Flypub do badania odhamowania behawioralnego i uwrażliwienia wywołanego etanolem
18 maja 2020
Test Flypub mierzy zachowanie, jakie muszka owocowa Drosophila melanogaster przejawia pod wpływem etanolu. Test może być łatwo opanowany przez eksperymentatorów na wszystkich poziomach i stosowany do różnych odparowanych bodźców, ułatwiając badania nad nadużywaniem substancji i uzależnieniami.
Test Flypub mierzy odhamowane zachowania pod wpływem alkoholu. Ułatwiając w ten sposób mechanistyczne badanie zaburzeń związanych z używaniem alkoholu. Alkohol jest jednym z najłatwiej dostępnych i najpowszechniej nadużywanych narkotyków na świecie.
Neurobiologiczny mechanizm leżący u podstaw zaburzeń związanych z używaniem alkoholu nie jest jednak w pełni poznany. Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, była szeroko wykorzystywana do badania wpływu etanolu na euforię, lokomocję, odhamowanie i uspokojenie. Jest również używany do badania jego długich i trwałych zmian w zachowaniu związanym z uzależnieniem, takich jak tolerancja, uczulenie i poszukiwanie etanolu.
Wiele badań na Drosophila i innych modelach zwierzęcych koncentruje się na aktywującym działanie lokomotoryczne etanolu. Wyraźnym efektem etanolu jest odhamowanie behawioralne. Jednak jego badanie jest raczej niedostatecznie reprezentowane.
Aby rozwiązać ten kluczowy problem, opracowaliśmy test Flypub do pomiaru odhamowanego zachowania pod wpływem etanolu. Aby zmontować komorę Flypub, weź okrągłą butelkę i odetnij jej dolną część 25-mililitrowego znaku żyletką. Utwórz otwór w miejscu 50 mililitrów za pomocą gorącej lutownicy.
Jest to punkt dostępu, w którym zostaną wprowadzone muchy. Umieść okrągłą siatkę o średnicy 54 milimetrów na znaku 75 mililitrów i zabezpiecz ją gorącym klejem. Umieść przezroczysty arkusz plastiku o średnicy 70 milimetrów na otwartym dolnym końcu i zabezpiecz go gorącym klejem.
Aby upewnić się, że plastikowy krążek jest mocno przymocowany do dna, dociśnij go za pomocą obciążników. Zbierz samce much w grupę 33 osób. Umieść je na boku fiolki z jedzeniem.
Umieść je w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza o wilgotności względnej co najmniej 50% i 12-godzinnym cyklu światła, 12-godzinnym ciemnym cyklu przez 2 dni przed ekspozycją na etanol. Przygotuj stację testową Flypub, włączając światła, komputer i kamerę do nagrywania wideo. Przygotuj sześć pubów do zestawu eksperymentów.
Oznacz je numerami od jednego do sześciu. Delikatnie wprowadź muchy do pubu za pomocą małego lejka. Zamknij pub za pomocą taśmy.
Aklimatyzuj muchy przez 10 minut. Podczas aklimatyzacji dostosuj ostrość kamery i nagraj ostatnie pięć minut aklimatyzacji. Podczas aklimatyzacji przygotuj waciki do podania etanolu.
Pokrój wacik na cztery równe ćwiartki, a następnie przytnij rogi, aby pasował do szalki Petriego. Dodaj wacik do szalki Petriego. Dodaj jeden mililitr 95% etanolu do wacika.
Upewnij się, że roztwór etanolu jest równomiernie rozprowadzony na całej powierzchni podkładki. Szybko przykryj szalkę Petriego chusteczkami laboratoryjnymi. Ostrożnie umieść szalkę Petriego zawierającą etanol pod każdym pubem.
Wyrównaj puby na scenie. Rozpocznij nagrywanie i jednocześnie uruchom minutnik. Nagrywaj, dopóki muchy nie przestaną się zalecać lub poruszać.
Usuń etanol zawierający szalkę Petriego, gdy ponad 90% much jest uspokojonych. Delikatnie przenieś uspokojone muchy z powrotem do fiolek z jedzeniem. Umieść je z powrotem w inkubatorze.
Powtarzaj poprzednie kroki co 24 godziny przez sześć kolejnych dni. Otwórz wideo za pomocą odtwarzacza multimedialnego. Następnie oceń liczbę samców zaangażowanych w zaloty co 10 sekund.
Czynności związane z zalotami, aby zdobyć punkty, obejmują: jednostronne przedłużenie skrzydła, łańcuch zalotów, krąg zalotów, zginanie brzucha i dosiadanie. Pokazane są reprezentatywne nagrania zachowania much. Podczas aklimatyzacji, gdzie samce nie wykazują dużej aktywności.
Podczas pierwszej ekspozycji, w której samce wykazują sporadyczne zaloty. I podczas szóstej ekspozycji, w której samce wykazują aktywność zalotów. Wprowadź liczbę samców wykazujących zaloty w dziesięciosekundowym bloku czasu.
Użyj maksymalnej liczby zalotnych samców w trzech kolejnych 10-sekundowych blokach czasu jako reprezentatywnego punktu danych. Średnia z 10 kolejnych punktów danych o najwyższej wartości reprezentuje odsetek zalotów między mężczyznami na pub. Dziki typ Canton-S wykazuje stopniowo zwiększoną aktywność odhamowanych zalotów po wielokrotnym narażeniu na etanol.
Stanowi to behawioralne uwrażliwienie na efekt odhamowania etanolu. Zbadaliśmy rolę oktopaminy w uczuleniu, testując muchy, które są pozbawione beta-hydroksylazy tyraminy, T beta H, a więc z niedoborem oktopaminy. Podobnie jak Canton-S, mutanty T beta H wykazywały nasilone reakcje na powtarzającą się ekspozycję na etanol, ale na zmniejszonym poziomie.
Kiedy porównaliśmy T beta H i Canton-S, zaobserwowaliśmy, że samce z mutacją T beta H wykazywały mniej odhamowane zaloty niż samce Canton-S w każdej ekspozycji, co wskazuje, że oktopamina może być ważna dla uczulenia. Teraz możesz konfigurować, przeprowadzać i analizować zachowania wywołane przez etanol za pomocą testu Flypub. Kluczowe punkty, o których należy pamiętać, to po pierwsze, prawidłowy montaż pubu.
Po drugie, konsekwentne dostarczanie etanolu i po trzy, precyzyjna i bezstronna ocena behawioralna. Test Flypub ma wiele zalet. Jest prosty, niedrogi w konfiguracji i łatwy do nauczenia.
Ponadto wiele grup much może być testowanych jednocześnie, co ułatwia to badanie w celu zidentyfikowania skutków manipulacji genetycznych lub eksperymentalnych. Test Flypub jest bardzo atrakcyjny dla eksperymentatorów na wszystkich poziomach, w tym uczniów szkół podstawowych i średnich, studentów studiów licencjackich i magisterskich, doktorantów i wykładowców. Podsumowując, test Flypub pozwoli Ci zidentyfikować graczy molekularnych, szlaki komórkowe, obwody mózgowe i czynniki ryzyka, które przyczyniają się do zaburzeń związanych z używaniem alkoholu.
Przegląd
Test Flypub służy do pomiaru zachowań odhamowanych u muszki owocówki Drosophila melanogaster pod wpływem etanolu. Test ten został zaprojektowany w celu ułatwienia badań nad zaburzeniamiWhoever związanymi z używaniem alkoholu i może zostać z łatwością opanowany przez badaczy na każdym poziomie zaawansowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Badania nad zaburzeniami używania alkoholu
Wstęp
- Alkohol jest powszechnie nadużywany, jednak jego mechanizmy neurobiologiczne nie są w pełni zrozumiałe.
- Drosophila melanogaster służy jako organizm modelowy do badania efektów etanolu.
- Test Flypub odnosi się konkretnie do niedostatecznie opracowanej kwestii odhamowania behawioralnego wywołanego przez etanol.
- Poprzednie badania koncentrowały się głównie na efektach lokomotorycznych, a nie na odhamowaniu.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody pomiaru zachowań odhamowania w odpowiedzi na etanol.
- Zbadanie roli oktopaminy w sensytyzacji behawioralnej związanej z ekspozycją na alkohol.
- Zapewnienie prostego i skutecznego testu umożliwiającego badaczom studiowanie mechanizmów uzależnień.
Zastosowane metody
- Montaż komory Flypub z wykorzystaniem zmodyfikowanej butelki.
- Przygotowanie samców Drosophila do ekspozycji na etanol.
- Rejestracja wideo zachowania much podczas aktywności godowej.
- Ocena zachowań godowych w celu analizy efektów odhamowania.
Główne wyniki
- Muchy typu dzikiego Canton-S wykazywały zwiększone, odhamowane zaloty przy powtarzanej ekspozycji na etanol.
- Mutanty T beta H wykazały zmniejszone odhamowanie w porównaniu do Canton-S, co wskazuje na rolę oktopaminy.
- Test umożliwia jednoczesne badanie wielu grup much.
- Spójne podawanie etanolu i precyzyjna ocena są kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników.
Wnioski
- Test Flypub jest cennym narzędziem do badania wpływu etanolu na zachowanie.
- Może on pomóc w identyfikacji mechanizmów molekularnych i komórkowych zaangażowanych w zaburzenia związane z używaniem alkoholu.
- Test ten jest dostępny dla badaczy na różnych poziomach wykształcenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test Flypub wypełnia istotną lukę w badaniach nad zaburzeniami używania alkoholu, koncentrując się na indukowanym etanolem odhamowaniu behawioralnym, które jest kluczową zmianą adaptacyjną leżącą u podstaw uzależnienia. Umożliwiając pomiar nasilonego odhamowania w zachowaniach godzinnych u Drosophila melanogaster, test ten wspiera walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Jego prostota, skalowalność i kompatybilność z narzędziami genetycznymi zwiększają pewność prognostyczną w badaniu szlaków i obwodów w mechanizmach uzależnień.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez pomiar nasilonego zachowania odhamowania jako wskaźnika sensybilizacji na etanol.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów genetycznych, takich jak komponenty szlaku oktopaminergicznego, poprzez redukcję fenotypów odhamowania.
- Wartość predykcyjna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez kwantyfikację sensybilizacji behawioralnej w różnych genotypach, pomagając w priorytetyzacji celów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez ustalenie bazowych i uwrażliwionych reakcji odhamowania.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje podawanie etanolu oraz ocenę behawioralną, zapewniając powtarzalność w różnych seriach eksperymentalnych i laboratoriach.
- Wartość skalowalności: Umożliwia jednoczesne testowanie wielu grup much, co ułatwia równoległą ocenę manipulacji genetycznych lub farmakologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Łączy uwrażliwienie na odhamowanie u much z ssącymi modelami uzależnień, wspierając międzygatunkową walidację celów terapeutycznych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia analizę cząsteczek, szlaków komórkowych i obwodów mózgowych przyczyniających się do zmian behawioralnych wywołanych przez etanol.
- Ciągłość predykcyjna: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu skorygowane o poziom ryzyka poprzez powiązanie modulacji celu z fenotypami odhamowania podczas wielokrotnych ekspozycji.
Integracja potoków i przepływów pracy
Test Flypub wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od weryfikacji hipotezy dotyczącej celu terapeutycznego po identyfikację związku wiodącego, w szczególności w odniesieniu do celów związanych z uzależnieniami, które wpływają na regulację behawioralną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących genów i szlaków zaangażowanych w odpowiedź na etanol, takich jak tyramina beta-hydroksylaza i sygnalizacja oktopaminy.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz dzięki standaryzowanym komorom, spójnemu przygotowaniu etanolu i mierzalnemu punktowaniu zalotów co 10 sekund.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennej zależnej — procent zalotów między samcami na jedną muchę — co umożliwia porównania między różnymi warunkami i genotypami.
- Badania translacyjne: Łączy uwrażliwienie na odhamowanie z istotnością przedkliniczną poprzez modelowanie nasilonych reakcji przypominających zachowania uzależnieniowe.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do oceny genetycznych, farmakologicznych lub środowiskowych modyfikatorów odpowiedzi na etanol w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej związanej z sensytyzacją odhamowania.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzowanemu montażowi komory, podawaniu etanolu oraz ślepym ocenom behawioralnym.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie ilościowych fenotypów opartych na eskalacji, które odzwierciedlają neuroadaptacje istotne dla uzależnień.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich wpływ na trajektorie sensytyzacji behawioralnej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze muszek Drosophila, obserwacji behawioralnej oraz punktacji na podstawie nagrań wideo.
- Zależy od instrumentacji służącej do podawania etanolu, rejestracji wideo oraz kontroli środowiskowej (25°C, 50% wilgotności, 12-godzinny cykl światło/ciemność).
- Wymaga standaryzacji kryteriów zalotów i interwałów punktacji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy rozszerzaniu testu o pomiary innych zachowań indukowanych etanolem poza odhamowaniem zalotów.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak subiektywizm osoby oceniającej oraz zmienność motywacji much, co jest niwelowane poprzez wyznaczanie maksymalnej aktywności zalotowej w kolejnych blokach czasowych.
