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas.</a> PLoS One. 14 (5), 0216050(2019).</li>
<li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).</li>
<li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li>
<li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA+quality%2C+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh%2C+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351(2018).</li>
<li>Babraham Bioinformatics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2019).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Babraham Bioinformatics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/</a> (2019).</li>
<li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kraken%3A+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), 46(2014).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Broad Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://broadinstitute.github.io/picard/">http://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2019).</li>
<li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSeQC%3A+quality+control+of+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).</li>
<li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiQC%3A+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li>
<li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSEM%3A+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).</li>
<li>Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Guideline+to+Assess+the+Characteristics+of+RNA-Seq+Data%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data.</a> BioMed Research International. 2018, 2906292(2018).</li>
<li>McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+analysis+of+multifactor+RNA-Seq+experiments+with+respect+to+biological+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47(2015).</li>
<li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+set+enrichment+analysis%3A+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li>
<li>Mootha, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC-1alpha-responsive+genes+involved+in+oxidative+phosphorylation+are+coordinately+downregulated+in+human+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes.</a> Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).</li>
<li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+ontology%3A+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016).</li>
</ol>

Praca ta została sfinansowana przez National Cancer Institute (NCI), National Institutes of Health (NIH). Leidos Biomedical Research, Inc. jest wykonawcą operacji i wsparcia technicznego dla Frederick National Laboratory for Cancer Research, które jest w pełni finansowane przez NIH. Kilku autorów (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) jest powiązanych z Leidos Biomedical Research, Inc., ale wszyscy autorzy są w pełni finansowani przez National Cancer Institute, w tym wynagrodzenia autorów i materiały badawcze. Firma Leidos Biomedical Research, Inc. nie zapewniła wynagrodzenia dla autorów (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) ani materiałów do badania, ani nie odegrała żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu danych, analizie, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Opisana tutaj metoda przedstawia główne kroki wymagane do uzyskania dobrych danych sekwencyjnych z próbek FFPE-RNA. Główne punkty, które należy wziąć pod uwagę przy tej metodzie, to: (1) Upewnij się, że RNA jest jak najlepiej zachowane po ekstrakcji, minimalizując obchodzenie się z próbką oraz cykle zamrażania i rozmrażania. Oddzielne podwielokrotności kontroli jakości są bardzo pomocne. (2) Użyj metryki QC, która jest najlepsza dla danego zestawu próbek. Wartości RIN i DV200 często nie są przydatne dla próbek...

Wykorzystanie metod sekwencjonowania nowej generacji umożliwiło nam zebranie bogactwa informacji z różnych typów próbek. Jednak stare i słabo zachowane próbki pozostają nienadające się do wykorzystania w powszechnie stosowanych metodach generowania danych sekwencyjnych i często wymagają modyfikacji dobrze ugruntowanych protokołów. Tkanki FFPE reprezentują taki typ próbki, który jest szeroko stosowany do próbek klinicznych1,2,3. Podczas gdy zachowanie FFPE utrzymuje morfologię tkanek, kwasy nukleinowe w tkankach FFPE zwykle wykazują szeroki zakres uszkodzeń i degradacji, co utrudnia odzyskanie informacji genomicznych, które mogą prowadzić do ważnych spostrzeżeń na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnych zaburzeń.
Dane dotyczące ekspresji genów generowane przez sekwencjonowanie RNA są często pomocne w badaniu mechanizmów choroby i oporności oraz uzupełniają analizę mutacji DNA. Jednak RNA jest bardziej podatne na degradację, co utrudnia generowanie dokładnych danych dotyczących ekspresji genów z tkanek FFPE. Ponadto, ze względu na to, że sekwencjonowanie jest stosunkowo mało dostępne, starsze próbki często nie były przechowywane w warunkach wymaganych do zachowania integralności RNA. Niektóre z problemów związanych z próbkami FFPE obejmują degradację RNA spowodowaną zatopieniem w parafinie, chemiczną modyfikację RNA prowadzącą do fragmentacji lub ogniotrwałości procesów enzymatycznych wymaganych do sekwencjonowania oraz utratę ogonów poli-A, co ogranicza możliwość zastosowania oligo-dT jako startera dla odwrotnej transkryptazy4. Kolejnym wyzwaniem jest obchodzenie się/przechowywanie próbek FFPE w nieoptymalnych warunkach, co może prowadzić do dalszej degradacji labilnych cząsteczek, takich jak RNA w tkankach5. Jest to szczególnie istotne w przypadku starszych próbek, które mogły zostać pobrane w czasie, gdy analiza ekspresji genów za pomocą sekwencjonowania RNA nie była przewidziana dla tych próbek. Wszystko to prowadzi do obniżenia jakości i ilości wyekstrahowanego RNA dostępnego do generowania użytecznych danych sekwencyjnych. Niskie prawdopodobieństwo sukcesu w połączeniu z wysokimi kosztami sekwencjonowania zniechęciło wielu badaczy do prób generowania i analizowania danych dotyczących ekspresji genów z potencjalnie użytecznych próbek FFPE. Niektóre badania przeprowadzone w ostatnich latach wykazały przydatność tkanek FFPE do analizy ekspresji genów2,6,7,8,9, aczkolwiek dla mniejszej liczby i/lub nowszych próbek.
Jako studium wykonalności, użyliśmy RNA wyekstrahowanego z próbek tkanek nowotworowych FFPE z trzech repozytoriów tkanek resztkowych z rejestrów nowotworów nadzoru, epidemiologii i wyników końcowych (SEER) do sekwencjonowania RNA i analizy ekspresji genów10. Pobrane z klinicznych laboratoriów patologicznych tkanki FFPE z surowiczych gruczolakoraków jajników o wysokim stopniu złośliwości przechowywano przez 7–32 lata w różnych warunkach przed ekstrakcją RNA. Ponieważ w większości przypadków bloki te były przechowywane w różnych miejscach przez lata, bez oczekiwania jakiejkolwiek czułej analizy genetycznej w przyszłości, nie podjęto zbyt wielu starań, aby zachować kwasy nukleinowe. W związku z tym większość próbek wykazywała RNA złej jakości, przy czym duża część próbek była zanieczyszczona bakteriami. Niemniej jednak byliśmy w stanie przeprowadzić kwantyfikację genów, zmierzyć jednorodność i ciągłość pokrycia genów oraz przeprowadzić analizę korelacji Pearsona między powtórzeniami biologicznymi w celu zmierzenia odtwarzalności. Opierając się na zestawie kluczowych sygnatur panelu genów, porównaliśmy próbki w naszym badaniu z danymi The Cancer Genome Atlas (TCGA) i potwierdziliśmy, że około 60% próbek miało porównywalne profile ekspresji genów11. Opierając się na korelacji między różnymi wynikami kontroli jakości a metadanymi próbki, zidentyfikowaliśmy kluczowe wskaźniki kontroli jakości, które mają dobrą wartość predykcyjną do identyfikacji próbek, które z większym prawdopodobieństwem wygenerują użyteczne dane sekwencji11.
Tutaj opisujemy metodologię używaną do oceny jakości FFPE-RNA, generowania bibliotek sekwencjonowania zaczynając od pobranych próbek RNA oraz bioinformatycznej analizy danych sekwencjonowania.

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Agilent DNA 7500</td><td>Agilent</td><td>5067-1506</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Agilent DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Agilent RNA 6000 Nano Zestaw</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA FFPE System</td><td></td><td></td> dotykowy Qiagen 80234 <td></td></tr><tr><td>CFX96</td><td>Zestaw</td><td></td> do kwantyfikacji biblioteki Bio-Rad 1855195 <td></td></tr><tr><td>v2-Illumina</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Zestaw do przygotowania biblioteki kierunkowego RNA dla Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7765S</td><td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td></tr><tr><td>NEBNext zestaw do depletion rRNA (człowiek/mysz/szczur)</td><td>Nowa Anglia System sekwencjonowania Biolabs</td><td>E6310L</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1001</td><td>Przewodnik po systemie NextSeq 500: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td></tr><tr><td>Zestaw kontrolny NextSeq PhiX</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3002</td><td></td></tr><tr><td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td><td>Illumina</td><td></td><td></td>20024907</tr><tr><td>10X Genomics Separator magnetyczny</td><td>10X Genomics</td><td>120250</td><td></td></tr><tr><td>Multimixer rotator</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Dotykowy termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników do sekwencjonowania</td><td>Illumina</td><td>20024907</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet komórek</td><td>przepływowych Illumina</td><td>20024907</td><td></td></tr><tr><td>Kartridż buforowy i wkład z odczynnikiem</td><td>Illumina</td><td>20024907</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku sodu (0,2N)</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0607D-6</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCL Bufor 1,0M, pH 7,0</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-151-871</td><td></td></tr></tbody></table>

optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek ffpe-rna

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Analiza ekspresji genów za pomocą sekwencjonowania RNA (sekwencjonowanie RNA) umożliwia unikalny wgląd w próbki kliniczne, które mogą potencjalnie prowadzić do mechanistycznego zrozumienia podstaw różnych chorób, jak również mechanizmów oporności i/lub podatności. Jednak tkanki FFPE, które stanowią najpowszechniejszą metodę zachowania morfologii tkanek w próbkach klinicznych, nie są najlepszymi źródłami do analizy profilowania ekspresji genów. RNA uzyskane z takich próbek jest często zdegradowane, rozdrobnione i modyfikowane chemicznie, co prowadzi do nieoptymalnych bibliotek sekwencjonowania. To z kolei generuje niskiej jakości dane sekwencyjne, które mogą nie być wiarygodne dla analizy ekspresji genów i odkrywania mutacji. Aby jak najlepiej wykorzystać próbki FFPE i uzyskać jak najlepsze dane z próbek niskiej jakości, ważne jest podjęcie pewnych środków ostrożności podczas planowania projektu eksperymentu, przygotowywania bibliotek sekwencjonowania oraz podczas analizy danych. Obejmuje to stosowanie odpowiednich wskaźników do precyzyjnej kontroli jakości próbki (QC), identyfikowanie najlepszych metod dla różnych etapów podczas generowania biblioteki sekwencjonowania oraz staranną kontrolę jakości biblioteki. Ponadto zastosowanie odpowiednich narzędzi programowych i parametrów do analizy danych sekwencji ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji artefaktów w danych sekwencyjnych RNA, odfiltrowania zanieczyszczeń i niskiej jakości odczytów, oceny jednorodności pokrycia genów i pomiaru odtwarzalności profili ekspresji genów wśród kontrprób biologicznych. Etapy te mogą zapewnić wysoką dokładność i powtarzalność profilowania bardzo niejednorodnych próbek RNA. W tym miejscu opisujemy różne etapy kontroli jakości próbki, przygotowania biblioteki i kontroli jakości, sekwencjonowania i analizy danych, które mogą pomóc w zwiększeniu ilości użytecznych danych uzyskanych z RNA niskiej jakości, takich jak te uzyskane z tkanek FFPE-RNA.

Opisaną powyżej metodologię zastosowano do 67 próbek FFPE, które były przechowywane w różnych warunkach przez okres od 7 do 32 lat (mediana czasu przechowywania próbek wynosiła 17,5 roku). Zbiór danych oraz wyniki analiz przedstawione w niniejszym opracowaniu zostały wcześniej opisane i opublikowane w pracy Zhao et al.11. Podczas weryfikacji jakości próbek zgodnie z wcześniejszym opisem (np. przykładowe przebiegi na Rysunku 2), stwierdzono, że parametr DV100</sub...

Ta metoda opisuje kroki mające na celu poprawę jakości i ilości danych sekwencyjnych, które można uzyskać z próbek RNA zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Opisujemy metodologię dokładniejszej oceny jakości próbek FFPE-RNA, przygotowania bibliotek sekwencjonowania i analizy danych z próbek FFPE-RNA.

Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

Nasz protokół może być wykorzystany do poprawy jakości i ilości danych dotyczących ekspresji genów generowanych z próbek RNA pochodzących z FFPE, zwłaszcza w próbkach o nieoptymalnej jakości. Technika ta ocenia jakość RNA w próbkach tkanek FFPE i umożliwia optymalizację ich dalszego przetwarzania w celu poprawy ilości i jakości danych sekwencjonowania próbek. Metoda ta pozwala na kompleksową charakterystykę transkryptu w próbce biologicznej i klinicznej oraz może zapewnić wgląd w funkcjonalne elementy genomu w rozwoju i chorobie.Degradacja FFPE-RNA i wybór metod kontroli jakości próbek, przygotowanie biblioteki i analiza danych mogą być bardzo trudne. Bądź skrupulatny przy wyborze odpowiednich metod i odpowiednich kontroli. Demonstracja wizualna pozwala widzom obserwować drobne subtelne modyfikacje i środki ostrożności potrzebne podczas planowania, oceny i procesu sekwencjonowania, szczególnie w przypadku słabo zachowanych próbek FFPE.Aby sprawdzić jakość próbki RNA, należy uruchomić próbkę w systemie kontroli jakości RNA zgodnie z instrukcjami producenta i użyć odpowiedniego oprogramowania do bioanalizy w celu analizy rozmieszczenia fragmentów RNA w próbce oraz obliczenia proporcji fragmentów dłuższych niż 100 i 200 nukleotydów. Na podstawie wskaźników kontroli jakości zidentyfikuj próbki zawierające mniej niż 40% fragmentów dłuższych niż 100 nukleotydów, aby umożliwić wykluczenie tych próbek z przetwarzania. Do sekwencjonowania należy rozmrozić odpowiednie zestawy odczynników do sekwencjonowania zgodnie z parametrami pracy w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej, a po rozmrożeniu umieścić tackę na odczynniki w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Umieść opakowanie komory przepływowej w temperaturze pokojowej na 30 minut. Gdy pakiet się nagrzewa, otwórz aplikację Illumina Experiment Manager i wybierz Utwórz przykładowy arkusz. Wybierz sekwencer, który ma być używany, i kliknij przycisk Dalej.Wprowadź kod kreskowy zestawu odczynników i inne odpowiednie parametry przepływu pracy. Następnie prześlij przykładowy arkusz utworzony zgodnie z kryteriami sekwencji Illumina. Aby przygotować bibliotekę próbek i bibliotekę kontrolną PhiX, należy denaturować i rozcieńczyć biblioteki do odpowiednich stężeń i wymieszać próbkę i biblioteki kontrolne PhiX, aby uzyskać stosunek objętości kontrolnej 5% PhiX.Gdy komórki przepływowe są gotowe, usuń opakowanie, wyczyść szklaną powierzchnię niestrzępiącą się chusteczką nasączoną alkoholem i osusz szklankę chusteczką laboratoryjną o niskiej zawartości kłaczków. Wyjmij wkład z odczynnikiem z magazynu w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odwróć wkład pięć razy, aby wymieszać odczynniki. Delikatnie postukaj wkładem o stół, aby zredukować pęcherzyki powietrza i załaduj denaturowaną i rozcieńczoną próbkę do wkładu z odczynnikiem w przeznaczonym do tego zbiorniku.Załaduj do systemu celę przepływową, kasetę buforową i kasetę z odczynnikiem. Następnie wykonaj automatyczne sprawdzanie i przejrzyj dane wyjściowe, aby upewnić się, że parametry uruchamiania przechodzą kontrolę systemu. Po zakończeniu automatycznego sprawdzania wybierz pozycję start, aby rozpocząć sekwencjonowanie.Aby zwizualizować wyniki kontroli jakości przed przetwarzaniem i po wyrównaniu, uruchom multi-QC w celu wygenerowania zagregowanego raportu w formacie HTML. Aby określić efekty wsadowe i ocenić mapę jakości danego zestawu danych, użyj skryptu języka R w celu uruchomienia analizy głównych składników. Analizę korelacji próbek można następnie przeprowadzić przy użyciu korelacji Pearsona między różnymi próbkami.Oszacowanie proporcji fragmentów dłuższych niż 100 nukleotydów jest bardziej przydatne niż oszacowanie fragmentów dłuższych niż 200 nukleotydów, ponieważ jest bardziej czułe do dokładnego pomiaru proporcji mniejszych rozmiarów fragmentów dla wysoce zdegradowanych próbek RNA. Biorąc pod uwagę wysoki stopień degradacji w zestawie próbek, zalecana jest metoda przygotowania całkowitej biblioteki RNA. Na przykład tutaj pokazane są biblioteki sekwencjonowania przygotowane z czterech różnych próbek.W tym miejscu przedstawiono przegląd jakości sekwencjonowania plików raw FastQ i przykładową zawartość adaptera. Badania przesiewowe FastQC mogą pomóc w wykryciu zanieczyszczeń, takich jak skażenie bakteryjne lub mysie w próbkach. Wyrównanie STAR może być używane do określenia proporcji odczytów zmapowanych do genomu referencyjnego, procentu odczytów jednoznacznie zmapowanych do genomu referencyjnego oraz proporcji odczytów, które nie zostały zmapowane lub które zostały zmapowane do wielu loci.Statystyki karty i RSeQC można wykorzystać do określenia procentu informacyjnego RNA, zasad intronowych i międzygenowych obecnych w zmapowanych odczytach. Na potrzeby tych reprezentatywnych analiz niektóre zdegradowane biblioteki miały błąd trzech liczb pierwszych, w którym więcej odczytów było mapowanych bliżej trzech liczb pierwszych niż pięciu głównych. Ponadto można przeprowadzić analizę głównych składowych w celu określenia procentu całkowitej zmienności wychwyconej przez główne składniki dla kontrprób biologicznych każdej próbki.Należy zachować ostrożność, aby uniknąć degradacji próbki, przygotować powtórzenia i wiele warstw dla każdej próbki, użyć odpowiednich wskaźników do oceny jakości próbki i użyć właściwej metody przygotowania biblioteki. Korzystając z tej metodologii, można przeprowadzić większe badania NGS na wcześniej bezużytecznych próbkach FFPE o różnym czasie i warunkach przechowywania, aby uzyskać wgląd w różne stany chorobowe. Technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania istniejących, dużych archiwów próbek FFPE z bogatymi informacjami klinicznymi i może znacznie usprawnić populacyjne badania nad rakiem.

optimization-for-sequencing-and-analysis-of-degraded-ffpe-rna-samples

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Próbki zatopione w parafinie w formalinie stanowią cenne źródło molekularnych biomarkerów chorób ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy laboratoryjny protokół przygotowania biblioteki cDNA, początkowo zaprojektowany ze świeżo mrożonym RNA i zoptymalizowany do analizy zarchiwizowanych mikroRNA z tkanek przechowywanych do 35 lat.

Retrospektywne sekwencjonowanie mikroRNA: protokół przygotowania komplementarnej biblioteki DNA przy użyciu próbek RNA zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Ten protokół dostarcza badaczom nowego narzędzia do monitorowania wierności transkrypcji w wielu organizmach modelowych.

Nadzór całego genomu nad błędami transkrypcji w organizmach eukariotycznych

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Oporność na terapię często rozwija się u pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty, a w niektórych przypadkach rak rozwija się do śmiertelnego podtypu zwanego neuroendokrynnym rakiem prostaty. Ocena niewielkich zmian molekularnych za pośrednictwem niekodującego RNA, które ułatwiają to przejście, pozwoliłaby na lepszą stratyfikację choroby i identyfikację mechanizmów przyczynowych, które prowadzą do rozwoju neuroendokrynnego raka gruczołu krokowego.

Sekwencjonowanie małego niekodującego RNA z tkanek utrwalonych formaliną i egzosomów pochodzących z surowicy od pacjentów z opornym na kastrację rakiem prostaty

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (&lt;35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Protokół ten umożliwia początkową kontrolę jakości eksperymentów RNA-seq dla biologów laboratoryjnych z ograniczonym doświadczeniem w bioinformatyce.

Rup (RNA-seq Benchmark Assessment Pipeline) – Kontrola jakości eksperymentów masowych RNA-seq u eukariontów

Poznaj optymalizację sekwencjonowania RNA z próbek FFPE w neurobiologii i biologii. Ta metoda poprawia jakość i ilość danych ekspresji genów z degradowanych próbek klinicznych.

Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA

Przeglądaj więcej filmów