Name: Wyciszanie mikroRNA na bazie wirusa ziemniaka (VbMS) w ziemniakach. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Poznaj metodę wyciszania mikroRNA opartą na wirusa PVX w ziemniakach. System VbMS umożliwia szybką analizę funkcjonalną miRNA bez konieczności stabilnej transformacji roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Yule Liu z Uniwersytetu Tsinghua za dostarczenie wektora PVX-LIC. Prace te były wspierane przez fundusz start-upowy z Texas A&M AgriLife Research oraz Hatch Project TEX0-1-9675 z USDA National Institute of Food and Agriculture do JS.

1. Uprawiaj rośliny ziemniaka.
<ol>
	<li>Rozmnażać rośliny ziemniaka in vitro w probówkach hodowlanych (25 x 150 mm) z pożywką Murashige i Skoog (MS) oraz witaminą Gamborga (mieszanina soli bazalnej MS, witamina Gamborga, sacharoza 30 g/l, agar 3,5 g/l, pH = 5,7). Umieść probówki w pomieszczeniu do wzrostu w temperaturze poniżej 20–22 °C, 16 godzin światła/8 godzin ciemnego fotoperiodu i natężeniu światła 120 μmol/m2∙s1, 
	UWAGA: Nowe pędy i korzenie zwykle rozwijają się z roślin w ciągu 1–2 tygodni. Rozmnażaj rośliny za pomocą świeżych pożywek witaminowych MS/Gamborg co miesiąc.</li>
	<li>Cztery tygodnie później przesadzić rośliny in vitro do gleby i uprawiać je w szklarni w temperaturze 20–22 °C, 16 godzin światła / 8 godzin ciemnego fotoperiodu i natężeniu światła 120 μmol/m2∙s1, 
	UWAGA: Rośliny z nowo rozwiniętymi korzeniami i liśćmi nadają się do przesadzania. Utrzymuj wilgoć dla świeżo przesadzonych roślin przez pierwsze 3-4 dni.</li>
</ol>
2. Skonstruuj wektory VbMS.
<ol>
	<li>Zaprojektuj i sklonuj krótkie tandemowe cząsteczki TM (STTM, <silna klasa="xfig">Rysunek 1)22,53 dla interesującego miRNA. 
	UWAGA: Pozyskaj sekwencje miRNA na podstawie danych eksperymentalnych lub z bazy danych miRbase54,55,56,57,58,59. Sekwencja miR166 użyta w tym badaniu została opisana wcześniej60.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj moduł TM, wstawiając sekwencję niedopasowania, zwykle 5'-CTA-3', do sekwencji odwrotnego dopełniacza miRNA w miejscu odpowiadającym 10-11 nukleotydom miRNA. 
		UWAGA: Na przykład sekwencja Stu-miR160 to 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, gdzie 10-ty-11 nukleotydy są pogrubione. Odwrotna sekwencja dopełniacza (w deoksynukleotydach) to 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3', a miejsce insercji wybrzuszenia niedopasowania jest pogrubione. Sekwencja cząsteczki TM (deoksynukleotyd) powinna wynosić 5'-GGCATACAGG-CTA-G AGCCAGGCA-3'.</li>
		<li>Zaprojektuj podstawy do klonowania fragmentu STTM (Rysunek 1). Użyj oligonukleotydów DNA z sekwencją dystansową 48-nt jako matrycy do klonowania PCR. Starter do przodu składa się z łącznika LIC1 (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), sekwencji przedniej powyższej zaprojektowanej dla cząsteczki TM oraz częściowej sekwencji 5' przekładki 48-nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). Odwrotny starter składa się z łącznika LIC2 (5'-gAggAgAgAgAgCCgT-3'), sekwencji odwrotnego dopełniacza cząsteczki TM i częściowego odwrotnego dopełniacza do sekwencji 3' przekładki 48-nt (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3'). 
		UWAGA: Sekwencja dystansowa 48-nt to 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT-3'. Na przykład dla STTM-miR160 starter do przodu powinien mieć wartość 5'-CgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-G AGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'; starter odwrotny powinien mieć postać 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCT C-TAG-C CTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Amplifikować fragment STTM w objętości 50 μl metodą PCR, używając zsyntetyzowanego uniwersalnego przekładki 48-nt jako matrycy i polimerazy DNA o wysokiej wierności.
		<ol>
			<li>Reakcję PCR należy przeprowadzić mieszając 0,5 μl każdego startera (40 μM), 0,5 μl 48-nt oligo dystansowego (40 μM), 5 μl 10x buforu PCR, 1 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM), 0,1 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności (10 U/μL ) i 43 μl ddH2O do całkowitej objętości 50 μL. Wykonaj standardową amplifikację PCR w następujący sposób: 94 °C przez 3 min, 32 cykle po 94 °C przez 45 s, 60 °C przez 45 s i 72 °C przez 60 s.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oczyść fragment STTM przez wytrącanie etanolu. Dodać 2,5 objętości etanolu i 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH = 4,0) do produktów PCR. Energicznie wymieszać i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i przepłukać osad 1 ml 70% etanolu. Wysuszyć osad i rozpuścić go w 20 μl ddH2O. 
		UWAGA: Użyj elektroforezy DNA, aby sprawdzić amplifikację produktów STTM PCR.</li>
		<li>Ustawić reakcję polimerazy DNA T4 na lodzie, mieszając 2,5 μl oczyszczonego produktu STTM PCR, 0,5 μl 10x buforu polimerazy DNA T4, 0,05 μl 1 M ditiotreitolu (DTT), 0,25 μl 100 mM dATP, 0,1 μl polimerazy DNA T4 (3 U/μL) i 1,6 μL ddH2O do całkowitej objętości 5 μL. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie poddawać produkty działaniu w temperaturze 75 °C przez 20 minut w celu inaktywacji polimerazy DNA T4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj konstrukcję VbMS opartą na PVX.
	<ol>
		<li>Trawić 5 μg plazmidu PVX-LIC 38 z 2,5 μl SmaI (20 U/μL) w objętości 100 μL.</li>
		<li>Dodać równą objętość fenolu:chloroformu:izopropanolu (25:24:1, pH = 6,7/8,0) do strawionych produktów PVX-LIC i energicznie wymieszać. Wirować przy 14 000 x g przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej. Dodać równą objętość chloroformu: izopropanolu (24:1) i energicznie mieszać. Wirować przy 14 000 x g przez 10 min. 
		UWAGA: Wektor PVX-LIC zawiera kasetę LIC do klonowania. Kaseta LIC wektora PVX-LIC zawiera gen ccdB i gen oporności na chloramfenikol i musi być utrzymywana/rozmnażana w szczepie E. coli DB3.1 przy użyciu pożywki LB zawierającej kanamycynę (50 μg/l) i chloramfenikol (15 μg/l).</li>
		<li>Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej. Dodać 2,5 objętości etanolu i 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH = 4,0) i energicznie wymieszać. Odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut i usunąć supernatant.</li>
		<li>Opłucz granulat 1 ml 70% etanolu i energicznie zmieszaj. Odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut i usunąć supernatant. Wysuszyć osad i rozpuścić strawiony plazmid PVX-LIC w 100 μl ddH2O.</li>
		<li>Ustawić reakcję polimerazy DNA T4 na lodzie, mieszając 2,5 μl strawionego DNA wektora PVX-LIC, 0,5 μl 10x buforu polimerazy DNA T4, 0,05 μl 1 M DTT, 0,25 μl 100 mM dTTP i 0,1 μl polimerazy DNA T4 (3 U/μL) w całkowitej objętości 5 μL. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 15 minut i poddawać działaniu produktów leczniczych w temperaturze 75 °C przez 20 minut w celu inaktywacji polimerazy DNA T4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sklonuj sekwencję STTM do wektora PVX-LIC za pomocą reakcji LIC. Wymieszać produkty STTM PCR poddane działaniu polimerazy DNA T4 (5 μl) i plazmidy PVX-LIC poddane działaniu polimerazy DNA T4 (5 μl). Inkubować w temperaturze 70 °C przez 5 minut, schładzać do temperatury 22 °C przy narastaniu 0,1 °C/s i utrzymywać w temperaturze 22 °C przez 30 minut za pomocą maszyny do PCR. 
	UWAGA: Wydłuż czas inkubacji do nocy w temperaturze 4 °C, aby osiągnąć wyższą wydajność klonowania LIC.</li>
	<li>Przekształć 5 μl produktów reakcji LIC w E. coli DH5α i wyhoduj na płytce LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny62,63. Wybierz i zweryfikuj dodatnie kolonie metodą PCR ze starterami klonującymi i uniwersalnym starterem dla wektora PVX-LIC, a następnie sekwencjonuj.
	<ol>
		<li>Przeprowadzić PCR kolonii ze starterem do przodu dla PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') w połączeniu ze starterem odwrotnym do klonowania STTM w celu identyfikacji klonów z dodatnim wynikiem testu. Rozmiar pasma PCR powinien wynosić ~300 bp. 
		UWAGA: Sprawdź sekwencje fragmentów STTM za pomocą sekwencjonowania cyklu terminatora64,65.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyizoluj plazmidy PVX-STTM od zwalidowanych klonów i przekształć je w szczepy Agrobacterium GV3101, GV2260 lub EHA10562,63. Zweryfikuj kolonie Agrobacterium za pomocą PCR. 
	UWAGA: Potwierdź kolonie Agrobacterium metodą PCR, używając startera do przodu dla PVX-LIC i startera odwrotnego do klonowania STTM.</li>
</ol>
3. Wykonaj test VbMS oparty na PVX w roślinach ziemniaka.
<ol>
	<li>Przeszczep 4-tygodniowe rośliny ziemniaka in vitro do gleby. Przesadzone rośliny zostaną poddane testowi VbMS 3–4 dni później.</li>
	<li>Zaszczepić rośliny ziemniaka Agrobacterium zawierającym plazmidy PVX-STTM. 
	UWAGA: W przypadku testu VbMS w ziemniakach infiltracja za pośrednictwem Agrobacterium i inokulacja drapaniem wykałaczką są wykonywane jednocześnie.
	<ol>
		<li>Pobrać i zaszczepić dodatnie transformanty zawierające wektory PVX-STTM w 50 ml płynnego LB zawierającego 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny. Hodować w inkubatorze o temperaturze 28 °C przy prędkości obrotowej 220 obr./min przez 16 godzin, aż OD600 = 1,0.</li>
		<li>W tym samym czasie umieść dodatnie kolonie Agrobacterium na co najmniej dwóch nowych płytkach LB zawierających 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny i rosnąć w temperaturze 28 °C przez 1 dzień. Uwzględnij wektor PVX-LIC38,66 jako kontrolę, a PVX-GFP67,68 do monitorowania rozprzestrzeniania się wirusa.</li>
		<li>Zebrać płynną kulturę Agrobacterium przez odwirowanie przy 3 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki Agrobacterium z równą objętością buforu infiltracyjnego (10 mM MgCl2, 10 mM MES i 200 μM acetosyringonu, pH = 5,6) i dostosować do OD600 = 1,0. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 6 godzin.</li>
		<li>Naciekać kulturę Agrobacterium do abaksjalnej strony w pełni rozwiniętych liści za pomocą 1 ml strzykawki bezigłowej.
		<ol>
			<li>Odwróć i przytrzymaj liść jedną ręką, a następnie jednym palcem podeprzyj blaszkę liścia od strony adaksjalnej w miejscu infiltracji. Drugą ręką trzymać strzykawkę pionowo do powierzchni liścia i infiltrować kulturę Agrobacterium do aosialnej strony blaszki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zeskrob kulturę Agrobacterium z płytek LB i podrap powierzchnię łodygi pierwszego lub dwóch międzywęźli naciekanych roślin ziemniaka wykałaczką. Delikatnie podrap naskórek łodygi. Unikaj przebijania łodygi, ponieważ może to spowodować poważne uszkodzenie roślin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Infiltrowane rośliny uprawiać w temperaturze 22 °C przy 16 h światła/8 h ciemnym fotoperiodzie i natężeniu światła 120 μmol/m2∙ s1 w szklarni. 
	UWAGA: Fenotypy spowodowane wyciszeniem miRNA zwykle pojawiają się w ciągu 2-4 tygodni po inokulacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3). Zwykle potrzeba 10-20 dni, aby fenotyp VbMS pojawił się po infiltracji. Fenotyp VbMS zależy od właściwości specyficznego miRNA i genów docelowych, warunków wzrostu i odmian ziemniaka.</li>
</ol>
4. Wykonaj analizę wyrażeń.
<ol>
	<li>Kiedy fenotypy pojawiają się po 2-4 tygodniach od inokulacji, zbierz nożyczkami tkanki, takie jak pędy, liście, kwiaty lub korzenie z fenotypami z roślin VbMS i tkanki z roślin kontrolnych. Wyizolować całkowite RNA z pobranych tkanek.</li>
	<li>Sprawdź jakość RNA za pomocą elektroforezy62,63 i określ ilościowo stężenie RNA, mierząc absorbancję OD260 za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Użyj pętli macierzystej z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym PCR (RT-PCR) do analizy ekspresji miRNA.
	<ol>
		<li>W przypadku określonych miRNA zaprojektuj starter odwrotnej transkrypcji w pętli macierzystej. Startery RT z pętlą macierzystą zawierają uniwersalny szkielet 5' i przedłużenie 3' 6-nt specyficznego miRNA. Zaprojektuj uniwersalny szkielet 5' (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3'), który tworzy strukturę pętli macierzystej. (Wielka litera odpowiada odwrotnej sekwencji powtórzonej, a mała litera obszarowi pętli).</li>
		<li>Część sekwencji szkieletowej 5', która tworzy pętlę, służy jako odwrotny starter do późniejszej amplifikacji PCR (sekwencja pogrubiona kursywą w sekwencji szkieletowej). Dodaj sekwencję przedłużenia 6-nt, która jest odwrotnie komplementarna do końca 3' miRNA będącego przedmiotem zainteresowania do startera pętli macierzystej, aby zapewnić swoistość dla odwrotnej transkrypcji (rysunek uzupełniający 1A). 
		UWAGA: Zaprojektuj elementarz odwrotnej transkrypcji pętli rdzenia zgodnie z opisem Chen et al.69 i Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Na przykład starter odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej dla Stu-miR160 został zaprojektowany jako 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC, GGCATA-3'. Starter odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej dla rodziny ziemniaków miR165/166 został zaprojektowany jako 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAGAC, GGGG(A/G)A-3'. (Pogrubione sekwencje wielkich liter zapewniają specyficzność odwrotnej transkrypcji dla określonych miRNA).</li>
		<li>Ustaw reakcję odwrotnej transkrypcji, mieszając 50–200 ng całkowitego RNA, 1 μl startera odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej (100 μM), 2 μl buforu 10x, 0,2 μl inhibitora RNazy (40 U/μL), 0,25 μl dNTP (10 mM każdy) i 1 μl odwrotnej transkryptazy (200 U/μL) na lodzie. Dodać ddH2O bez nukleaz do całkowitej objętości 20 μl.</li>
		<li>Wykonaj odwrotną transkrypcję przy użyciu procedury pulsacyjnej odwrotnej transkrypcji. Inkubować mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji w temperaturze 16 °C przez 30 minut, przeprowadzać cykl temperaturowy 30 °C przez 30 s, 42 °C przez 30 s i 50 °C przez 1 s, w sumie 60 cykli, a następnie dezaktywować odwrotną transkryptazę przez inkubację w temperaturze 85 °C przez 5 minut.</li>
		<li>W przypadku analizy ekspresji miRNA PCR w czasie rzeczywistym, zaprojektuj starter do przodu na podstawie sekwencji miRNA, ale nie uwzględniaj sekwencji, które pokrywają się z wyżej zaprojektowanym starterem odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej. Dodaj przedłużenie 3–7-nt do 5' przedniego startera, aby zoptymalizować długość, temperaturę topnienia i zawartość GC (rysunek uzupełniający 1). 
		UWAGA: Uniwersalny podkład odwrotny to 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Na przykład starter odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej dla Stu-miR160 został zaprojektowany jako 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. Starter odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej dla rodziny miR165/166 to 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Pogrubione sekwencje służą jako 5-calowe przedłużenia do optymalizacji podkładu. Startery odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej i startery PCR w czasie rzeczywistym dla miRNA można zaprojektować za pomocą narzędzia do projektowania starterów miRNA73.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zsyntetyzuj cDNA docelowych mRNA za pomocą standardowej PCR Z ODWROTNĄ TRANSKRYPCJĄ (RT-PCR). Inkubować mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji w temperaturze 37 °C przez 60 minut i inaktywować odwrotną transkryptazę przez ogrzewanie do 85 °C przez 5 min. 
	UWAGA: (1) Przewiduj docelowe mRNA za pomocą psRNATarget program74, jeśli docelowe mRNA nie są znane. (2) Uniwersalnym starterem odwrotnej transkrypcji dla mRNA jest zakotwiczony starter 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'.</li>
	<li>Ustaw reakcję PCR w czasie rzeczywistym zarówno dla miRNA będącego przedmiotem zainteresowania, jak i docelowych mRNA. Wymieszaj 0,5 μl matrycy cDNA, 5 μl 2x buforu PCR w czasie rzeczywistym z zielenią SYBR, 0,05 μl każdego startera do przodu i do tyłu (40 μM) i 4,4 μl ddH2O w całkowitej objętości 5 μL na lodzie.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 3 s i w temperaturze 60 °C przez 30 s. Przeprowadzić następującą analizę krzywej topnienia w następujący sposób: Inkubować w temperaturze 95 °C przez 15 s, schładzać do temperatury 60 °C przy rampie 20 °C/s, utrzymywać w temperaturze 60 °C przez 60 s, podgrzać do 95 °C z prędkością 0,2 °C/s i utrzymywać w temperaturze 95 °C przez 15 s. Przeanalizuj wartościC t za pomocą metod ΔΔCt76,77 i wykreśl średnie z błędami standardowymi. 
	UWAGA: (1) Startery PCR w czasie rzeczywistym dla docelowych mRNA można zaprojektować zgodnie z opisem75. (2) Gen poliubikwityny 10 ziemniaka może służyć jako wewnętrzna kontrola normalizacji w ziemniakach. Starterem do przodu dla genu poliubikwityny ziemniaka 10 jest 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGGGTTG-3', a starterem odwrotnym 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) W przypadku analizy PCR w czasie rzeczywistym, zanieczyszczenie i tworzenie się dimerów starterów może generować fałszywie dodatnie wyniki. Aby monitorować niespecyficzną amplifikację i zwiększyć odpowiedzialność analizy PCR w czasie rzeczywistym, zaleca się włączenie kontroli bez matrycy i odwrotnej transkryptazy do testów PCR w czasie rzeczywistym.</li>
</ol>

Przedstawiamy system wyciszania miRNA oparty na PVX w celu scharakteryzowania funkcji endogennych miRNA w ziemniaku poprzez integrację projektu STTM z wektorem PVX. System VbMS okazał się skuteczny w wyciszaniu miRNA165/166 w ziemniakach, wysoce konserwatywnej rodzinie miRNA u różnych gatunków roślin.
Podejście TM zostało opracowane w celu zakłócania ekspresji miRNA w oparciu o sztuczną mimikę docelową miRNA, która ma na celu stworzenie pętli niedopasowania w oczekiwanym miejscu cięcia w sekwe...

MikroRNA roślinne (miRNA) są charakteryzowane jako RNA regulacyjne o długości 20–24 nukleotydów, kodowane jądrowo1 i odgrywają fundamentalne role w prawie każdym aspekcie procesów biologicznych roślin, w tym we wzroście i rozwoju2,3, fotosynteza i metabolizm4,5,6,7, synteza i sygnalizacja hormonów8,9, odpowiedzi biotyczne i abiotyczne10,11,12,13, oraz regulacja składników odżywczych i energii14,15. Regulacyjne role roślinnych miRNA są dobrze zaprogramowane i spełniane zazwyczaj na poziomach potranskrypcyjnych poprzez rozszczepianie lub translacyjną tłumienie docelowych mRNA.
Ogromny postęp został poczyniony w kierunku identyfikacji, profilowania transkrypcyjnego i przewidywania docelowego miRNA w potatoto16,17,18,19,20,21. Jednak funkcjonalna charakterystyka miRNA w roślinach, w tym ziemniakach, pozostaje w tyle za innymi organizmami ze względu na brak wydajnych i wysokoprzepustowych podejść genetycznych. Przeprowadzenie analizy funkcjonalnej poszczególnych miRNA za pomocą standardowej analizy utraty funkcji jest trudne, ponieważ większość miRNA należy do rodzin o znacznej redundancji genetycznej22. Ponadto pojedyncze miRNA może kontrolować wiele docelowych genów23, a kilka różnych miRNA może wspólnie modulować ten sam szlak molekularny24,25. Właściwości te utrudniają scharakteryzowanie funkcji konkretnego miRNA lub rodziny miRNA.
Znaczna część analizy funkcjonalnej miRNA opierała się głównie na podejściach opartych na wzmocnieniu funkcji, które mają oczywiste ograniczenia. Metoda sztucznego miRNA (amiRNA) wykorzystuje endogenne pierwotne transkrypty (pri-miRNA) do produkcji miRNA na wysokim poziomie, co prowadzi do zahamowania ekspresji genów docelowych26,27,28,29. Jednak znakowanie aktywacji i nadekspresja miRNA przy użyciu silnego konstytutywnego promotora 35S często prowadzą do zwiększonej ekspresji miRNA, które nie są reprezentatywne dla warunków in vivo, a zatem mogą nie odzwierciedlać endogennej funkcji miRNAs30. Opracowano alternatywne podejście polegające na ekspresji opornych na miRNA form docelowych genów, które zawierają mutacje nietryskające w miejscach wiązania i/lub cięcia31,32,33. Ale takie podejście może również potencjalnie powodować błędną interpretację fenotypu pochodzącego z opornego na miRNA docelowego transgenu z powodu artefaktów transgenicznych. Dlatego wnioski z tych badań nad wzmocnieniem funkcji powinny być wyciągane z ostrożnością34. Innym poważnym ograniczeniem wyżej opisanych podejść jest to, że wymagają one transformacji, która jest pracochłonna i czasochłonna. Co więcej, podejścia zależne od transgenu prawie nie mają zastosowania w przypadku opornych na transformację gatunków roślin. Dlatego konieczne jest opracowanie szybkiego i skutecznego podejścia do utraty funkcji, aby rozwikłać funkcję miRNA.
Aby ominąć warunek wstępny procedury transformacji, ustanowiono wyciszanie mikroRNA oparte na wirusach (VbMS) poprzez połączenie strategii naśladownictwa docelowego (TM) z wektorami pochodzącymi od wirusa. W systemie VbMS sztucznie zaprojektowane cząsteczki TM są przejściowo eksprymowane ze szkieletu wirusa, oferując potężne, wysokowydajne i oszczędzające czas narzędzie do analizy funkcji roślinnych endogennych miRNAs35,36. VbMS został początkowo opracowany u N. benthamiana i pomidora z wirusem grzechotki tytoniu (TRV)35,36,37 i został rozszerzony na Arabidopsis, bawełnę, pszenicę i kukurydzę przy użyciu różnych innych systemów ekspresji wirusa, w tym wirusa ziemniaka X (PVX)38, wirus zgniotu liści bawełny (ClCrV)39, wirus mozaiki ogórka (CMV)40,41,42, chiński wirus mozaiki pszenicy (CWMV)43, oraz wirus mozaiki prążkowanej jęczmienia (BSMV)44,45.
Ziemniak (Solanum tuberosum) jest czwartą najważniejszą rośliną spożywczą i najczęściej uprawianą rośliną niezbożową na świecie, głównie ze względu na jej wysoką wartość odżywczą, wysoką produkcję energii i stosunkowo niskie wymagania dotyczące wkładu46. Kilka cech ziemniaka sprawia, że jest to atrakcyjna roślina modelowa dwuliścienna. Jest to rozmnażana wegetatywnie roślina poliploidalna o wysokim współczynniku krzyżowania, heterozygotyczności i różnorodności genetycznej. Jednak do tej pory nie ma raportu charakteryzującego funkcję miRNA w ziemniaku za pomocą VbMS. W tym miejscu przedstawiamy podejście VbMS oparte na PVX do klonowania niezależnego od ligacji (LIC) do oceny funkcji miRNA w roślinach ziemniaka38. Wybraliśmy rodzinę miR165/166, aby zilustrować test VbMS, ponieważ rodzina miR165/166 i ich docelowe mRNA oraz czynniki transkrypcyjne homeodomeny/zamka błyskawicznego Leu klasy III (HD-ZIP III) zostały szeroko scharakteryzowane22,47,48. Geny HD-ZIP III są kluczowymi regulatorami rozwoju merystemu i polaryzacji narządów, a supresja funkcji miR165/166 prowadzi do zwiększonej ekspresji genów HD-ZIP III, co skutkuje pleotropowymi wadami rozwojowymi, takimi jak zmniejszona dominacja wierzchołkowa i nieprawidłowe wzorce polaryzacji liści22,35,38,41. Łatwe do wykrycia fenotypy rozwojowe skorelowane z wyciszeniem miRNA165/166 umożliwiają dokładną ocenę skuteczności testu VbMS opartego na PVX.
W tym badaniu wykazujemy, że system VbMS oparty na PVX może skutecznie blokować funkcję miRNA w ziemniakach. Ponieważ system wyciszania genów indukowany wirusem (VIGS) oparty na PVX został ustanowiony w wielu odmianach ziemniaka49,50,51,52, to podejście VbMS oparte na PVX może być prawdopodobnie zastosowane do szerokiego zakresu diploidalnych i tetraploidalnych gatunków ziemniaków.

<table><tbody><tr><td>100 &mikro; M dATP oraz 100 &mikro; M dTTP</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3 M octan sodu, pH 4,0.</td><td>Teknova, Hollister, CA 95023, USA</td><td></td><td></td></tr>#S0297 <tr><td>Acetosyringone</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>Szczepy Agrobacterium tumefaciens: GV3101, GV2260 lub EHA105.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek Dimethyl, DMSO</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DB3.1</td><td></td><td></td><td>do utrzymania PVX-LIC i pTRV2e zawierających gen ccdB</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha;</td><td></td><td></td><td>dla konstruktów docelowych generowanych przez klonowanie LIC</td></tr><tr><td>Nawóz: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td><td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do PCR o wysokiej wierności: Polimeraza DNA KAPA HiFi z dNTP</td><td>Sekwencjonowanie Roche i nauki przyrodnicze, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA</td><td>7958960001</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol</td> <td>izoamylowyVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, Stany Zjednoczone</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Czysty etanol &ndash; 200 Proof</td><td>Decon Labs, Król Prus, PA 19406 , USA</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, Stany Zjednoczone</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza</td> <td>M-MuLVNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr nanokroplowy: NanoDrop OneC Mikroobjętościowy spektrofotometr UV-Vis z Wi-Fi</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA Maszyna</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>PCR: Bio-Rad MyCycler PCR System</td><td>Bio-Rad, Hercules, Kalifornia 94547, USA</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do PCR: Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, Stany Zjednoczone</td><td>950030010</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA</td><td>Laboratoryjny miernik pH / mV - 860031</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1), pH 6,7/8,0.</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, Stany</td><td>Zjednoczone VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>Fitagel: Gellan Gum</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX Grafika wektorowa: PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao i wsp., 2016</td></tr><tr><td>Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do REAL-TIME PCR: KAPA, SYBR&REG; Zestaw FAST qPCR Master Mix (2x)</td><td>Roche Sekwencjonowanie i nauki przyrodnicze, Kapa Biosystems, Wilmington, MA 01887, USA</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny: SmaI</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do odwrotnej transkrypcji: qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877, USA</td><td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji RNA: E.Z.N.A. Roślinne RNA Zestaw</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , Stany Zjednoczone</td><td>SKU: D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>Mysi inhibitor RNazy</td><td>Nowa Anglia BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>Gleba: Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polimeraza DNA i bufor</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

wyciszanie mikrorna na bazie wirusa ziemniaka (vbms) w ziemniakach.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Wyciszanie mikroRNA oparte na wirusach (VbMS) jest szybkim i skutecznym narzędziem do funkcjonalnej charakterystyki mikroRNA (miRNA) u roślin. System VbMS został opracowany i zastosowany w przypadku różnych gatunków roślin, w tym Nicotiana benthamiana, pomidora, Arabidopsis, bawełny i roślin jednoliściennych, takich jak pszenica i kukurydza. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół wykorzystujący wektory VbMS oparte na PVX do wyciszania endogennych miRNA w ziemniakach. Aby obniżyć ekspresję specyficznego miRNA, projektuje się docelowe cząsteczki mimiczne (TM) interesującego miRNA, integruje się je z wektorami wirusów roślinnych i ulegają ekspresji w ziemniaku przez infiltrację Agrobacterium, aby związać się bezpośrednio z endogennym miRNA będącym przedmiotem zainteresowania i zablokować jego funkcję.

Rysunek 2 przedstawia rośliny ziemniaka (odmiana Katahdin) PVX-STTM165/166 z ektopowym wzrostem tkanek liściowych od strony abaksjalnej blaszki liściowej wzdłuż żyłek. Zaobserwowano również cięższe fenotypy, takie jak formowanie się liści w kształcie trąbek. W przeciwieństwie do nich, w roślinach kontrolnych PVX nie zaobserwowano żadnych anomalii fenotypowych. Wyniki te pokazują, że system VbMS był skuteczny w tłumieniu funkcji endogennych miRNA w tetraploidalnych roślinach ziemniaka, a syst...

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla systemu wyciszania mikroRNA (VbMS) opartego na wirusie ziemniaka X (PVX), aby funkcjonalnie scharakteryzować endogenne mikroRNA (miRNA) u ziemniaka. Docelowe cząsteczki mimiczne (TM) interesującego nas miRNA są integrowane z wektorem PVX i przejściowo ulegają ekspresji w ziemniakach w celu wyciszenia docelowego miRNA lub rodziny miRNA.

Wyciszanie mikroRNA na bazie wirusa ziemniaka (VbMS) w ziemniakach.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

Tradycyjne podejście do analizy funkcji mikroRNA w roślinach opiera się przede wszystkim na generowaniu stabilnych roślin knockdown. Ten oparty na wirusach system wyciszania mikroRNA nie wymaga żmudnej i czasochłonnej transformacji. Wyciszanie mikroRNA na podstawie wirusów jest szybkim i skutecznym narzędziem do funkcjonalnej charakterystyki mikroRNA w roślinach, które można zastosować do szerokiej gamy diploidalnych i tetraploidalnych gatunków ziemniaków.Procedurę zademonstruje Jinping Zhao, adiunkt z mojego laboratorium. Aby zaprojektować docelowy moduł mimiczny należy wstawić sekwencję niedopasowania do sekwencji odwrotnego dopełniacza interesującego mikroRNA w miejscu odpowiadającym 10. do 11. nukleotydom mikroRNA. Aby amplifikować krótki tandemowy fragment mimiczny celu, należy przeprowadzić reakcję PCR z każdym interesującym starterem, 48-nukleotydowym oligonem przestrzennym, 10-krotnym buforem PCR, mieszaniną dNTP, polimerazą DNA PCR o wysokiej wierności i podwójnie destylowaną wodą do końcowej objętości 50 mikrolitrów.Następnie amplifikuj mikroRNA za pomocą standardowego PCR, używając parametrów zgodnie ze wskazaniami. Aby oczyścić krótkie naśladujące cele tandemowe, dodaj 2,5 objętości etanolu i 1/10 objętości trzech molowych octanu sodu do produktu PCR. Mieszać energicznie przed odwirowaniem reakcji w temperaturze 14 000 razy G przez 10 minut.Po usunięciu supernatantu przepłukać osad jednym mililitrem 70% etanolu i pozostawić osad do wyschnięcia, a następnie rozpuścić osad w 20 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. Aby wywołać reakcję polimerazy DNA T4, wymieszaj oczyszczony krótki tandemowy produkt naśladujący PCR z 10-krotnym buforem polimerazy DNA T4, jednym molowym ditiotreitolem, 100-milimolowym dATP, polimerazą DNA T4 i podwójnie destylowaną wodą do końcowej objętości pięciu mikrolitrów na lodzie. Następnie inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie 20-minutową inkubację w temperaturze 75 stopni Celsjusza w celu dezaktywacji polimerazy DNA T4.Aby przygotować konstrukt VBMS oparty na PVX, należy przetrawić pięć mikrogramów plazmidów klonujących niezależnych od ligacji PVX z 2,5 mikrolitrami SMA1 w całkowitej objętości 100 mikrolitrów. Dodać równą objętość fenolu do chloroformu i alkoholu izoamylowego, dodać proporcje 25 do 24 do jednego do jednego do strawionych produktów klonowania niezależnych od ligacji PVX z energicznym mieszaniem i zebrać produkt przez odwirowanie. Dodać równą objętość chloroformu do alkoholu izoamylowego w stosunku 24 do jednego do supernatantu z wirowaniem przed poddaniem zawartości probówki drugiemu odwirowaniu.Pod koniec wirowania przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej i dodać 2,5 objętości etanolu i 1/10 objętości trzymolowego octanu sodu energicznie mieszając. Odwirować probówkę i przepłukać granulat jednym mililitrem 70% etanolu i energicznie wirować. Ponownie odwirować probówkę i usunąć supernatant, aby osad mógł wyschnąć na powietrzu.Następnie rozpuść strawiony niezależny od ligacji PVX osad plazmidu klonującego w 100 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. Aby uruchomić reakcję polimerazy DNA T4, wymieszaj strawione DNA wektora klonowania niezależnego od ligacji PVX z 10-krotnym buforem polimerazy DNA T4, jednym molowym ditiotreitolem, 100 milimolowym dTTP i polimerazą DNA T4 do końcowej objętości pięciu mikrolitrów na lodzie. Następnie inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie 20-minutową inkubację w temperaturze 75 stopni Celsjusza w celu dezaktywacji polimerazy DNA T4.Aby sklonować krótką sekwencję mimiczną celu w tandemie do niezależnego wektora klonowania ligacji PVX, wymieszaj pięć mikrolitrów krótkiego tandemowego docelowego produktu naśladującego PCR poddanego działaniu polimerazy DNA T4 z pięcioma mikrolitrami plazmidu klonującego niezależnego od ligacji ligacji PVX polimerazy DNA T4 i inkubuj mieszaninę przez pięć minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji schłodzić zawartość probówki do 22 stopni Celsjusza w maszynie do PCR z szybkością 0,1 stopnia Celsjusza na sekundę, pozostawiając probówkę w termocyklerze na 30 minut po osiągnięciu temperatury docelowej. Pod koniec inkubacji przekształć pięć mikrolitrów produktu reakcji klonowania niezależnego od ligacji w E.coli DH5 alfa przy użyciu standardowych protokołów transformacji i hoduj przekształcone bakterie na płytce LB zawierającej 50 mikrogramów na mililitr kanamycyny.Po zweryfikowaniu sekwencji krótkich fragmentów mimicznych celu w tandemie za pomocą sekwencjonowania cyklu terminatora, należy wyizolować plazmidy PVX VBMS z zwalidowanych klonów i przekształcić je w odpowiednie szczepy Agrobacterium. Aby zaszczepić czterotygodniowe rośliny ziemniaka in vitro Agrobacterium zawierającym plazmidy PVX VBMS, wybierz dodatnie transformanty zawierające wektory PVX VBMS i zaszczep transformanty w 50 mililitrach płynnego LB zawierającego 50 mikrogramów na mililitr kanamycyny i 50 mikrogramów na mililitr ryfampicyny przez 16 godzin w temperaturze 28 stopni Celsjusza i 220 obrotach na minutę. Podczas inkubacji należy umieścić dodatnie kolonie Agrobacterium na co najmniej dwóch nowych płytkach LB zawierających kanamycynę i ryfampicynę i hodować kultury w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez jeden dzień.Gdy gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 1,0, zbierz płynną kulturę Agrobacterium przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w wystarczającej objętości bufora infiltracyjnego, aby dostosować gęstość optyczną przy 600 nanometrach do 1,0. Po sześciogodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej załaduj jednomililitrową strzykawkę bezigłową zawiesiną Agrobacterium i jedną ręką odwróć i przytrzymaj rozszerzony liść z jednej rośliny ziemniaka. Za pomocą jednego palca podeprzyj blaszkę liścia od strony przyosiowej w pożądanym miejscu naciekania.Trzymając strzykawkę pionowo do powierzchni liścia drugą ręką, naciekaj od 100 do 200 mikrolitrów kultury Agrobacterium do aosialnej strony blaszki. Następnie za pomocą wykałaczki zbierz kolonie z płytek kulturowych Agrobacterium i zarysuj powierzchnię łodygi pierwszego lub dwóch międzywęźli naciekanych roślin ziemniaka i naskórka łodygi, a następnie hoduj naciekane rośliny w szklarni przez dwa do czterech tygodni. Kiedy pojawią się fenotypy, użyj nożyczek, aby pobrać próbki z fenotypami z VBMS i roślin kontrolnych.Wyizoluj całkowite RNA z pobranych tkanek i użyj PCR z odwrotną transkryptazą do analizy mikroRNA i docelowej ekspresji mRNA w każdej próbce. Na tych zdjęciach można zaobserwować krótki tandem naśladujący rośliny ziemniaka 165/166 z ektopowym wzrostem tkanek liści od strony aosialnej blaszki liściowej wzdłuż nerwów. Zaobserwowano również poważniejsze fenotypy, takie jak tworzenie się liści w kształcie trąbki.W przeciwieństwie do tego, nie obserwuje się żadnych nieprawidłowości fenotypowych w roślinach kontrolnych PVX, co pokazuje, że system VBSM jest skuteczny w tłumieniu endogennej funkcji mikroRNA w tetraploidalnych roślinach ziemniaka. Rośliny ziemniaka PVX short tandem naśladują 165/166 rośliny ziemniaka ektopowego wzrostu liści do tkanek od strony aosialnej blaszki liściowej wzdłuż nerwów blaszki, co pokazuje, że system PVX VBMS może być stosowany do innych odmian ziemniaków, w tym głównych odmian ziemniaka. Konieczne jest jednoczesne infiltrowanie liści i zaszczepienie łodygi tej samej rośliny tą samą kulturą Agrobacterium.Transgeniczne podejścia do stabilnego wprowadzania docelowych cząsteczek mimicznych do roślin ziemniaka są zalecane, gdy stan wyciszenia docelowych mikroRNA musi być utrzymany w pokoleniach potomstwa.

potato-virus-x-based-microrna-silencing-vbms-in-potato

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opis metody wyciszania genów indukowanego wirusem (VIGS) w celu obniżenia ekspresji genów u Nicotiana benthamiana oraz pomidora.

Wyciszanie genów indukowane wirusem (VIGS) u Nicotiana benthamiana i pomidora

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Opisano metodę analizy dostępności rozpuszczalnika grupy tiolowej reszt cysteinowych wirusa Maize rayado fino virus (MRFV) - wirusopodobnych cząstek (VLP), po których następuje reakcja sieciowania peptydów. Metoda wykorzystuje dostępność kilku grup chemicznych na powierzchni VLP, które mogą być celami dla określonych reakcji.

Analiza dostępności rozpuszczalników reszt cysteiny na cząstkach wirusopodobnych wirusa rayado fino kukurydzy wytwarzanych w roślinach Nicotiana benthamiana i sieciowanie peptydów z VLP

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX to rutynowe testy funkcjonalne dla przejściowej ektopowej ekspresji genów w roślinach. Metody te są skutecznymi testami w strategiach efektoromicznych (szybkie odkrywanie genów oporności i wirulencji) i mają kluczowe znaczenie dla nowoczesnych badań w zakresie molekularnej patologii roślin. Spełniają one zapotrzebowanie na solidną, wysokowydajną analizę funkcjonalną w zakładach.

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX u ziemniaka i Nicotiana benthamiana

Wyciszanie genów wywołane przez wirusa jest użytecznym narzędziem do identyfikacji genów zaangażowanych w odporność roślin na brak gospodarza. Pokazujemy zastosowanie patogenów bakteryjnych eksprymujących GFPuv w identyfikacji roślin wyciszonych genowo podatnych na patogeny niebędące gospodarzem. Takie podejście jest łatwe, szybkie i ułatwia badania przesiewowe na dużą skalę, a podobny protokół można zastosować do badania różnych innych interakcji roślina-mikroorganizm.

Badania przesiewowe genetyki za pośrednictwem VIGS w celu identyfikacji genów zaangażowanych w oporność na zwierzęta inne niż gospodarz

Opisujemy tutaj metodę regulacji tropizmu picornawirusa poprzez włączenie sekwencji komplementarnych do określonych mikroRNA do genomu wirusa.  Protokół ten można dostosować do wszystkich różnych klas wirusów, wprowadzając modyfikacje w zależności od długości i charakteru ich cyklu życia.

Regulacja tropizmu pikornawirusa w oparciu o mikroRNA

Tutaj prezentujemy dwa protokoły przekształcania roślin ziemniaka. Transformacja Agrobacterium tumefaciens prowadzi do kompletnej rośliny transgenicznej, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes wytwarza transgeniczne owłosione korzenie w pędach typu dzikiego, które mogą się samodzielnie rozmnażać. Następnie wykrywamy aktywność promotora poprzez barwienie GUS w przekształconych korzeniach.

Przemiana ziemniaka w ziemniaku za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes oraz aktywność promotorowa genu suberyny przez barwienie GUS

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę przesiewową, która może być szeroko stosowana do szybkiego badania przesiewowego supresorów wyciszających RNA u patogenów roślinnych.

Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych

Ta metoda demonstruje użycie techniki północnej hybrydyzacji do wykrywania miRNA z całkowitego ekstraktu RNA.

Analiza plam RNA w celu wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin

Przedstawiono protokół iniekcji (agroiniekcji) oparty na Agrobacterium do inokulacji wirusa mozaiki czyńca i klonów wirusa mozaiki trzciny cukrowej do siewek kukurydzy. Inokulacja w ten sposób prowadzi do infekcji wirusowej, wywołanego przez wirusa wyciszenia genów markerowych i nadekspresji wirusa GFP.

Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

Tutaj prezentujemy protokół do badania szybkości inicjacji programowanej śmierci komórki poprzez ciągłe obrazowanie zaszczepionych liści po indukcji śmierci komórki.

Badanie inicjacji śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego

Poznaj metodę wyciszania mikroRNA opartą na wirusa PVX w ziemniakach. System VbMS umożliwia szybką analizę funkcjonalną miRNA bez konieczności stabilnej transformacji roślin.

Wyciszanie mikroRNA na bazie wirusa ziemniaka (VbMS) w ziemniakach.

Przeglądaj więcej filmów