Name: Flypub do badania odhamowania behawioralnego i uwrażliwienia wywołanego etanolem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj metodę Flypub do badania odhamowania behawioralnego i uwrażliwienia wywołanego etanolem u Drosophila melanogaster. Ta technika pomaga identyfikować molekularne mechanizmy uzależnienia od alkoholu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, Brain & Behavior Research Foundation NARSAD oraz NIMHD 2G12MD007592 NMD Cluster. Jesteśmy również wdzięczni finansowanemu przez NIH programowi RISE (NIGMS 5R25GM069621) za wspieranie NMD i CMS, programowi UTEP COURI-SURPASS wspierającemu NMD, finansowanemu przez NIH programowi MARC (NIGMS 2T34GM008048-31) za wspieranie AA oraz Dr. Keelung Hong Graduate Fellowship za wspieranie EBS. Jesteśmy bardzo wdzięczni działowi komunikacji UTEP: Darlene Barajas, Christian Rivera, Karina Moreno, Jose Loya Fernandez oraz działowi muzycznemu: Stephenowi A. Haddadowi za pomoc w produkcji wideo i lektora. Na koniec jesteśmy bardzo wdzięczni dr Andreasowi Thumowi za podzielenie się mutantem tβh w tle Canton-S wraz z kontrolnymi muchami Canton-S; oraz Jessica Burciaga za jej cenny wkład we wstępne badania nad oktopaminą oraz członkom laboratorium Han za dyskusję i wsparcie.

UWAGA: Sekcja protokołu szczegółowo opisuje etapy przygotowawcze, testy i analizy Flypub, które obejmują (1) montaż komory, (2) opiekę nad muchami i zbieranie, (3) ustawienie stacji testowej, (4) ekspozycję na etanol, (5) ocenę zalotów i analizę danych oraz (6) analizę statystyczną. Kluczowe kroki przeprowadzania testu i analizy Flypub są przedstawione w przepływie pracy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
1. Montaż komory (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Odetnij dolną część okrągłej butelki Drosophila w miejscu oznaczonym 25 ml za pomocą żyletki.</li>
	<li>Wykonaj otwór o średnicy 5 mm w miejscu oznaczenia 50 ml butelki za pomocą gorącej lutownicy. 
	UWAGA: Jest to punkt dostępu, w którym muchy zostaną przeniesione do komory.</li>
	<li>Wytnij arkusz siatki w okrąg o średnicy 54 mm, aby zmieścił się w butelce Drosophila na znaku 75 ml.</li>
	<li>Zabezpiecz siatkę w miejscu oznaczenia 75 ml butelki za pomocą gorącego kleju.</li>
	<li>Pokrój arkusz poliwęglanu w okrąg o średnicy 70 mm.</li>
	<li>Przymocuj plastikowy arkusz poliwęglanu do butelki w miejscu oznaczenia 25 ml (dolna otwarta przestrzeń wykonana w kroku 1.1) za pomocą gorącego kleju.</li>
	<li>Dociśnij w dół za pomocą obciążników, aby upewnić się, że okrągły poliwęglan jest mocno przymocowany do dna.</li>
	<li>Umyj puby etanolem, aby usunąć wszelkie zapachy i obficie spłucz je wiele razy pod bieżącą wodą destylowaną. Energicznie wstrząśnij pubami, aby usunąć nadmiar wody.</li>
	<li>Osusz puby, kładąc je poziomo na ręcznikach papierowych w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Pielęgnacja i zbieranie much
<ol>
	<li>Utrzymuj muchy na standardowym podłożu spożywczym z mąki kukurydzianej/agaru/cukru/drożdży (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html).</li>
	<li>Zbierz jedno- lub dwudniowe samce much w grupie 33, które reprezentują jeden punkt danych, w znieczuleniu dwutlenkiem węgla (CO2). Upewnij się, że wybrałeś muchy z nienaruszoną morfologią i umieść je w fiolce z jedzeniem, aby wyzdrowieć. 
	UWAGA: Dopuszczalne są dwie lub trzy muchy mniej na grupę. Zachowania mogą być wrażliwe na ustawienia eksperymentalne, dlatego całkowita liczba much na pub może wymagać dostosowania za pomocą linii kontrolnej. 
	UWAGA: Upewnij się, że fiolka z jedzeniem jest położona z boku, aby znieczulone muchy nie przykleiły się do jedzenia.</li>
	<li>Muchy należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 25 °C o wilgotności względnej co najmniej 50% i 12-godzinnym cyklu światła / 12 godzin ciemności przez 2 dni przed ekspozycją na etanol. 
	UWAGA: Usuwanie CO2 ma kluczowe znaczenie dla wyeliminowania wszelkich skutków fizjologicznych lub behawioralnych wywołanych przez CO2, które mogą zmienić reakcje wywołane etanolem.</li>
	<li>Użyj kodów, aby zaślepić genotypy much lub warunki leczenia dla eksperymentatorów przeprowadzających ekspozycję na etanol i oceniających zachowania godowe. 
	UWAGA: Ślepe testy pomagają wyeliminować błąd systematyczny eksperymentu.</li>
</ol>
3. Ustawienie stacji probierczej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A)
<ol>
	<li>Ustaw stojak na kopie kopie z dołączonym środkowym ramieniem na blacie w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. 
	UWAGA: Stojak na kopie nie jest obowiązkowy. Wystarczające jest dowolne urządzenie do przemieszczania, które zapewnia platformę poziomą.</li>
	<li>Clamp dwa boczne ramiona do stojaka, tak aby każde ramię znajdowało się około 18 cm od środka stojaka.</li>
	<li>Umieść lampę fluorescencyjną na każdym ramieniu stojaka i jedną pośrodku.</li>
	<li>Przymocuj magnetowid do środkowego ramienia, około 38 cm powyżej środka podstawy. Spowoduje to nagranie pubów z widoku z góry.</li>
	<li>Przykryj podstawę stojaka białym papierem, który pomaga wizualizować ciemne muchy, aby stworzyć kontrast.</li>
	<li>W dniu ekspozycji włącz lampy fluorescencyjne i komputer podłączony do kamery wideo, która jest podłączona do podstawki pod kserokopiarkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). 
	UWAGA: Natężenie światła 2100-2200 luksów zapewnia dobrą jakość rejestrowanych zachowań do punktacji. Jednak warunki oświetlenia otoczenia w laboratorium są wystarczające, aby zaobserwować zaloty wywołane etanolem.</li>
	<li>Przygotuj przedmioty, które mają być użyte do ekspozycji na etanol przedstawione w <silna klasa="xfig">Rysunek 3B.</li>
	<li>Zbierz sześć czystych, zmontowanych pubów do zestawu eksperymentów i oznacz je kodami od 1 do 6. 
	UWAGA: Upewnij się, że umieściłeś losowe kody na genotypach much lub warunkach leczenia.</li>
</ol>
4. Ekspozycja na etanol (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
<ol>
	<li>Delikatnie przenieś grupę 33 samców do komory Flypub przez otwór w znaku 50 ml za pomocą małego lejka. 
	UWAGA: Aby zminimalizować naprężenia mechaniczne much, podczas przenoszenia umieść podkładkę pod mysz lub dowolny materiał amortyzujący pod pubem.</li>
	<li>Zakryj otwór taśmą. 
	UWAGA: Taśma służy do zamykania otworu, zapobiegając wydostawaniu się much z pubu.</li>
	<li>Wyrównaj puby na scenie od 1 do 6.</li>
	<li>Przyzwyczajaj muchy do komory przez 10 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D).</li>
	<li>Dostosuj ustawienia aparatu, w tym ostrość, zoom i jasność, a następnie nagraj ostatnie 5 minut aklimatyzacji, aby zmierzyć podstawowy poziom zalotów. 
	UWAGA: Aby wyeliminować odblaski generowane przez odbicie światła od pubu, umieść chusteczki laboratoryjne (zwykle 4 warstwy lub mniej niż 1 mm grubości) na dnie pubu, aby wyregulować kąt.</li>
	<li>Przygotuj waciki do dostarczania etanolu, przecinając podkładkę na cztery równe ćwiartki czystymi nożyczkami, a następnie przytnij rogi, aby zmieściła się na szalce Petriego podczas aklimatyzacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). 
	UWAGA: Nie używaj gołymi rękami do obsługi wacików. Używaj kleszczy do obchodzenia się z wacikami, aby uniknąć potencjalnego przenoszenia zapachów.</li>
	<li>Dodaj wacik do każdej szalki Petriego.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 95% etanolu do każdego wacika, upewnij się, że roztwór etanolu jest równomiernie rozprowadzony na całej powierzchni płatka.</li>
	<li>Przykryj dwuwarstwowymi chusteczkami laboratoryjnymi, aby uniknąć szybkiego parowania etanolu.</li>
	<li>Po aklimatyzacji umieść małą szalkę Petriego zawierającą wacik nasączony etanolem i dwuwarstwowe chusteczki laboratoryjne przez dolny otwór pubu.</li>
	<li>Wyrównaj puby na scenie, rozpocznij nagrywanie i jednocześnie uruchom stoper.</li>
	<li>Nagrywaj puby, w których znajdują się muchy podczas ekspozycji na etanol, dopóki muchy nie przestaną się zalecać lub poruszać z powodu uspokojenia.</li>
	<li>Usuń szalkę Petriego zawierającą etanol z każdego pubu za pomocą szpatułki, gdy ponad 90% much jest uspokojonych.</li>
	<li>Delikatnie przenieś muchy z powrotem do przypisanych im fiolek przez otwór w znaku 50 ml w pubie. 
	UWAGA: Umieść lejek na fiolkach z jedzeniem, aby ułatwić przenoszenie. Upewnij się, że umieściłeś uspokojone muchy z boku fiolek z jedzeniem, aby zapobiec ich utknięciu w jedzeniu.</li>
	<li>Oczyść puby etanolem, aby usunąć wszelkie zapachy i obficie spłucz je wiele razy pod bieżącą wodą destylowaną. Energicznie wstrząśnij pubami, aby usunąć nadmiar wody.</li>
	<li>Osusz puby, kładąc je poziomo na ręcznikach papierowych w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Muchy należy przechowywać w inkubatorze o temperaturze 25 °C o wilgotności względnej co najmniej 50% i cyklu 12 godzin światła / 12 godzin ciemności.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 4.1-4.17 co 24 godziny przez sześć kolejnych dni i upewnij się, że przeprowadzasz ekspozycję na etanol o tej samej porze dnia, aby uniknąć jakichkolwiek skutków okołodobowych. 
	UWAGA: Zmieniaj fiolki z jedzeniem co 2-3 dni, aby utrzymać zdrowe muchy.</li>
</ol>
5. Punktacja zalotów i analiza danych (<silna klasa="xfig">Rysunek 4-6)
<ol>
	<li>Otwórz nagrane filmy za pomocą odtwarzacza multimedialnego (np. VLC) i powiększ wideo, aby wyraźnie obserwować muchy do zdobycia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A).</li>
	<li>Dołącz kod czasowy do filmu (Rysunek 4B).</li>
	<li>Policz liczbę samców zaangażowanych w czynności związane z zalotami, w tym podążanie, jednostronne wysuwanie skrzydeł, łańcuch zalotów, krąg zalotów, zginanie brzucha i dosiadanie na każde 10 s bloku czasowego31 (<silna klasa="xfig">Rysunek 5).</li>
	<li>Wprowadź do arkusza liczbę samców wykazujących zaloty na każde 10 sekund bloku czasu (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A).</li>
	<li>Użyj maksymalnej liczby zalecających się samców w trzech kolejnych 10-sekundowych blokach czasowych jako reprezentatywnego punktu danych (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B).</li>
	<li>Oblicz średnią z 10 kolejnych punktów danych o najwyższej wartości (<silna klasa="xfig">Rysunek 6C), a to reprezentuje procent zalotów między mężczyznami na pub (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A).</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna (Rysunek uzupełniający 1)
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy statystycznej (np. Minitab 17) i dodaj dane dotyczące zalotów w arkuszu. 
	UWAGA: Można użyć dowolnego oprogramowania do analizy statystycznej.</li>
	<li>Aby określić rozkład danych (rozkład normalny lub nienormalny), przejdź do zakładki Statystyki, wybierz Podstawowe statystyki i kliknij opcję Test normalności (Rysunek uzupełniający 1Ai).</li>
	<li>W polu Zmienna wybierz poszczególne kolumny (każda kolumna reprezentuje zestaw danych badanego genotypu lub leczenia), wybierz test Andersona-Darlinga i kliknij przycisk OK (Rysunek uzupełniający 1Aii). 
	UWAGA: Wykres prawdopodobieństwa normalności pokaże obliczoną wartość P: jeśli wartość P jest większa niż 0,05, oznacza to, że dane mają rozkład normalny. Jeśli wartość P jest mniejsza niż 0,05, dane mają rozkład inny niż normalny (rysunek uzupełniający 1Aiii).</li>
	<li>Aby porównać wiele grup, ułóż kolumny do porównania, klikając kartę Dane, wybierz pozycję Stos, a następnie pozycję Kolumny (rysunek uzupełniający 1Bi).</li>
	<li>W oknie Stos kolumn wybierz kolumny danych, które mają zostać ułożone w stos, wybierz stos wykonany w obszarze Nowy arkusz lub Kolumna bieżącego arkusza z następną kolumną przeznaczoną do oznaczania indeksu dolnego (np. tożsamość grupy danych; Rysunek uzupełniający 1Bii-1Biii).</li>
	<li>Kliknij kartę Statystyki, wybierz test ANOVA, wybierz Ogólny model liniowy, a następnie kliknij Dopasuj ogólny model liniowy (Rysunek uzupełniający 1Ci).</li>
	<li>W oknie Ogólny model liniowy wybierz kolumny do porównania w polu Odpowiedzi, wybierz kolumnę z indeksem dolnym w polu Czynniki i kliknij przycisk OK, co prowadzi do wyników analizy statystycznej (Rysunek uzupełniający 1Cii-1Ciii).</li>
	<li>Aby porównać dwie grupy z danymi o rozkładzie normalnym, kliknij kartę Statystyki, wybierz Podstawowe statystyki i wybierz test t dla 2 prób (Rysunek uzupełniający 1Di).</li>
	<li>W oknie 2-Sample t for the Average (Średnia) wybierz opcję Each sample is in its own column (Każda próbka znajduje się w osobnej kolumnie) z listy rozwijanej wybierz dwie grupy do porównania w polach Sample 1 (Próbka 1) i Sample 2 (Próbka 2), a następnie kliknij przycisk OK, co spowoduje wyświetlenie wyników analizy statystycznej (Rysunek uzupełniający 1Dii-1Diii).</li>
	<li>Aby porównać dwie grupy z danymi o rozkładzie nienormalnym, przejdź do zakładki Stat, wybierz Nieparametryczne i kliknij Mann-Whitney (Rysunek uzupełniający 1Ei)</li>
	<li>W oknie Manna-Whitneya wybierz dwie grupy do porównania w polach Pierwsza próbka i Druga próbka, a następnie kliknij przycisk OK, co prowadzi do wyników analizy statystycznej (Rysunek uzupełniający 1Eii-1Eiii).</li>
	<li>W celu porównania trzech lub więcej grup danych o rozkładzie nienormalnym należy przejść do zakładki Statystyki, wybrać opcję Nieparametryczne, a następnie kliknąć test Kruskala-Wallisa (rysunek uzupełniający 1Fi).</li>
	<li>W oknie Kruskala-Wallisa wybierz kolumny do porównania w polu Odpowiedź, wybierz kolumnę z indeksem dolnym w polu Współczynnik i kliknij przycisk OK, co prowadzi do wyników analizy statystycznej (Rysunek uzupełniający 1Fii-1Fiii).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym raporcie opisaliśmy konfigurację i szczegółowy protokół testu Flypub; Nowatorska metoda mierzenia, w jaki sposób powtarzające się narażenie na etanol wyzwala odhamowane zaloty i uwrażliwienie behawioralne. Chociaż test Flypub jest stosunkowo prosty, kilka kroków wymaga ostrożności i uwagi, aby zapewnić wiarygodne wyniki. Po pierwsze, muszki do testów muszą być w pełni pigmentowane (tj. w pełni rozwinięte dorosłe muchy), zdrowe i nienaruszone. Deformacje lub uszkodzenia, zwłaszcza skrzydeł lub nóg, mogą wpływać na zdolność samca do zalecania się. Po drugie, wiek muchy jest ważny i musi być dopasowany między grupą kontrolną i eksperymentalną (optymalny wiek: 3-5 dni przy ekspozycji na etanol 1). Dwutygodniowe i starsze samce much typu dzikiego mają tendencję do wykazywania podwyższonego poziomu odinstalowanych zalotów31. W związku z tym właściwe dopasowanie wieku badanych much jest niezbędne, aby uniknąć zmiennych wyników. Po trzecie, istotna jest liczba much na pub (optymalnie: 33 na pub). Niższa lub wyższa liczba much w pubie może znacznie zniekształcić wyniki zalotów (dane nie pokazane). Po czwarte, komory Flypub muszą mieć identyczne objętości, jak pokazano na rysunku 2B. Gwarantuje to, że muchy odbierają parę etanolu synchronicznie, a wywołane zachowania są spójne. Po piąte, niezbędne jest wyraźne nagrywanie wideo i precyzyjna ocena zalotów. Protokół ten w dużym stopniu zależy od obserwacji behawioralnych, więc skrupulatne przestrzeganie standardowego protokołu oceny zalotów ma fundamentalne znaczenie dla zminimalizowania niespójnych wyników. Wreszcie, zdecydowanie zaleca się, aby zarówno ekspozycja na etanol, jak i etapy oceny zalotów były wykonywane na ślepo, gdy eksperymentator nie jest świadomy genotypów much lub eksperymentalnych zabiegów, zapobiegając w ten sposób błędowi eksperymentu.
Test Flypub ma wiele zalet. Po pierwsze, wiele grup much może być testowanych i porównywanych jednocześnie. Po drugie, jest niedrogi, prosty w konfiguracji i łatwy do nauczenia, dzięki czemu jest bardzo przystępny dla eksperymentatorów na wszystkich poziomach, w tym szkół podstawowych i średnich, studentów studiów licencjackich i magisterskich, doktorantów i wykładowców, a także laboratoriów dydaktycznych o ograniczonej przestrzeni i budżecie. Po trzecie, można go wykorzystać do pomiaru dodatkowych zachowań, takich jak odhamowane zaloty samic much i uspokajające działanie etanolu lub innych środków uspokajających, aby ocenić początkową wrażliwość i tolerancję, rozwój i utrzymanie31,32. Razem Flypub jest wszechstronną metodą badania różnych cech AUD.
Głównym ograniczeniem testu Flypub jest rygorystyczny i pracochłonny reżim punktacji zalotów. Zachowanie godowe pod wpływem etanolu jest bardzo dynamiczne w taki sposób, że czas trwania zalotów waha się od mniej niż jednej sekundy do wielu minut, a muchy zaangażowane w zaloty dość często się zmieniają. Przedstawiony tutaj system punktacji został opracowany w celu uwzględnienia tej dynamicznej natury i zapewnienia spójnych wyników dla indywidualnych ekspozycji na etanol dla danego genotypu 31,32. Jak zaznaczono w protokole, aktywność zalotów jest oceniana ręcznie, co jest czasochłonne. Opracowano kilka zautomatyzowanych programów punktacji, aby ułatwić bezstronne, wysokoprzepustowe badania behawioralne, z których wszystkie opierają się na ruchach i lokalizacjach poszczególnych much 39,40,41,42,43,44,45. Próbowaliśmy również opracować oprogramowanie komputerowe, które automatycznie liczyłoby aktywność zalotów, ale nie byliśmy w stanie uzyskać spójnych i wiarygodnych wyników. Może to wynikać z faktu, że ocena behawioralna obejmuje wiele etapów zalotów (tj. podążanie, jednostronne rozciąganie skrzydeł, zginanie brzucha i dosiadanie)35,36,46 wielu much jednocześnie. Nawet przy tym ograniczeniu, eksperymentator z odpowiednim przeszkoleniem powinien być w stanie określić ilościowo zachowania zalotów wywołane etanolem z konsekwencją i dokładnością. Niemniej jednak bardzo pomocne i ważne byłoby przyjęcie uczenia maszynowego lub innych zaawansowanych algorytmów jako kontynuacji.
Podobnie jak w przypadku modeli gryzoni, badania nad etanolem w modelu muchowym w dużej mierze koncentrowały się na stymulującym działanie lokomotoryczne i uspokajające etanolu. Test Flypub mierzy jednak odhamowane zaloty, rodzaj odhamowania poznawczego, który jest nowy31,32. Dlatego Flypub może pomóc w wyjaśnieniu graczy molekularnych, szlaków komórkowych i obwodów neuronalnych, a także czynników ryzyka (np. wieku, snu, diety lub środowiska społecznego) krytycznych dla odhamowania behawioralnego i uwrażliwienia. Wcześniej wykazaliśmy, że sygnalizacja dopaminy jest wymagana dla EIBS, co jest zgodne z wynikami w modelach gryzoni i ludziach 6,9,31. Również jako dowód słuszności koncepcji zbadaliśmy mutanta tβh pozbawionego choroby zwyrodnieniowej stawów (bezkręgowego odpowiednika noradrenaliny) i stwierdziliśmy, że choroba zwyrodnieniowa stawów jest również ważna dla behawioralnego uwrażliwienia na efekt odhamowywania etanolu, chociaż jego udział jest stosunkowo niewielki w porównaniu z dopaminą31. Odkrycie to kontrastuje z obserwacją Scholza47, że zmutowane muchy tβh nie wykazują oczywistych upośledzeń w uwrażliwieniu na lokomotoryczne działanie aktywujące etanol47. Sugeruje to odrębne szlaki molekularne, komórkowe i neuronalne pośredniczące w uwrażliwieniu behawioralnym na odhamowanie w porównaniu z aktywacją lokomotoryczną. Dalsze badania powinny dalej współpracować z tym kuszącym pojęciem.
Podsumowując, Flypub jest tanią, wieloaspektową i skuteczną metodą badania reakcji behawioralnych na etanol, w szczególności odhamowania i uwrażliwienia behawioralnego, która może pomóc w lepszym zrozumieniu AUD i zapewnić wgląd w skuteczne interwencje w przypadku tego przewlekłego zaburzenia.

Alkohol jest jednym z najłatwiej dostępnych i najczęściej spożywanych narkotyków na świecie. Ma wysoki potencjał do nadużywania i uzależnienia; Jednak mechanizm leżący u podstaw tego procesu pozostaje nie do końca poznany. Etanol wywołuje odhamowanie, euforię, upośledzenie funkcji poznawczych, nadpobudliwość, utratę kontroli motorycznej i uspokojenie u robaków1, muszki owocowe1,2,3, mice4, rats5 i ludzie6, wskazując na wspólne składniki neurobiologiczne pośredniczące w działaniu etanolu od bezkręgowców po ssaki, w tym ludzi. Przewlekłe przyjmowanie etanolu powoduje adaptacje neuronalne i modyfikacje behawioralne, które leżą u podstaw AUD. Jedną z adaptacji jest uczulenie behawioralne definiowane jako zwiększona reakcja z powtarzającymi się doświadczeniami z etanolem7,8,9 lub inne substancje uzależniające10,11,12.
Przez dziesięciolecia, badania nad uczulaniem behawioralnym wywołanym etanolem (EIBS) koncentrowały się na efekcie stymulującym motorykę, który jest używany jako wskaźnik reakcji euforycznej7,8,9,13. Na przykład szczury lub myszy po wielokrotnym (co 24, 48 lub 72 godzinach) podawaniu etanolu wykazują zwiększoną aktywność lokomotoryczną mierzoną prędkością chodu8,14,15,16,17,18,19,20,21. Podobnie, muszki owocowe poddane drugiej ekspozycji na opary etanolu 4 godziny po pierwszej ekspozycji wykazują zwiększoną reakcję lokomotoryczną, mierzoną również prędkością chodzenia22. Chociaż nie ma dostępnych informacji na temat mechanizmu leżącego u podstaw EIBS do efektu stymulującego ruch u muszek owocowych, badania na szczurach i myszach ujawniły składniki molekularne i sygnalizacyjne (na przykład układy dopaminy, glutaminianu i GABA), a także substraty i obwody nerwowe (na przykład brzuszny obszar nakrywki, jądro półleżące, ciało migdałowate i kora przedczołowa), które odgrywają główną rolę w EIBS6, 9,23.
Odhamowanie jest głównym efektem działania etanolu i prowadzi do przejawów zachowań, które zazwyczaj są ograniczone. Efekt odhamowujący wywierany jest na funkcje motoryczne, emocjonalne, społeczne, seksualne i poznawcze, co może prowadzić do niewłaściwych zachowań seksualnych, agresji werbalnej lub fizycznej oraz impulsywnych aktów u ludzi i modeli zwierzęcych24,25,26,27,28,29. Odhamowanie wywołane etanolem zostało zbadane w modelach zwierzęcych do badań mechanistycznych i obejmują one impulsywność ruchową i agresję u gryzoni i małp, a także odhamowanie żerowania u robaków6,9,24,28,29,30. Wykazaliśmy, że muszki owocowe wykazują odhamowane zachowania seksualne pod wpływem etanolu31. W szczególności, samce typu dzikiego rzadko zalecają się do innych samców bez etanolu31, a kiedy to robią, uprzejmości aktywnie odrzucają zaloty samców. Jednak pod wpływem etanolu samce much wykazują więcej zalotów do innych samców, a kurtuzany wykazują mniej odrzucenia, co skutkuje ogólnie zwiększonymi zalotami między samcami. Warto zauważyć, że muchy rozwijają behawioralne uczulenie na efekt odhamowania przy powtarzającej się ekspozycji na etanol, co służy jako unikalny system do badania EIBS31,32.
W tym raporcie opisujemy, jak skonfigurować, wykonać, rozwiązać problemy i przeanalizować test Flypub oraz dane do badania indukowanej etanolem dezynsekcji i uwrażliwienia u muszki owocowej Drosophila melanogaster. Aby zapewnić jego użyteczność i skuteczność, przetestowaliśmy Canton-S typu dzikiego (CS; szczep muchy kontrolnej) wraz z muchami z niedoborem tyraminy β hydroksylazy (tβh), która syntetyzuje oktopaminę (OA). Choroba zwyrodnieniowa stawów jest głównym neuromodulatorem u bezkręgowców33,34 i odgrywa kluczową rolę w rozwoju tolerancji etanolu u much22. Po raz pierwszy informujemy, że otwarty dostęp jest ważny dla EBI.

<table><tbody><tr><td>95 % etanolu</td><td>VWR Chemicals</td><td>BDH1158-4LP</td><td></td></tr><<tr><td>i>Canton-S</td><td>-</td><td>-</td><td>Wild type szczep używany jako kontrola</td></tr><tr><td>Stojak na kopie z ramionami</td><td>Kaiser</td><td>205411</td><td>model RS 2-XA, z jednym ramieniem centralnym i dwoma ramionami bocznymi; aby ustawić stację flypub</td></tr><tr><td>Bawełniane krążki</td><td>Swisspers</td><td>COT-027</td><td>do dostarczania etanolu</td></tr><tr><td>Przewyższać</td><td>Microsoft</td> <td>-</td> <td>do analizowania danych; można użyć dowolnego arkusza roboczego lub arkusza kalkulacyjnego</td></tr><tr><td>Żarówka fluorescencyjna</td><td>Lights of America</td> Maksymalnie <td>7108N</td><td>(maks. 120 V-70 W); do oświetlenia stacji flypub</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Microsoft LifeCam</td><td>Microsoft</td> <td>w</td> <td>wersji 3.60; do nagrywania flypubów</td></tr><tr><td>Microsoft LifeCam Studio</td><td>Microsoft</td><td>Q2F-00013</td><td>Czujnik HD 1080P; do nagrywania flypubów</td></tr><tr><td>Minitab 17</td><td></td> <td>Minitab-wersja</td> <td>17; do przeprowadzania analiz statystycznych; można użyć dowolnego oprogramowania do analizy statystycznej</td></tr><tr><td>Arkusz siatki nylonowej</td><td>Sefar Nitex-model</td><td></td> <td>B0043D1TVY, nieprzezroczysty biały, siatka 200 mikronów; do zrobienia flypub</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Sokół</td><td>08-757-100A</td><td>35 x 10 mm; do dostarczania etanolu</td></tr><tr><td>Lejek plastikowy - średniej wielkości</td><td>Fisher scientific</td><td>10-348A</td><td>średnica 65 mm i wysokość 67 mm; do przenoszenia uspokojonych much z flypubu do fiolki z jedzeniem</td></tr><tr><td>Lejek plastikowy - mały</td><td>Fisher scientific</td><td>07-202-121</td><td>średnica 4 mm i wysokość 46 mm; do przenoszenia much z fiolki do flypub</td></tr><tr><td>Arkusz poliwęglanu</td> Lexan-0,762 <td></td><td></td><td>mm grubość, przezroczysty, 610 x 1220 mm nominalny; zrobić flypub</td></tr><tr><td>Butelka okrągłodenna</td><td>Fisher scientific</td><td>AS115</td><td>polipropylen o wysokości 103 mm, średnicy 60 mm i pojemności 177 ml; zrobić</td></tr><tr><td>lutownicę</td> flypub <td>Weller</td><td>WES51</td><td>zrobić dziurę w flypub</td></tr><tr><td>Kod czasowy</td> <td>-</td><td></td> <td>plik .smi, kod czasowy tykający napisy utworzony w laboratorium Han; monitorowanie czasu podczas punktacji zalotów; za każdym razem, gdy można użyć napisów</td></tr><tr><td>Tyramina &#946; hydroksylaza (t&#946; h)</td><td>-</td><td>-</td><td>zmutowany szczep muchy (nM18 allel zerowy) z niedoborem t&#946; h w tle typu dzikiego Canton-S ; uzyskane od dr Andreasa Thuma (Uniwersytet w Lipsku, Leipzeig, Niemcy)</td></tr><tr><td>Odtwarzacz multimedialny VLC</td><td>VideoLAN-wersja</td><td></td> <td>3.0.8; do zdobywania zalotów można użyć dowolnego odtwarzacza multimedialnego</td></tr></tbody></table>

flypub do badania odhamowania behawioralnego i uwrażliwienia wywołanego etanolem

Flypub To Study Ethanol Induced Behavioral Disinhibition and Sensitization

Zaburzenia związane z używaniem alkoholu (AUD) pozostają poważnym problemem w naszym społeczeństwie. Aby opracować skuteczne interwencje w przypadku uzależnienia, ważne jest zrozumienie podstawowych mechanizmów neurobiologicznych, dla których potrzebne są różnorodne podejścia eksperymentalne i systemy modelowe. Głównym składnikiem napojów alkoholowych jest etanol, który powoduje zmiany adaptacyjne w ośrodkowym układzie nerwowym i zachowaniu przy przewlekłym spożyciu. W szczególności uwrażliwienie behawioralne (tj. eskalacja reakcji) stanowi kluczową zmianę adaptacyjną leżącą u podstaw uzależnienia. Większość badań uczulenia behawioralnego wywołanego etanolem na modelach zwierzęcych przeprowadzono na aktywującym ruch efekt etanolu. Wyraźnym efektem działania etanolu jest odhamowanie behawioralne. Uwrażliwienie behawioralne na efekt odhamowania etanolu jest jednak niedostatecznie reprezentowane. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy test Flypub, który umożliwia pomiar eskalacji wzrostu odhamowanych działań związanych z zalotami po powtarzającym się narażeniu na etanol u Drosophila melanogaster. Tutaj przedstawiamy krok po kroku test Flypub, w tym montaż komór do ekspozycji na etanol, konfigurację stacji testowej, kryteria opieki nad muchami i zbierania, dostarczanie etanolu, kwantyfikacja odhamowanych działań związanych z zalotami, przetwarzanie danych i analiza statystyczna. Podano również, jak rozwiązywać problemy z krytycznymi krokami, pokonywać ograniczenia i rozszerzać jego użyteczność w celu oceny dodatkowych zachowań wywołanych etanolem. Test Flypub w połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi w Drosophila melanogaster ułatwi zadanie odkrycia mechanizmu leżącego u podstaw uczulenia behawioralnego wywołanego etanolem.

W tej sekcji zaprezentowano wyniki reprezentatywnego eksperymentu Flypub. Samce Drosophila rzadko wykazują zachowania zalotne wobec innych samców35,36. Podczas pierwszej ekspozycji na etanol samce typu dzikiego Canton-S (CS) wykazały niewielki, lecz nieistotny wzrost odhamowania zachowań zalotnych między samcami31 (Rysunek 7A). Jednakże samce CS wykazały narastający wzrost odhamowanej aktywności zalotnej podczas kolejnych ekspozycji na etanol (ANOVA GLM, CS: R2=0.83, F(5,66) =65.21, p &lt; 0.0001; n = 12; Rysunek 7A), co wskazuje na behawioralną sensytyzację na efekt odhamowania wywołany przez etanol. Wykazaliśmy wcześniej, że ten typ EIBS wymaga dopaminy oraz receptora dopaminergicznego DopEcR w neuronach grzybkowatych31,32.
Aby ustalić, czy w EIBS uczestniczą dodatkowe neuromodulatory, zbadano rolę OA poprzez testowanie much (tβh; allel null nM18)37,38 wykazuje niedobór tyraminy β-hydroksylazy, enzymu ograniczającego szybkość biosyntezy OA, przez co wykazuje niedobór OA. tβh samce w Kardiologia / Choroby układu krążenia tło genetyczne (uprzejmie przekazane przez dr. Andreasa Thuma z Uniwersytetu w Lipsku w Niemczech) wykazywało uwrażliwioną odhamowaną reakcję godową po codziennej ekspozycji na etanol (ANOVA GLM, tβh: R2=0.67, F(5,66) =27.60, p &lt; 0.0001; n = 12; Rysunek 7B) lecz na poziomie obniżonym w stosunku do CS (ANOVA GLM, efekt interakcji: F =2.50, p &lt;0,034). W analizie post hoc, tβh samce wykazywały niższy poziom zalotów między samcami przy każdej ekspozycji, co było najbardziej widoczne podczas czwartej do szóstej ekspozycji na etanol w porównaniu z CS (Test t-Studenta dla dwóch prób: p &lt; 0,002 w EXP4, p &lt; 0,004 w EXP5, p &lt; 0,021 w EXP6; n = 12; Rycina 7C). Wspólnie wyniki te wskazują, że OA może odgrywać rolę w EIBS w odniesieniu do efektu odhamowania wywołanego przez etanol. Co ważniejsze, zestawy danych te wyraźnie demonstrują użyteczność i skuteczność testu Flypub w badaniu indukowanego etanolem odhamowania i uwrażliwienia.
<img alt="Schemat procesu testu Flypub; zbieranie samców much, ekspozycja na etanol, ocena wideo, analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat postępowania w teście Flypub. Schemat przepływu pracy przedstawiający kluczowe etapy przeprowadzania testu Flypub. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ równowagi hydraulicznej, zawierający narzędzia konstrukcyjne oraz schemat modyfikacji plastikowego kubka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Materiały i montaż komory Flypub. (A) Materiały niezbędne do budowy komory Flypub obejmują (i) wkład do kleju na gorąco, (ii) pistolet z klejem na gorąco, (iii) żyletkę, (iv) lutownicę, (v) linijkę, (vi) siatkę, (vii) arkusz poliwęglanu oraz (viii) okrągłodenna butelkę dla Drosophila. (B) Schematyczny rysunek montażu komory Flypub. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Konfiguracja komory wzrostu roślin, materiały, proces wycinania pasków papieru i test kiełkowania na płytkach z agarem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Ekspozycja na etanol. (A) W pełni zmontowana stacja Flypub. (B) Materiały wymagane do ekspozycji na etanol obejmują (i) mikropipetę P1000, (ii) taśmę, (iii) wacik bawełniany, (iv) szalkę Petriego, (v) chusteczki laboratoryjne, (vi) mały lejek, (vii) timer, (viii) średni lejek, (ix) podkładkę pod mysz, (x) nożyczki, (xi) 95% etanol, (xii) pęsetę oraz (xiii) szpatułkę. (C) Kroki postępowania przy wycinaniu wacików bawełnianych. (D) Widok z góry na publikacje ustawione na platformie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Interfejs oprogramowania VLC przedstawiający narzędzia do edycji wideo: efekty, filtry, geometrię, interaktywną analizę powiększenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Konfiguracja wideo do oceny behawioralnej. Przedstawiono instrukcję krok po kroku dotyczącą (A) sposobu powiększania obrazu w wideo oraz (B) sposobu wstawienia pliku z kodem czasowym do odtwarzacza multimedialnego VLC w celu oceny behawioralnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie zachowania Drosophila; schemat przedstawiający wzorce grupowania; wizualne dane z badań entomologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Zachowania godowe samców. Reprezentatywne obrazy ilustrują zachowania godowe samców Drosophila, w tym podążanie i jednostronne rozpościecieranie skrzydeł dla (A) pieśni godowej, (B) łańcucha godowego, (C) kręgu godowego, (D) zgięcia odwłoka oraz (E) mountingu, które są wykorzystywane do oceny behawioralnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig5large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza formuły w arkuszu kalkulacyjnym przy użyciu funkcji MAX i AVERAGE; przedstawione sekcje danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wprowadzanie i analiza danych. (A) Liczba samców zaangażowanych w zaloty w każdym 10 s bloku czasowym jest wpisywana do arkusza kalkulacyjnego. Najwyższa liczba samców zalotnych z trzech kolejnych 10 s bloków czasowych (zielona strzałka) jest wykorzystywana jako reprezentatywny punkt danych. Średnia z 10 kolejnych punktów danych (niebieski lub pomarańczowy nawias) o wartości maksymalnej reprezentuje procent zalotów między samcami na pub [pomarańczowy nawias; MAX (średnia), czarna strzałka]. (B,C) Formuły arkusza kalkulacyjnego użyte do obliczenia maksymalnego reprezentatywnego punktu danych oraz maksymalnej średniej z 10 kolejnych reprezentatywnych punktów danych na pub. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Procentowy udział zalotów między samcami w eksperymentach; wykresy A i B, linie regresji, wartości R²." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Wywołana etanolem odhamowanie behawioralne i sensytyzacja w CS i tβh. (A,B) The CS i tβh samce wykazywały uwrażliwioną odhamowanie zachowań godowych przy powtarzających się ekspozycjach na etanol (ANOVA GLM, CS: R2=0.83, F(5,66)=65.21, p &lt; 0.0001; tβh: R2=0.67, F(5,66)=27.60, p &lt; 0.0001; n = 12). (C) Te tβh samce wykazywały mniejszą odhamowaną aktywność godową w porównaniu do CS (n=12). The p Wartości analiz post hoc przedstawiono nad linią. Aktywność zalotną między samcami analizowano na podstawie filmów zarejestrowanych dla każdej ekspozycji na etanol. Wszystkie dane przedstawiono jako średnie ± standardowy błąd średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig7large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.</a>
Rysunek dodatkowy 1: Analiza statystyczna. Kroki w oprogramowaniu Minitab 17 dotyczące przeprowadzania (A) testu normalności, (B) układania danych w stosy, (C) testu ANOVA w ramach ogólnego modelu liniowego, (D) testu t dla dwóch prób, (E) testu Mann-Whitneya oraz (F) testu Kruskala-Wallisa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123supfig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Test Flypub mierzy zachowanie, jakie muszka owocowa Drosophila melanogaster przejawia pod wpływem etanolu. Test może być łatwo opanowany przez eksperymentatorów na wszystkich poziomach i stosowany do różnych odparowanych bodźców, ułatwiając badania nad nadużywaniem substancji i uzależnieniami.

Flypub do badania odhamowania behawioralnego i uwrażliwienia wywołanego etanolem

Alcohol use disorder (AUD) remains a serious problem in our society. To develop effective interventions for addiction, it is important to understand the ...

Test Flypub mierzy odhamowane zachowania pod wpływem alkoholu. Ułatwiając w ten sposób mechanistyczne badanie zaburzeń związanych z używaniem alkoholu. Alkohol jest jednym z najłatwiej dostępnych i najpowszechniej nadużywanych narkotyków na świecie.Neurobiologiczny mechanizm leżący u podstaw zaburzeń związanych z używaniem alkoholu nie jest jednak w pełni poznany. Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, była szeroko wykorzystywana do badania wpływu etanolu na euforię, lokomocję, odhamowanie i uspokojenie. Jest również używany do badania jego długich i trwałych zmian w zachowaniu związanym z uzależnieniem, takich jak tolerancja, uczulenie i poszukiwanie etanolu.Wiele badań na Drosophila i innych modelach zwierzęcych koncentruje się na aktywującym działanie lokomotoryczne etanolu. Wyraźnym efektem etanolu jest odhamowanie behawioralne. Jednak jego badanie jest raczej niedostatecznie reprezentowane.Aby rozwiązać ten kluczowy problem, opracowaliśmy test Flypub do pomiaru odhamowanego zachowania pod wpływem etanolu. Aby zmontować komorę Flypub, weź okrągłą butelkę i odetnij jej dolną część 25-mililitrowego znaku żyletką. Utwórz otwór w miejscu 50 mililitrów za pomocą gorącej lutownicy.Jest to punkt dostępu, w którym zostaną wprowadzone muchy. Umieść okrągłą siatkę o średnicy 54 milimetrów na znaku 75 mililitrów i zabezpiecz ją gorącym klejem. Umieść przezroczysty arkusz plastiku o średnicy 70 milimetrów na otwartym dolnym końcu i zabezpiecz go gorącym klejem.Aby upewnić się, że plastikowy krążek jest mocno przymocowany do dna, dociśnij go za pomocą obciążników. Zbierz samce much w grupę 33 osób. Umieść je na boku fiolki z jedzeniem.Umieść je w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza o wilgotności względnej co najmniej 50% i 12-godzinnym cyklu światła, 12-godzinnym ciemnym cyklu przez 2 dni przed ekspozycją na etanol. Przygotuj stację testową Flypub, włączając światła, komputer i kamerę do nagrywania wideo. Przygotuj sześć pubów do zestawu eksperymentów.Oznacz je numerami od jednego do sześciu. Delikatnie wprowadź muchy do pubu za pomocą małego lejka. Zamknij pub za pomocą taśmy.Aklimatyzuj muchy przez 10 minut. Podczas aklimatyzacji dostosuj ostrość kamery i nagraj ostatnie pięć minut aklimatyzacji. Podczas aklimatyzacji przygotuj waciki do podania etanolu.Pokrój wacik na cztery równe ćwiartki, a następnie przytnij rogi, aby pasował do szalki Petriego. Dodaj wacik do szalki Petriego. Dodaj jeden mililitr 95% etanolu do wacika.Upewnij się, że roztwór etanolu jest równomiernie rozprowadzony na całej powierzchni podkładki. Szybko przykryj szalkę Petriego chusteczkami laboratoryjnymi. Ostrożnie umieść szalkę Petriego zawierającą etanol pod każdym pubem.Wyrównaj puby na scenie. Rozpocznij nagrywanie i jednocześnie uruchom minutnik. Nagrywaj, dopóki muchy nie przestaną się zalecać lub poruszać.Usuń etanol zawierający szalkę Petriego, gdy ponad 90% much jest uspokojonych. Delikatnie przenieś uspokojone muchy z powrotem do fiolek z jedzeniem. Umieść je z powrotem w inkubatorze.Powtarzaj poprzednie kroki co 24 godziny przez sześć kolejnych dni. Otwórz wideo za pomocą odtwarzacza multimedialnego. Następnie oceń liczbę samców zaangażowanych w zaloty co 10 sekund.Czynności związane z zalotami, aby zdobyć punkty, obejmują: jednostronne przedłużenie skrzydła, łańcuch zalotów, krąg zalotów, zginanie brzucha i dosiadanie. Pokazane są reprezentatywne nagrania zachowania much. Podczas aklimatyzacji, gdzie samce nie wykazują dużej aktywności.Podczas pierwszej ekspozycji, w której samce wykazują sporadyczne zaloty. I podczas szóstej ekspozycji, w której samce wykazują aktywność zalotów. Wprowadź liczbę samców wykazujących zaloty w dziesięciosekundowym bloku czasu.Użyj maksymalnej liczby zalotnych samców w trzech kolejnych 10-sekundowych blokach czasu jako reprezentatywnego punktu danych. Średnia z 10 kolejnych punktów danych o najwyższej wartości reprezentuje odsetek zalotów między mężczyznami na pub. Dziki typ Canton-S wykazuje stopniowo zwiększoną aktywność odhamowanych zalotów po wielokrotnym narażeniu na etanol.Stanowi to behawioralne uwrażliwienie na efekt odhamowania etanolu. Zbadaliśmy rolę oktopaminy w uczuleniu, testując muchy, które są pozbawione beta-hydroksylazy tyraminy, T beta H, a więc z niedoborem oktopaminy. Podobnie jak Canton-S, mutanty T beta H wykazywały nasilone reakcje na powtarzającą się ekspozycję na etanol, ale na zmniejszonym poziomie.Kiedy porównaliśmy T beta H i Canton-S, zaobserwowaliśmy, że samce z mutacją T beta H wykazywały mniej odhamowane zaloty niż samce Canton-S w każdej ekspozycji, co wskazuje, że oktopamina może być ważna dla uczulenia. Teraz możesz konfigurować, przeprowadzać i analizować zachowania wywołane przez etanol za pomocą testu Flypub. Kluczowe punkty, o których należy pamiętać, to po pierwsze, prawidłowy montaż pubu.Po drugie, konsekwentne dostarczanie etanolu i po trzy, precyzyjna i bezstronna ocena behawioralna. Test Flypub ma wiele zalet. Jest prosty, niedrogi w konfiguracji i łatwy do nauczenia.Ponadto wiele grup much może być testowanych jednocześnie, co ułatwia to badanie w celu zidentyfikowania skutków manipulacji genetycznych lub eksperymentalnych. Test Flypub jest bardzo atrakcyjny dla eksperymentatorów na wszystkich poziomach, w tym uczniów szkół podstawowych i średnich, studentów studiów licencjackich i magisterskich, doktorantów i wykładowców. Podsumowując, test Flypub pozwoli Ci zidentyfikować graczy molekularnych, szlaki komórkowe, obwody mózgowe i czynniki ryzyka, które przyczyniają się do zaburzeń związanych z używaniem alkoholu.

flypub-to-study-ethanol-induced-behavioral-disinhibition

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Opisano prosty test służący do pomiaru działania sedatywnego etanolu na muszki Drosophila, oparty na utracie odruchu prostowania.

Prosty sposób pomiaru wrażliwości much na etanol

Drosophila stała się znaczącym modelowym systemem do analizowania komórkowych i molekularnych podstaw behawioralnych reakcji na alkohol. W tym miejscu przedstawiamy protokół zbierania danych dotyczących wrażliwości na alkohol w kontekście okołodobowym, który można łatwo zastosować w innych eksperymentach i dobrze nadaje się do badań licencjackich.

FlyBar: podawanie muchom alkoholu

Proste testy do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u Drosophila ułatwiają wykorzystanie tego organizmu modelowego do badania tych ważnych zachowań związanych z etanolem. W tym miejscu opisano stosunkowo prosty, skalowalny test do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u much.

Niedrogi, skalowalny test behawioralny do pomiaru wrażliwości i szybkiej tolerancji sedacji etanolem u Drosophila

Opisujemy protokół wywoływania nagradzających i nienagradzających doświadczeń u muszek owocowych (Drosophila melanogaster) przy użyciu dobrowolnego spożycia etanolu jako miary zmian w stanach nagrody.

Prosty sposób na zmierzenie zmian w zachowaniu związanym z poszukiwaniem nagrody za pomocą Drosophila melanogaster

Obecne metody pomiaru wrażliwości na alkohol u Drosophila są przeznaczone do testowania grup much. Przedstawiamy prosty, tani, wysokoprzepustowy test do oceny wrażliwości na sedację alkoholową u dużej liczby pojedynczych much. Metoda nie wymaga specjalistycznych narzędzi i może być wykonywana w dowolnym laboratorium przy użyciu powszechnie stosowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa metoda pomiaru czasu sedacji alkoholowej u poszczególnych osobników Drosophila melanogaster

Prezentowany tutaj jest protokół dla modelu 2BC/CIE uzależnienia od alkoholu u myszy do badania zaburzeń związanych z używaniem alkoholu.

Przewlekła przerywana ekspozycja na opary etanolu w połączeniu z wyborem dwóch butelek w celu modelowania zaburzeń związanych z używaniem alkoholu

Opisano procedurę badania zdolności kontekstu środowiskowego związanego z alkoholem do wywoływania u szczurów wznowienia zachowań związanych z poszukiwaniem alkoholu.

Procedura obserwacji wywołanego kontekstem odnowienia zachowań związanych z poszukiwaniem alkoholu uwarunkowanych przez Pawłowa u szczurów

Tutaj opisano metody rozwoju mysiego modelu podchronicznego i łagodnego stresu związanego z porażką społeczną i wykorzystano je do zbadania patogennych cech depresji, w tym objawów podobnych do hiperfagii i polidypsji po wzroście masy ciała.

Mysi model podchronicznego i łagodnego stresu porażki społecznej w celu zrozumienia deficytów behawioralnych i fizjologicznych wywołanych stresem

Nauka unikania shuttle-boxów jest dobrze ugruntowana w neuronauce behawioralnej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób uczenie się w pudełku wahadłowym u gryzoni można połączyć z specyficzną dla miejsca elektryczną mikrostymulacją wewnątrzkorową (ICMS) i jednoczesnymi przewlekłymi zapisami in vivo jako narzędzie do badania wielu aspektów uczenia się i percepcji.

Połączony trening w skrzynce wahadłowej z rejestracją i stymulacją kory elektrofizjologicznej jako narzędziem do badania percepcji i uczenia się

Gryzonie są odpowiednim modelem do badania molekularnych substratów zachowania i złożonych zaburzeń psychicznych. Mikroiniekcja mózgu u obudzonych gryzoni może być wykorzystana do wyjaśnienia substratów chorobowych. Przedstawiono skuteczną i konfigurowalną metodę mikroiniekcji mózgu, a także wykonanie paradygmatu instrumentalnego, który określa ilościowo motywację.

Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania

Poznaj metodę Flypub do badania odhamowania behawioralnego i uwrażliwienia wywołanego etanolem u Drosophila melanogaster. Ta technika pomaga identyfikować molekularne mechanizmy uzależnienia od alkoholu.

Flypub do badania odhamowania behawioralnego i uwrażliwienia wywołanego etanolem

Przeglądaj więcej filmów