Name: Izolacja, transfekcja i długotrwała hodowla dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj protokół izolacji i długotrwałej hodowli dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów z efektywną transfekcją siRNA. Ta metoda umożliwia przeżycie komórek powyżej 20 dni i badanie ich biologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez fundusze z Wydziału Patologii i Medycyny Laboratoryjnej, University of Cincinnati, College of Medicine, dla dr Onura Kanisicaka; grant z National Institutes of Health (R01HL148598) dla dr Onura Kanisicaka. Dr Onur Kanisicak jest wspierany przez American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr Perwez Alam jest wspierany przez grant podoktorski American Heart Association (AHA_20POST35200267). Dr Malina J. Ivey jest wspierana przez grant NIH T32 (HL 125204-06A1).

Wszystkie eksperymenty powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Przewodnika do Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych opublikowanego przez Narodowy Instytut Zdrowia Stanów Zjednoczonych (NIH). Wszystkie protokoły pokazane w filmie zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Cincinnati, College of Medicine.
1. Przygotowanie przed pobraniem serca od dorosłych myszy (i szczurów)
<ol>
	<li>Przygotować odpowiednie roztwory perfuzyjne, enzymatyczne i zatrzymające, zgodnie z przepisami podanymi w Tabeli 1 i Tabeli 2, odpowiednio do izolacji szczurów i myszy. Przefiltruj roztwory przez filtr 0,22 μm, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia lub nierozpuszczone cząstki.</li>
	<li>Oczyść i wysterylizuj narzędzia chirurgiczne, mocząc je w 70% alkoholu przez 15 minut, a następnie umyj wodą podwójnie destylowaną. Pozostaw narzędzia do wyschnięcia na powietrzu na czystym ręczniku papierowym.</li>
	<li>Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 37 ºC. Sprawdź poziom wody w łaźni wodnej, aby zapewnić nieprzerwaną cyrkulację ciepłej wody przez aparat perfuzyjny podczas zabiegu.</li>
	<li>Wyczyść aparat perfuzyjny, uruchamiając go z 70% alkoholem przez 5 minut. Powtórz. 
	UWAGA: Zwiększ natężenie przepływu, co pomaga w czyszczeniu przewodów.</li>
	<li>Po przepłynięciu alkoholu oczyść resztki alkoholu, uruchamiając podwójnie destylowaną wodę przez 10 minut.</li>
	<li>Ustaw 3 średniej wielkości jednorazowe polistyrenowe naczynia wagowe, aby oczyścić serce po wycięciu. Napełnij naczynia 20 ml buforu miocytów.</li>
	<li>Dodaj 2-3 krople heparyny do każdego naczynia za pomocą pipety Pasteura i dobrze wymieszaj, wielokrotnie pipetując.</li>
	<li>Weź strzykawkę o pojemności 10 ml z kaniulą igłową. 
	UWAGA: Kaniulę igłową można przygotować, przecinając końcówkę czystej, sterylnej igły. Igła 21 G i igła 14 G zostały użyte do wykonania kaniuli odpowiednio dla myszy i szczura.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę buforem perfuzyjnym (Tabela 1). Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki i umieścić ją w trzecim naczyniu pod kątem. Zabezpiecz go taśmą. 
	UWAGA: W przypadku szczurów zamiast buforu perfuzyjnego miocytów zastosowano roztwór A (Tabela 2).</li>
	<li>Przygotuj luźny węzeł za pomocą szwu chirurgicznego i umieść go wokół igły.</li>
	<li>Wstrzyknąć myszy heparynę (100 jednostek USP/mysz) we wstrzyknięciu dootrzewnowym, 20 minut przed wstrzyknięciem znieczulenia.</li>
	<li>Cyrkulować bufor perfuzyjny miocytów (Tabela 1) przez aparat perfuzyjny. Zmniejsz natężenie przepływu do 3 ml/min. 
	UWAGA: W przypadku szczurów zamiast buforu perfuzyjnego miocytów zastosowano roztwór A (Tabela 2).</li>
	<li>Po 5 minutach zastąpić bufor perfuzyjny roztworem enzymu (Tabela 1). Podczas procesu nasycić roztwór enzymu tlenem. Stosować natężenie przepływu 3 ml/min. 
	UWAGA: Do izolacji CM szczura należy zamiast tego użyć roztworu E (Tabela 2).</li>
	<li>Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie znieczulenia. Stosować odpowiednią dawkę znieczulenia, zalecaną przez IACUC, do operacji terminalnej.</li>
	<li>Potwierdź wystarczającą głębokość znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Następnie umieść mysz na platformie chirurgicznej.</li>
</ol>
2. Pobranie serca od dorosłych myszy (i szczurów)
<ol>
	<li>Wysterylizuj skórę, przecierając 70% alkoholem.</li>
	<li>Ostrożnie otwórz skrzynię.</li>
	<li>Wytnij serce. Podczas wycinania należy unikać tkanek innych niż serce.</li>
	<li>Połóż serce na pierwszym naczyniu, wypełnionym buforem perfuzyjnym (Tabela 1). 
	UWAGA: Roztwór A należy stosować dla szczura (Tabela 2).</li>
	<li>Usuń krew z serca, delikatnie ściskając.</li>
	<li>Przełóż serce do drugiego dania.</li>
	<li>Oczyść krew z serca i usuń tkanki niezwiązane z sercem. Następnie przenieś serce do trzeciego naczynia.</li>
	<li>Odetnij płuca i inne otaczające tkanki i kaniuluj przez aortę wstępującą. Procedura ta powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe (<5 min), aby poprawić jakość i ilość CM.</li>
</ol>
3. Trawienie serca
<ol>
	<li>Trawienie serca myszy 
	UWAGA: Wszystkie roztwory/, które krążą w sercu myszy, powinny być natlenione przez cały czas trwania zabiegu.
	<ol>
		<li>Ostrożnie wyjąć igłę kaniulującą ze strzykawki i podłączyć ją do aparatu perfuzyjnego Langendorffa.</li>
		<li>Należy unikać przedostawania się pęcherzyków powietrza do serca, które mogą wpływać na przepływ roztworu enzymatycznego i trawienie.</li>
		<li>Przesuń płaszcz wodny do góry, aby zapewnić jednorodne środowisko dla serca. Pozwól, aby roztwór enzymu przepływał przez serce z prędkością 2-3 ml/min. 
		UWAGA: Szybkość rozwiązania przechodzącego ma kluczowe znaczenie i ma znaczący wpływ na wynik ilości i jakości CM.</li>
		<li>Pozwól roztworowi enzymu przepływać przez serce przez 2 minuty.</li>
		<li>Po 2 minutach dodać 40 μl 100 μM roztworu CaCl2 do roztworu enzymu i wymieszać. Pozwól roztworowi enzymu przejść przez serce przez kolejne 10-15 minut. 
		UWAGA: Gdy przepływ staje się płynny, serce staje się brązowawe i miękkie, co wskazuje na równomierne rozprowadzenie enzymu kolagenazy i prawidłowe trawienie serca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie serca szczura 
	UWAGA: Wszystkie roztwory/, które krążą w sercu szczura, powinny być natlenione przez cały czas trwania zabiegu.
	<ol>
		<li>Ostrożnie wyjąć igłę kaniulującą ze strzykawki i podłączyć ją do aparatu perfuzyjnego Langendorffa.</li>
		<li>Należy unikać przedostawania się pęcherzyków powietrza do serca, które mogą wpływać na przepływ roztworu enzymatycznego i trawienie.</li>
		<li>Przesuń płaszcz wodny do góry, aby zapewnić jednorodne środowisko dla serca.</li>
		<li>Rozpocznij przepływ roztworu A z prędkością 2-3 ml/min przez 3-5 minut, aby usunąć krew z serca. 
		UWAGA: Szybkość rozwiązania przechodzącego ma kluczowe znaczenie i ma znaczący wpływ na wynik jakości CM.</li>
		<li>Po usunięciu krwi z serca należy zmienić roztwór A na roztwór E (Tabela 2). Miareczkować roztwór E za pomocą CaCl2 zgodnie z poniższymi wskazówkami dla końcowego stężenia 0,1 mM w roztworze:
		<ol>
			<li>Po 10 minutach perfuzji dodać 12,5 μl 0,1 M CaCl2.</li>
			<li>Po 15 minutach perfuzji dodać 25 μl 0,1 M CaCl2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pozwól roztworowi enzymu przejść przez serce przez kolejne 30-40 minut, aż przepływ stanie się szybki, a serce będzie giętkie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej CM
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej CM (mysz)
	<ol>
		<li>Usunąć serce z systemu perfuzyjnego Langendorffa. Przenieść ją na szalkę Petriego o średnicy 60 mm wypełnioną 5 ml roztworu enzymatycznego i przenieść naczynie do okapu bezpieczeństwa biologicznego. 
		UWAGA: Upewnij się, że trawienie serca jest wystarczające przed usunięciem serca z systemu perfuzyjnego Langendorffa. Czas trawienia zależy od aktywności enzymu, przepływu roztworu i wielkości serca.</li>
		<li>Przeprowadzić dalszą mechaniczną dezagregację w okapie bezpieczeństwa biologicznego, aby zapewnić sterylność i uniknąć zanieczyszczenia.</li>
		<li>Ostrożnie usuń przedsionki (1/4 części podstawnej serca) i dodatkowe tkanki tłuszczowe.</li>
		<li>Zmiel serce kleszczami na drobne kawałki.</li>
		<li>Weź sterylną pipetę Pasteura i odetnij jej końcówkę pod kątem 45º.</li>
		<li>Za pomocą pipety Pasteura można delikatnie pipetować tkankę serca w zawiesinie jednokomórkowej. Optymalne trawienie zapewnia zawieszenie jednokomórkowych kardiomiocytów. 
		UWAGA: Usuń wąską, dolną część pipety transferowej, aby zmniejszyć uszkodzenia CM spowodowane mechanicznym przypalaniem.</li>
		<li>Następnie dodaj 5 ml roztworu zatrzymującego, aby zatrzymać aktywność enzymu, co pozwala uniknąć możliwości nadmiernego trawienia.</li>
		<li>Weź świeży stożek o pojemności 50 ml i umieść na nim sterylne sitko do komórek o wielkości 100 μm.</li>
		<li>Przepuść zawiesinę kardiomiocytów przez sitko komórkowe, aby usunąć fragment tkanki. Przemyć szalkę Petriego i sitko kolejnymi 5 ml roztworu zatrzymującego (Tabela 1) w celu zebrania kardiomiocytów, które pozostały przyczepione do sitka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej CM (szczur)
	<ol>
		<li>Usunąć serce z systemu perfuzyjnego Langendorffa. Przenieść serce na szalkę Petriego o średnicy 100 mm wypełnioną 5 ml roztworu A i przenieść naczynie do okapu bezpieczeństwa biologicznego. 
		UWAGA: Upewnij się, że trawienie serca jest wystarczające przed usunięciem serca z systemu perfuzyjnego Langendorffa. Czas trawienia zależy od aktywności enzymu, przepływu roztworu i wielkości serca.</li>
		<li>Przeprowadzić dalszą mechaniczną dezagregację w okapie bezpieczeństwa biologicznego, aby zapewnić sterylność i uniknąć zanieczyszczenia.</li>
		<li>Ostrożnie usuń przedsionki (1/4 podstawowej części serca) i dodatkową tkankę tłuszczową.</li>
		<li>Zmiel serce kleszczami na drobne kawałki.</li>
		<li>Weź sterylną pipetę Pasteura i odetnij jej końcówkę pod kątem 45º.</li>
		<li>Za pomocą pipety Pasteura można delikatnie pipetować tkankę serca w zawiesinie jednokomórkowej. Optymalne trawienie zapewnia zawieszenie jednokomórkowych kardiomiocytów. 
		UWAGA: Usuń wąską, dolną część pipety transferowej, aby zmniejszyć uszkodzenia CM spowodowane mechanicznym przypalaniem.</li>
		<li>Dodać 5 ml roztworu B (tabela 2) do zawiesiny CM i przepuścić roztwór przez sitko do komórek o wielkości 100 μm w celu usunięcia wszelkich pozostałych kawałków tłuszczu lub innej niestrawionej tkanki.</li>
		<li>Zebrać filtrat do świeżej stożkowej fiolki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Użyj kolejnych 5 ml roztworu B, aby przemyć szalkę Petriego i pozostały CM przez sitko do komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Usuwanie nie-CM
<ol>
	<li>Usuwanie substancji innych niż CM z zawiesiny jednokomórkowej dorosłej osoby (mysz)
	<ol>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 20 x g przez 3 min.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml roztworu zatrzymującego (Tabela 1). 
		UWAGA: Zwiększenie stężenia BSA w roztworze zatrzymującym zwiększy jego lepkość i zmniejszy szybkość sedymentacji substancji innych niż CM.</li>
		<li>Ponownie zawieś CM poprzez delikatne odwrócenie rurki 3-5 razy.</li>
		<li>W odstępach 3-minutowych dodać 10 μl 100 μM roztworu CaCl2 i wymieszać. Powtórz trzy razy.</li>
		<li>Po czwartym dodaniu odwirować zawiesinę kardiomiocytów o stężeniu 20 x g przez 3 min.</li>
		<li>Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić CM we wstępnie ogrzanym (37 ºC), pożywce do posiewu CM dla dorosłych myszy (Tabela 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie substancji innych niż CM z zawiesin jednokomórkowych dorosłych osobników (szczur)
	<ol>
		<li>Granulki w dawce 20 x g przez 3 minuty w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 25 ml roztworu B (Tabela 2).</li>
		<li>Wymieszaj komórki przez delikatne odwrócenie i umieść je w stojaku na probówkę, aby CM mógł osiąść pod wpływem grawitacji.</li>
		<li>Ostrożnie wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w świeżych 25 ml roztworu B i miareczkować go do 1,0 mM CaCl2 przez stopniowe dodawanie 50 μl, 75 μl i 100 μl 0,1 M CaCl2 w odstępach 3-5 min. 
		UWAGA: Na tym etapie można zastosować wyższe stężenie BSA w roztworze B. Zwiększenie stężenia BSA w roztworze B zwiększa lepkość, a tym samym zmniejsza szybkość sedymentacji substancji niebędących CM.</li>
		<li>Osadzać komórki w dawce 20 x g przez 3 minuty w temperaturze 25 °C, odessać supernatant i dodać żądaną objętość pożywki dla dorosłych komórek szczura (tabela 4).</li>
		<li>CM nasion na płytce pokrytej lamininą. 
		UWAGA: Wstępne posiewanie CM na niepowlekanej płytce hodowlanej może być stosowane w celu zminimalizowania zanieczyszczenia komórek innych niż CM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Poszycie CM dla dorosłych
<ol>
	<li>Powlekanie wstępne
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić kardiomiocyty w pożywce hodowlanej.</li>
		<li>Wstępnie pokryj komórki w naczyniu o średnicy 60 mm lub 100 mm odpowiednio dla myszy lub szczura.</li>
		<li>Inkubować CM przez 2 godziny w inkubatorze uzupełnionym 5% CO2 w temperaturze 37 ºC.</li>
		<li>Podczas inkubacji przed płytką pokryj płytki hodowli komórkowej lamininą (10 μg/ml w PBS) w celu długotrwałej hodowli CM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 2 godzinach wstępnego powlekania zebrać CM w stożkowej fiolce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Zbierz komórki z naczynia i ponownie umieść je na pokrytej lamininą 24-dołkowej płytce hodowlanej w celu przeprowadzenia eksperymentów transfekcyjnych.</li>
	<li>Hodowla komórek w inkubatorze w temperaturze 37 ºC uzupełniona o 5% CO2 . Wystarczy 4-6 godzin, aby przylgnąć do kardiomiocytów powierzchnią, a zatem transfekcję można wykonać 6 godzin po posiewie. 
	UWAGA: Pożywka galwaniczna zawierająca FBS jest powszechnie stosowana i wykazuje lepszą kompatybilność z badaniami proliferacji. Jednak pożywka bez surowicy może być używana do eksperymentów, w których analizowane są czynniki wydzielnicze.</li>
</ol>
7. Transfekcja
<ol>
	<li>Inkubować CM na płytkach do kultur komórkowych pokrytych lamininą przez 4-6 godzin.</li>
	<li>Cztery godziny po wysiewie CM na płytce pokrytej lamininą, transfekować komórki z siRNA (50 nM) zainteresowania za pomocą odczynnika do transfekcji (np. Lipofectamine RNAiMAX) zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę 24 godziny po transfekcji, a następnie co 24 godziny przez maksymalnie 20 dni.</li>
	<li>Po 20 dniach utrwal komórki z 4% PFA w PBS do dalszych zastosowań, w tym immunocytochemii dla markerów specyficznych dla serca, takich jak troponina, aby zapewnić pomyślną długoterminową hodowlę żywych kardiomiocytów.</li>
</ol>

<ol><li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li>
<li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2Freoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748(2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li>
<li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289(2013).</li>
<li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li>
<li>Müller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+ischemic+heart+disease%3A+novel+carriers+for+bioinformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451(2019).</li>
<li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases%3A+Beneficial+or+Detrimental%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058(2018).</li>
<li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li>
<li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089(2019).</li>
<li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-210-mediated+proliferation%2C+survival%2C+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li>
<li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+ascending%3A+perspectives+for+human-disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li>
<li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634(2017).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012(2016).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li>
<li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357(2014).</li>
<li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li>
<li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li>
<li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li>
<li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li>
<li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+effects+of+2%2C3-butanedione+monoxime%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li>
</ol>

Istnieje pilna potrzeba ustanowienia protokołu izolacji dorosłych kardiomiocytów i długoterminowej hodowli w celu przeprowadzenia specyficznych dla komórek badań mechanistycznych. Istnieje tylko kilka doniesień omawiających protokoły izolacji dorosłych myszy CM, a jeszcze mniej z nich jest wykorzystywanych do długotrwałej hodowli dorosłych myszy CM 15,16,17. Wykazano, że dorosłe myszy CM mają wyższą tolerancję na hodowlę in vitr...

Choroby serca są jedną z głównych przyczyn zgonów na całym świecie. Prawie wszystkie rodzaje urazów serca powodują znaczną utratę dorosłych kardiomiocytów (CM). Serca dorosłych ssaków nie są w stanie naprawić uszkodzenia serca ze względu na starzejącą się naturę dorosłego CM1. Tak więc każde uszkodzenie serca dorosłego ssaka powoduje trwałą utratę CM, co prowadzi do zmniejszenia czynności serca i niewydolności serca. W przeciwieństwie do dorosłych ssaków, małe zwierzęta, takie jak danio pręgowany i serca traszki, mogą zregenerować uraz serca poprzez istniejącą proliferację CM2,3,4. Na całym świecie trwają prace nad znalezieniem nowej interwencji terapeutycznej w przypadku uszkodzenia serca za pomocą metod proliferacyjnych i nieproliferacyjnych. W ostatnich dziesięcioleciach opracowano różne rodzaje genetycznych modeli myszy do badania uszkodzeń i naprawy serca. Jednak wykorzystanie modeli zwierzęcych in vivo nadal jest kosztownym podejściem, które wiąże się z dodatkową złożonością w celu rozszyfrowania mechanizmu autonomicznego komórki od skutków wtórnych. Poza tym systemy in vivo są trudne do analizy specyficznych dla CM efektów interwencji farmakologicznej, która indukuje sygnalizację kardioprotekcyjną z CM.
Ponadto, długoterminowa hodowla dorosłych CM jest niezbędna do przeprowadzenia analiz proliferacji CM. Testy proliferacji CM wymagają co najmniej 4-5 dni, aby komórki zostały indukowane do cyklu komórkowego i uzyskały dokładne dane po tym. Ponadto badania, które wykorzystują izolowane CM do badań elektrofizjologicznych, badań przesiewowych leków, badań toksyczności i badań homeostazy Ca++, wymagają ulepszonego systemu hodowli5,6,7. Ponadto ostatnie badania wskazują na kardioprotekcyjne znaczenie cytokin wydzielanych przez CM (kardiokiny)8,9. W celu zbadania roli terapeutycznej i mechanizmu molekularnego tych kardiokin podczas naprawy i regeneracji serca wymagany jest przedłużony posiew.
Dorosłe szczury CM są wystarczająco wytrzymałe do izolacji pojedynczej komórki i długotrwałej hodowli w systemie in vitro10,11,12. Jednak CM dorosłych myszy są bardzo interesujące w testach in vitro, ze względu na dostępność różnych genetycznie modyfikowanych modeli myszy, co pozwala na projektowanie i wykonywanie różnych innowacyjnych analiz, które nie są możliwe w przypadku szczurów CM13. W przeciwieństwie do izolacji CM dorosłego szczura, uzyskanie zawiesiny jednokomórkowej z serc dorosłych myszy jest dość trudne, a długotrwała hodowla CM dorosłych myszy w hodowli jest jeszcze trudniejsza.
Izolacja CM dorosłych CM od serc myszy i szczurów za pomocą systemu Langendorffa została wcześniej ustanowiona do badania funkcji CM5,14,15. Tutaj szczegółowo opisaliśmy protokoły izolacji dorosłych CM zarówno od szczurów, jak i myszy, a także zmodyfikowaną długoterminową hodowlę, transfekcję i proliferację CM izolowanych komórek.

<table><tbody><tr><td>2,3-butan Dione monoksymus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0753</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatyna</td><td>APExBIO</td><td>B1387</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowej</td><td>Corning Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Sitko</td> <td>do komórekBD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cel-miR-67</td><td>Dharmacon</td><td>CN-001000-01-50</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typ2</td><td></td><td>Jednorazowe</td> pipety z podziałką Worthington LS004177 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe polistyrenowe naczynia wagowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z154881-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany orzeł Dulbecco's medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>EdU</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze precyzyjne</td><td>Fine Point Fisherbrand</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-5400</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>PSLAB-018285-02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna prosta, szeroka pęseta punktowa / kleszcze</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX</td><td>Life Technologies</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Naturalna mysz Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Henry Schein</td><td>24352</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147-1G</td><td></td></tr><tr><td>Selenium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229865+5G</td><td></td></tr><tr><td>siMeis2</td><td>Dharmacon</td><td>s161030</td><td></td></tr><tr><td>siRb1</td><td>Dharmacon</td><td>s128325</td><td></td></tr><tr><td>Proste/ostre nożyczki preparacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>28252</td><td></td></tr><tr><td>Proste, bardzo cienkie, precyzyjne szczypce do końcówek</td><td>Fisherbrand</td><td>16-100-120</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-gładkie nożyczki ze ściętymi krawędziami</td><td>Fisherbrand</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>3006S</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, transfekcja i długotrwała hodowla dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Hodowla ex vivo kardiomiocytów dorosłych ssaków (CMs) przedstawia najbardziej odpowiedni system eksperymentalny do badania in vitro biologii serca. CM dorosłych ssaków są końcowo zróżnicowanymi komórkami o minimalnej zdolności proliferacyjnej. Stan postmitotyczny dorosłych CM nie tylko ogranicza progresję cyklu komórkowego kardiomiocytów, ale także ogranicza wydajną hodowlę CM. Co więcej, długotrwała hodowla dorosłych CM jest niezbędna do wielu badań, takich jak proliferacja CM i analiza ekspresji genów.
Mysz i szczur to dwa najchętniej wybierane zwierzęta laboratoryjne do izolacji kardiomiocytów. Chociaż możliwa jest długotrwała hodowla CM szczurów, dorosłe CM myszy są podatne na śmierć i nie mogą być hodowane dłużej niż pięć dni w normalnych warunkach. W związku z tym istnieje krytyczna potrzeba optymalizacji izolacji komórek i długoterminowego protokołu hodowli dorosłych mysich CM. Dzięki temu zmodyfikowanemu protokołowi możliwe jest skuteczne izolowanie i hodowla zarówno dorosłych myszy jak i szczurów przez ponad 20 dni. Co więcej, skuteczność transfekcji siRNA izolowanego CM jest znacznie zwiększona w porównaniu z poprzednimi raportami. Do izolacji CM dorosłych myszy stosuje się metodę perfuzji Langendorffa z optymalnym roztworem enzymatycznym i wystarczającym czasem na całkowitą dysocjację macierzy zewnątrzkomórkowej. W celu uzyskania czystych komorowych CM, oba przedsionki zostały wypreparowane i odrzucone przed przystąpieniem do dysocjacji i posiewu. Komórki zostały rozproszone na płytce pokrytej lamininą, co pozwoliło na sprawne i szybkie przyczepienie. CM pozostawiono na 4-6 godzin przed transfekcją siRNA. Pożywki hodowlane odświeżano co 24 godziny przez 20 dni, a następnie CM utrwalano i barwiono pod kątem markerów specyficznych dla serca, takich jak troponina i markerów cyklu komórkowego, takich jak KI67.

Obecny zmodyfikowany protokół umożliwia efektywną izolację i hodowlę kardiomiocytów (CMs) szczura i myszy in vitro. Do izolacji CMs szczura w procedurze wykorzystano łącznie 3 dorosłe (12-tygodniowe) samce szczurów linii Fischer 34. Rysunek 1 przedstawia aparaturę chirurgiczną i zestawy do izolacji wymagane w procedurze; każda część została oznakowana i opisana w legendzie do rysunku. Do trawienia wykorzystano kolagenazę typu 2, która pozwala na uzyskanie wysokiej ilości wysokiej jakości CMs...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji, transfekcji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy i szczurów.

Izolacja, transfekcja i długotrwała hodowla dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Celem tego filmu jest zademonstrowanie ustandaryzowanego protokołu izolacji dorosłych kardiomiocytów, długoterminowej hodowli i transfekcji. Izolowanie i hodowla kardiomiocytów od myszy lub szczura nadal jest podstawową metodą badania autonomicznej biologii komórek kardiomiocytów w zdrowym i chorym sercu. Jest kilka pytań, na które możemy odpowiedzieć za pomocą izolowanych kardiomiocytów.Takich jak potencjał proliferacyjny. Po utworzeniu zachodzą zmiany ekspresji genów lub specyficzne ekspresje cytokin. Niestety, kardiomiocyty myszy nie przeżywają dłużej niż tydzień w normalnych warunkach hodowli.Dlatego w tym filmie opisujemy zoptymalizowaną metodę izolowania kardiomiocytów dorosłych myszy, transfiksowania ich i hodowli długo po 21 dniach, technika ta jest początkowo trudna do opanowania. Ale przy praktyce można osiągnąć około 80 do 90% przeżywalności w kardiomiocytach po izolacji i około 100 procent skuteczności transfekcji. Większość z tych kardiomiocytów w odpowiednich warunkach może przetrwać dłużej niż 20 dni.Oczyść i wysterylizuj narzędzia chirurgiczne, mocząc je w 70% alkoholu przez 15 minut, a następnie myjąc je wodą podwójnie destylowaną. Po wodzie pozostaw narzędzia na p

isolation-transfection-long-term-culture-adult-mouse-rat

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisaliśmy typowy sposób izolacji i hodowli dorosłych miocytów serca szczura. Do trawienia i izolacji pojedynczych miocytów wykorzystuje się kolagenazę oraz proteazę. Miocyty hodowane zgodnie z tym protokołem spełniają większość wymagań eksperymentalnych.

Hodowla pierwotna kardiomiocytów dorosłego szczura

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Pierwotne hodowle kardiomiocytów myszy są jednym z kluczowych narzędzi do badania organizacji i funkcji miofibrylarów. Poniższy protokół opisuje izolację i hodowlę pierwotnych kardiomiocytów z serca noworodków myszy. Uzyskane w ten sposób kultury kardiomiocytów mogą być następnie wykorzystane do różnych testów biomechanicznych, biochemicznych i biologicznych.

Izolacja i hodowla nowonarodzonych kardiomiocytów myszy

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Opisujemy niezawodną metodę izolacji kardiomiocytów dorosłych myszy. Protokół ten daje spójny wynik dla hodowli funkcjonalnych dorosłych kardiomiocytów od różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy.

Izolacja i hodowla kardiomiocytów dorosłych myszy do sygnalizacji komórkowej i przerostu serca in vitro

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli kardiomiocytów komorowych dorosłych szczurów (ARVC). Izolowany ARVC może być stosowany do krótko- i długotrwałej uprawy. Izolacja i hodowla ARVC może odegrać kluczową rolę w opracowywaniu nowych schematów leczenia chorób serca.

Izolacja i hodowla dorosłych kardiomiocytów szczurów

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Poznaj protokół izolacji i długotrwałej hodowli dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów z efektywną transfekcją siRNA. Ta metoda umożliwia przeżycie komórek powyżej 20 dni i badanie ich biologii.

Izolacja, transfekcja i długotrwała hodowla dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów

Przeglądaj więcej filmów