Name: Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Poznaj metodę izolacji egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych myszy przy użyciu różnicowej ultrawirówki i gradientu gęstości sacharozy. Ta technika umożliwia badanie biomarkerów diagnostycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alessandra d'Azzo posiada Katedrę Genetyki i Terapii Genowej Jubilerów dla Dzieci (JFC). Praca ta była częściowo wspierana przez granty NIH R01GM104981, RO1DK095169 i CA021764, Fundację Asyżu w Memphis oraz American Libańsko-Syryjskie Organizacje Charytatywne.

Wszystkie procedury na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami na zwierzętach zatwierdzonymi przez St. Jude Children's Research Hospital, Institutional Animal Care and Use Committee oraz wytyczne National Institutes of Health.
1. Przygotowanie roztworów i mediów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór wytrawiający, mieszając 15,4 ml PBS z 2,5 ml kolagenazy P o stężeniu 20 mg/ml (stężenie końcowe 5 mg/ml), 2 ml 11 U/ml dyspazy II (stężenie końcowe 1,2 U/ml) i 100 μl 1,0 M CaCl2 (stężenie końcowe 5 mM).</li>
	<li>Przygotuj 500 ml pożywki dla pierwszorzędowych fibroblastów (DMEM complete), mieszając 440 ml DMEM z 50 ml FBS (10%), 5,0 ml wstrzykiwacza/paciorkowca (odpowiednio 100 U/ml i 100 μg/ml) i 5,0 ml suplementu glutaminy (2 mM). Filtruj i sterylizuj pożywkę za pomocą filtra próżniowego o wielkości porów 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować surowicę wolną od egzosomów przez nocne ultrawirowanie FBS w probówkach polipropylenowych o pojemności 38,5 ml w temperaturze 100 000 x g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej probówki.</li>
	<li>Przygotuj 500 ml pożywki wolnej od egzosomów, mieszając 440 ml DMEM z 50 ml surowicy wolnej od egzosomów (10%), 5 ml wstrzykiwacza / paciorkowca (100 U / ml i 100 μg / ml) i 5 ml suplementu glutaminy (2 mM). Filtruj i sterylizuj pożywkę za pomocą filtra próżniowego o wielkości porów 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) rozpuszczając 6,057 g zasady Tris w 90 ml dH2O i dostosowując pH do 7,4 za pomocą HCl. Dostosuj objętość do 100 ml za pomocą dH2O.</li>
	<li>Przygotować 10 mM roztworu Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM Mg(Ac)2 (roztwór roboczy sacharozy), mieszając 97,9 ml dH2O z 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH = 7,4) i 100 μl 1 M Mg(Ac)2. Inhibitory proteazy dodać do roztworu tuż przed użyciem i utrzymywać roztwór na lodzie.</li>
	<li>Przygotować roztwory gradientu gęstości sacharozy na lodzie zgodnie z tabelą 1. Roztwory te wystarczą do przygotowania dwóch probówek z gradientem sacharozy.</li>
	<li>Przygotuj 100% TCA, dodając 40 ml dH2O do 100 g proszku TCA i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Dostosować końcową objętość za pomocą dH2O do 100 ml.</li>
	<li>Przygotuj 80% etanolu, mieszając 20 ml dH2O z 80 ml 100% etanolu.</li>
	<li>Przygotować bufor do biegania western blot, mieszając 1,8 l dH2O z 200 ml 10-krotnego buforu do biegania.</li>
	<li>Przygotować bufor do przenoszenia western blot przez zmieszanie 1,4 l dH2O z 200 ml 10 x buforu transferowego i 400 ml metanolu. Wstępnie schłodzić bufor transferowy do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 20x sól fizjologiczną buforowaną Tris (TBS), rozpuszczając 122 g zasady Tris i 180 g chlorku sodu w 850 mldH2O(pH 8,0). Ustaw głośność na 1 L za pomocą dH2O.</li>
	<li>Przygotować bufor blokujący, rozpuszczając 5 g odtłuszczonego mleka w proszku w 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS i 94 mldH2O.</li>
	<li>Przygotować bufor przeciwciał, rozpuszczając 3 g BSA w 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS i 94 mldH2O.</li>
	<li>Przygotować bufor do płukania, mieszając 100 ml 20x TBS i 20 ml 10% Tween-20 (10x) z 1,88 ldH2O.</li>
	<li>Przygotować roztwór rozwijający, mieszając 1 objętość luminolu/uszlachetnianie z 1 objętością stabilnego buforu nadtlenkowego.</li>
</ol>
2. Analiza mięśnia myszy mięsiowatego brzuchatego łydki (GA)15,16
<ol>
	<li>Przygotować na lodzie probówki o pojemności 50 ml zawierające 10 ml PBS.</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji w komorze CO2, a następnie zwichnięciu szyjki macicy.</li>
	<li>Usuń mięsień brzuchaty łydki z obu nóg i przenieś je do rurki z PBS na lodzie. 
	UWAGA: Usuń mięsień płaszczkowaty z mięśnia zielonego przed przeniesieniem mięśnia zielonego do PBS.</li>
</ol>
3. Pierwotna izolacja i hodowla fibroblastów myszy
<ol>
	<li>Zważ mięśnie i przenieś je do 10-centymetrowego naczynia pod kapturem bezpieczeństwa biologicznego. Zmiel mięśnie skalpelami, aż stanie się delikatną pastą.</li>
	<li>Przenieść drobno rozdrobnioną pastę mięśniową do probówki o pojemności 50 ml i dodać 3,5 razy objętość/mg tkanki roztworu trawiącego do probówki i inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C. Dokładnie wymieszać zawiesinę pipetą o pojemności 5 ml co 10 minut (pomoże to w całkowitej dysocjacji). 
	UWAGA: Alternatywnie do tego kroku można użyć dysocjatora tkankowego.</li>
	<li>Dodać 20 ml DMEM complete do zawiesiny komórkowej, aby dezaktywować roztwór trawiący. Przenieść do sitka z nylonu o średnicy 70 μm umieszczonego na probówce o pojemności 50 ml. Zebrać przepływ i umyć sitko komórkowe dodatkowymi 5 ml DMEM complete.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut i ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 ml kompletnego DMEM i wysiać komórki w naczyniu o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 3 % O2 (pasaż 0 lub P0). 
	UWAGA: 1) Kultury te muszą być utrzymywane na niskim poziomie tlenu, aby zapewnić warunki fizjologiczne (poziomO2 w mięśniach szkieletowych wynosi około 2,5%)17. 2) Numer pasażu (np. P0) hodowli komórkowej jest zapisem liczby przypadków, w których kultura była subhodowana. 3) Pierwotne fibroblasty w P0 są rutynowo hodowane do 100% konfluencji plus 1 dzień (i tylko dla P0). Ma to na celu oczyszczenie innych typów komórek i zapewnienie, że komórki obecne w hodowli to tylko fibroblasty, pozbawione komórek miogennych na podstawie badania mikroskopowego. Mięśnie szkieletowe dorosłego zwierzęcia w wieku 2 miesięcy zawierają około 2% miogennych przodków4. Ponadto przodkowie miogenni zwykle nie przyczepiają się do niepowlekanych naczyń; W związku z tym są one tracone podczas podkulturowania18,19,20. Komórki miogenne wymagają innego podłoża (F10) uzupełnionego o 20% FBS i podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)18. W DMEM kompletne, średnie fibroblasty mają wyższy współczynnik proliferacji niż komórki miogenne, co powoduje eliminację tych zanieczyszczających komórek przed pierwszym pasażem.</li>
	<li>Przepłucz komórki P0 PBS, gdy 100% zlewa się plus 1 dzień. Dodać 1 ml roztworu trypsynizacyjnego i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 3% O2 w celu odłączenia komórek. Zatrzymaj aktywność enzymatyczną, używając 10 ml DMEM complete.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad w 20 ml kompletnego DMEM i wysiać w naczyniu o średnicy 15 cm (przejście 1 lub P1). Komórki są hodowane do 80%-90% konfluencji i mogą być ekspandowane do pasażu 3, 
	UWAGA: W zależności od dalszych eksperymentów można użyć przejścia 1, przejścia 2 (P2) lub przejścia 3 (P3).</li>
</ol>
4. Wysiewanie komórek i zbieranie kondycjonowanego podłoża
<ol>
	<li>Przemyć fibroblasty (P1, P2 lub P3) 10 ml PBS, dodać 2,5 ml roztworu trypsynizacji do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 3% O2 . Zatrzymaj aktywność enzymatyczną, stosując 10 ml DMEM complete. 
	UWAGA: Po przejściu 4 komórki pierwotne są odrzucane i nie powinny być używane do dalszych eksperymentów, ponieważ zmieniają charakterystykę.</li>
	<li>Zebrać komórki i odwirować przy 300 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki wolnej od egzosomów i policzyć komórki.</li>
	<li>Wysiewać komórki w temperaturze 1,5–2,0 x 106 komórek na naczynie (15 cm) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 3% O2 .</li>
	<li>Kondycjonowaną pożywkę należy zbierać przez 16–24 godzin w probówkach o pojemności 50 ml na lodzie. 
	UWAGA: Jeśli komórki nie są w 80% zlewne, można ponownie dodać świeżą pożywkę wolną od egzosomalnego i zebrać ją po dodatkowym okresie 16–24 godzin. Obie kolekcje można łączyć w celu dalszej obróbki.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie egzosomów za pomocą wirowania różnicowego i ultra-wirowania
UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze 4 °C lub na lodzie. W razie potrzeby zrównoważyć rurkę rurką wypełnioną wodą.
<ol>
	<li>Odwirować kondycjonowaną pożywkę o sile 300 x g przez 10 minut w celu usunięcia żywych komórek i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Usunąć martwe komórki przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 10 minut i przenieść supernatant do probówki polipropylenowej o pojemności 38,5 ml.</li>
	<li>Odwirować supernatant przy 10 000 x g przez 30 minut w celu usunięcia organelli, ciał apoptotycznych i fragmentów błony. Przenieść supernatant do ultra przezroczystej probówki o pojemności 38,5 ml.</li>
	<li>Ultraodwiruj supernatant przy 100 000 x g przez 1,5 godziny, aby osadzać egzosomy.</li>
	<li>Ostrożnie wyrzuć supernatant, pozostawiając około 1 ml kondycjonowanej pożywki i umyj osad egzosomu w całkowitej objętości 30 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Wirować przy 100 000 x g przez 1,5 godziny i ostrożnie wyrzucić supernatant przez pipetowanie, uważając, aby nie naruszyć egzosomalnego osadu.</li>
	<li>Zawiesić osad w lodowatym PBS (~25 μL na 15 cm naczynie) i zmierzyć stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA i czytnika mikropłytek przy 562 nm. 
	UWAGA: Stężenie białka mierzy się przez rozcieńczenie 1:2 z 0,1% Triton-X100 w dH2O. Wydajność egzosomów z 15 cm szalki (20 ml kondycjonowanej pożywki) pierwotnych fibroblastów przy 80% zbiegu wynosi ~3–4 μg.</li>
</ol>
6. Charakterystyka egzosomów za pomocą gradientu gęstości sacharozy
<ol>
	<li>Załaduj gradient sacharozy do ultra przezroczystej probówki o pojemności 13 ml, pipetując (od dołu do góry) następujące elementy: 1,5 ml z 2,0 M, 2,5 ml z 1,3 M, 2,5 ml z 1,16 M, 2,0 ml z 0,8 M i 2,0 ml z 0,5 M roztworów sacharozy.</li>
	<li>Wymieszaj 30–100 μg egzosomów z 0,25 M roztworem sacharozy i dostosuj objętość do 1 ml.</li>
	<li>Ostrożnie załaduj egzosomy na wierzch gradientów i ultraodwiruj próbki przez 2,5 godziny w temperaturze 100 000 x g i 4 °C.</li>
	<li>Wyjmij probówki z ultrawirówki i umieść je na lodzie i zbierz frakcje o pojemności 1,0 ml, zaczynając od góry gradientu. Przenieś je do probówek o pojemności 1,7 ml na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 110 μl 100% TCA do każdej probówki, dobrze wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 10 000 x g i RT i ostrożnie wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 500 μl wstępnie schłodzonego 80% etanolu i pozostawić próbki do przemycia na 10 minut w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g i temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Suszyć osad przez 10–15 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić go w PBS do eksperymentów in vitro. Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA lub ponownie zawieś osad bezpośrednio w 14,5 μl dH2O, 5 μl 4x buforu Laemmli i 0,5 μl 1 M DTT do analiz western blot.</li>
</ol>
7. Wykrywanie egzosomów za pomocą analizy western blot
<ol>
	<li>Zmieszać 5–10 μg egzosomów z kroku 5.7 z 5 μl 4x buforu Laemmli i 0,5 μl 1 M DTT, a następnie dostosować końcową objętość do 20 μl za pomocą dH2O. Podgrzewać wszystkie próbki, w tym te z kroku 6.9, przez 5 minut w temperaturze 98 °C.</li>
	<li>Załaduj próbki do 10% bezplamistego żelu TGX i załaduj drabinki białkowe zgodnie z zaleceniami producenta. 
	UWAGA: Wybierz procentową zawartość żelu w zależności od masy cząsteczkowej interesującego Cię białka.</li>
	<li>Uruchom żel pod napięciem 100 V przez ~1 godzinę w buforze do momentu, gdy barwnik ładujący znajdzie się na dnie żelu. 
	UWAGA: Czas pracy może się różnić w zależności od używanego sprzętu lub rodzaju i procentowej zawartości żelu.</li>
	<li>Wyobraź sobie żel. Obrazy bezplamnych żeli są wykorzystywane jako kontrola obciążenia dla immunoblotów.</li>
	<li>Przelewać żel za pomocą membrany PVDF przez 1,5 godziny przy napięciu 80 V lub przez noc przy napięciu 30 V w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zablokować membrany w buforze blokującym na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować błony dla swoistych przeciwciał (tabela 2) w buforze przeciwciał przez noc w temperaturze 4 °C z mieszaniem.</li>
	<li>Przemyć błony w buforze płuczącym i inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (tabela 2) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem.</li>
	<li>Umyj membrany w buforze myjącym i zobrazuj membrany za pomocą roztworu wywoływania i imagera opartego na kamerze. Alternatywnie użyj filmu rentgenowskiego do wywołania membran.</li>
</ol>

<ol><li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+Extracellular+Vesicles%2C+Their+Origin%2C+Composition%2C+Purpose%2C+and+Methods+for+Exosome+Isolation+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis.</a> Cells. 8 (7), 727(2019).</li>
<li>Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+Isolation%2C+Characterization%2C+Biological+Function%2C+and+Multifarious+Therapeutic+Approaches+of+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes.</a> Cells. 8 (4), 307(2019).</li>
<li>Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+biogenesis%2C+biologic+function+and+clinical+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential.</a> Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).</li>
<li>van de Vlekkert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+exosome+release+is+the+pathogenic+pathway+linking+a+lysosomal+deficiency+to+generalized+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis.</a> Science Advances. 5 (7), 3270(2019).</li>
<li>Rackov, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vesicle-Mediated+Control+of+Cell+Function%3A+The+Role+of+Extracellular+Matrix+and+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment.</a> Frontiers in Physiology. 9, 651(2018).</li>
<li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li>
<li>Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+vesicles+in+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular vesicles in renal fibrosis.</a> Cell Death and Disease. 10 (5), 367(2019).</li>
<li>Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+role+of+extracellular+vesicles+and+exosomes+in+the+pathogenesis+of+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Respiratory+Diseases%2C+Thoracic+Surgery%2C+Intensive+Care+and+Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis.</a> Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).</li>
<li>Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+exosomes+in+liver+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Research%22%5BJournal%5D)">Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology.</a> Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).</li>
<li>Machado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+lysosomal+exocytosis+mediates+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression.</a> Science Advances. 1 (11), 1500603(2015).</li>
<li>Tian, W., Liu, S., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+exosomes+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Potential role of exosomes in cancer metastasis.</a> Biomed Research International. , 4649705(2019).</li>
<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease.</a> Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).</li>
<li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield%2C+purity+and+downstream+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Science Reports. 9 (1), 5335(2019).</li>
<li>Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+and+challenges+in+the+recovery+and+purification+of+cellular+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes.</a> Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).</li>
<li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mitochondria+from+Minimal+Quantities+of+Mouse+Skeletal+Muscle+for+High+Throughput+Microplate+Respiratory+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53217(2015).</li>
<li>Lee, Y. S. Muscle Dissection in mouse. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8">https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8</a> (2016).</li>
<li>Mas-Bargues, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+oxygen+concentration+in+stem+cell+culture+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195(2019).</li>
<li>Bois, P. R., Grosveld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKHR+%28FOX01a%29+is+required+for+myotube+fusion+of+primary+mouse+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts.</a> The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).</li>
<li>Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+rat+muscle+progenitor+cells+have+decreased+proliferation+and+myotube+formation+during+passages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages.</a> Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).</li>
<li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117(2014).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Kluczowym krokiem dla pomyślnego wyizolowania egzosomów z pożywki hodowlanej, jak opisano w niniejszym protokole, jest prawidłowe ustanowienie i utrzymanie pierwotnych kultur fibroblastów myszy z dorosłych mięśni szkieletowych. Kultury te muszą być utrzymywane na niskim poziomie tlenu, aby zapewnić warunki zbliżone do fizjologicznych (poziomO2 w mięśniach szkieletowych wynosi ~2,5%)15. Pierwotne fibroblasty zmienią charakterystykę, gdy zostaną przekazane do hodowli zbyt wiele razy. W zw...

Egzosomy to niejednorodne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe o rozmiarach od 30 do 150 nm. Są uznanymi kluczowymi graczami w procesach fizjologicznych i patologicznych, biorąc pod uwagę ich wszechobecne rozmieszczenie w tkankach i narządach1,2. Egzosomy przenoszą złożony ładunek białek, lipidów, typów DNA i typów RNA, które różnią się w zależności od typu komórek, z których pochodzą1,2,3. Egzosomy są wzbogacone w białka, które pełnią różne funkcje (tj. tetraspaniny, w tym CD9 i CD63) są odpowiedzialne za zdarzenia fuzji. Na przykład białka szoku cieplnego HSP70 i HSP90 biorą udział w wiązaniu i prezentacji antygenu. Ponadto Alix, Tsg101 i flotylina uczestniczą w biogenezie i uwalnianiu egzosomów i są szeroko stosowane jako markery tych nanopęcherzyków2,3,4.
Egzosomy zawierają również różne rodzaje RNA (np. mikroRNA, długie niekodujące RNA, rybosomalne RNA), które mogą być przenoszone do komórek odbiorcy, gdzie wpływają na dalsze przesyłanie sygnału3. Będąc otoczonym pojedynczą błoną jednostkową, bioaktywność egzosomów zależy nie tylko od ładunku białek i kwasów nukleinowych, ale także od składników lipidowych błony ograniczającej1. Błony egzosomalne są wzbogacone w fosfatydyloserynę, kwas fosfatydynowy, cholesterol, sfingomielinę, kwas arachidonowy i inne kwasy tłuszczowe, z których wszystkie mogą wpływać na stabilność egzosomów i topologię błony2,3. W wyniku ułożenia ładunku i lipidów egzosomy inicjują szlaki sygnałowe w komórkach odbiorczych i uczestniczą w utrzymaniu prawidłowej fizjologii tkanek1,2,4,5. Wykazano, że w pewnych warunkach patologicznych (np. neurodegeneracja, zwłóknienie i rak) wywołują i rozprzestrzeniają bodźce patologiczne4,6,7,8,9,10,11.
Dzięki swojej zdolności do przekazywania sygnałów do sąsiednich lub odległych miejsc, egzosomy stały się cennymi biomarkerami do diagnozowania lub prognozowania stanów chorobowych. Ponadto egzosomy zostały wykorzystane eksperymentalnie jako nośniki związków terapeutycznych2,12. Potencjalne zastosowanie tych nanopęcherzyków w praktyce klinicznej sprawia, że metoda izolacji staje się coraz ważniejsza w celu osiągnięcia maksymalnej wydajności, czystości i odtwarzalności. Opracowano i wdrożono różne techniki izolacji egzosomów. Ogólnie rzecz biorąc, egzosomy można wyizolować z kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych lub płynów ustrojowych za pomocą wirowania różnicowego, chromatografii wykluczania wielkości i wychwytywania immunologicznego (przy użyciu dostępnych na rynku zestawów). Każde podejście ma unikalne zalety i wady, które zostały omówione wcześniej1,2,13,14.
Opisany protokół skupia się na 1) izolacji i hodowli pierwotnych fibroblastów z dorosłego mięśnia brzuchatego łydki myszy oraz 2) oczyszczaniu i charakterystyce egzosomów uwalnianych do pożywki hodowlanej przez te komórki. Obecnie brakuje dobrze ugruntowanego protokołu izolacji egzosomów z pierwotnych fibroblastów do badań funkcjonalnych. Pierwotne fibroblasty nie wydzielają dużych ilości egzosomów, co sprawia, że proces izolacji i oczyszczania jest trudny. Protokół ten opisuje oczyszczanie dużych ilości czystych egzosomów z dużych objętości kultur przy zachowaniu ich integralności morfologicznej i aktywności funkcjonalnej. Oczyszczone egzosomy uzyskane z kondycjonowanej pożywki zostały z powodzeniem wykorzystane w eksperymentach wychwytu in vitro w celu indukowania specyficznych szlaków sygnałowych w komórkach biorcy. Zostały one również wykorzystane do porównawczych analiz proteomicznych ładunków egzosomalnych z wielu próbek biologicznych4.

<table><tbody><tr><td>Szalki 10 cm</td><td>Midwest Scientific, TPP</td><td>TP93100</td><td></td></tr><tr><td>Szalki 15 cm</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP93150</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej Frakcja V</td><td>Roche</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5430R z wirnikami FA-35-6-30/ FA-45-48-11</td> System obrazowania <td>Eppendorf</td><td>022620659/5427754008</td><td></td></tr><tr><td>Chemidoc MP</td><td>BioRad</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza P</td><td>Sigma, Roche</td><td>11 213 857 001</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Millipore/Sigma, Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Criterion Blotter z elektrodami płytkowymi</td><td>BioRad</td><td></td><td></td>1704070</tr><tr><td>Criterion TGX bezbarwny żel białkowy</td><td>BioRad</td><td>5678034</td><td>10% 18-well, midi-gel</td></tr><tr><td>Criterion pionowe ogniwo do elektroforezy (midi)</td><td>BioRad</td><td>NC0165100</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma, Roche</td><td>04 942 078 001</td><td>neutralna proteaza, stopień II</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma/Millipore, Roche</td><td>10708984001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modyfikacja Eagles Medium</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>Pharmco firmy Greenfield Global</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik mikropłytek Fluostar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P Membrany transferowe</td><td>Bufor do próbek Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli (4x)</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór octanu magnezu</td><td>Sigma</td><td>63052-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>LabScientific</td><td>M-0842</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator O2/CO2</td><td>Sanyo</td><td>MC0-18M</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td>10 000 U/ml</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek premium</td><td>Fisher Scientific, Midwest Scientific</td><td>AVSC1510</td><td>1,7 ml</td></tr><tr><td>Chronione jednorazowe skalpele</td><td>Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do biegania</td><td>BioRad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Sterylny system filtracji próżniowej</td><td>Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Sterylne sitko do komórek (70 mm)</td><td>Fisher Scientific, marka</td> <td>Fisher22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west Femto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34096</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne rurki polipropylenowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Bufor transferowy</td><td>BioRad</td><td>16110734</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy</td><td>Sigma</td><td>91228-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>BioRad</td><td>1610719</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100 roztwór</td><td>Sigma</td><td>93443-100mL</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Enzyme Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>12604-013</td><td>No phenol red</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioRad</td><td>#1610781</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-wirówka Optima XPM</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99842</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-przezroczysta probówka (14x89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-przezroczyste rurki (25x89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna Isotemp 220</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS220</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Egzosomy to małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe uwalniane przez praktycznie wszystkie komórki i wydzielane we wszystkich płynach biologicznych. Opracowano wiele metod izolacji tych pęcherzyków, w tym ultrawirowanie, ultrafiltrację i chromatografię wykluczania wielkości. Jednak nie wszystkie nadają się do oczyszczania i charakteryzowania egzosomów na dużą skalę. Przedstawiono tutaj protokół ustanawiania kultur pierwotnych fibroblastów wyizolowanych z mięśni szkieletowych dorosłych myszy, a następnie oczyszczania i charakteryzowania egzosomów z pożywki hodowlanej tych komórek. Metoda opiera się na zastosowaniu sekwencyjnych etapów wirowania, po których następują gradienty gęstości sacharozy. Czystość preparatów egzosomalnych jest następnie weryfikowana za pomocą analiz western blot przy użyciu baterii markerów kanonicznych (tj. Alix, CD9 i CD81). Protokół opisuje, jak izolować i koncentrować bioaktywne egzosomy do mikroskopii elektronowej, spektrometrii mas i eksperymentów wychwytu do badań funkcjonalnych. Można go łatwo skalować w górę lub w dół i dostosować do izolacji egzosomów z różnych typów komórek, tkanek i płynów biologicznych.

Niniejszy protokół nadaje się do kosztowo efektywnej puryfikacji egzosomów z dużych objętości medium warunkowanego. Procedura ta jest wysoce powtarzalna i spójna. Rysunek 1 przedstawia obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) egzosomów oczyszczonych z medium hodowlanego pierwotnych fibroblastów myszy. Rysunek 2 pokazuje wzorzec ekspresji białek kanonicznych markerów egzosomalnych oraz brak zanieczyszczeń białkami cytozolowymi (LDH) i białkami retiku...

Ten protokół ilustruje 1) izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego łydki dorosłej myszy, a także 2) oczyszczanie i charakterystykę egzosomów za pomocą różnicowej metody ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizami western blot.

Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Zaletą stosowania wirowania różnicowego w tym protokole jest to, że można je łatwo skalować do litrów, a zatem idealnie nadaje się do izolowania egzosomów od pierwotnych fibroblastów. Oczyszczone egzosomy można uzyskać z różnych typów komórek i tkanek wyizolowanych z różnych modeli chorobowych. Egzosomy mogą być używane jako biomarkery diagnostyczne.Demonstruje tę procedurę Diantha van de Vlekkert, naukowiec z Laboratorium d'Azzo Na początek zważ mięśnie myszy, a następnie przenieś je na 10-centymetrową szalkę. Pracując pod kapturem bezpieczeństwa biologicznego, zmiel mięśnie skalpelami, aby uzyskać delikatną pastę. Przenieś drobno zmieloną pastę mięśniową do 50-mililitrowej probówki i dodaj roztwór trawiący, używając 3,5-krotności objętości na miligram tkanki.Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby pomóc w całkowitej dysocjacji, należy dokładnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety o pojemności 5 mililitrów co 10 minut. Aby dezaktywować roztwór wytrawiający, dodaj 20 mililitrów DMEM Complete do zawiesiny komórek.Pipetować przez 70-mikrometrowe nylonowe sitko komórkowe umieszczone na 50-mililitrowej probówce, a następnie umyć sitko komórkowe dodatkowymi 5 mililitrami DMEM Complete. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach DMEM Complete.Zasiej komórki w 10-centymetrowym naczyniu, a następnie umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 3% tlenu. Kultury fibroblastów mięśni szkieletowych muszą być utrzymywane na niskim poziomie tlenu, aby zapewnić fizjologiczne warunki świetlne. Poziom tlenu w mięśniach szkieletowych wynosi około 2,5%Po osiągnięciu przez komórki 100% zbieżności, hoduj je przez dodatkowy dzień, a następnie przepłucz je PBS i dodaj jeden mililitr roztworu trypsynizacji.Po inkubacji komórek przez 10 minut przerwij trypsynizację, dodając 10 mililitrów DMEM Complete. Przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki, a następnie odwiruj komórki w sile 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić osad w 20 mililitrach DMEM i zasiać komórki w 15-centymetrowym naczyniu.Zbierz kondycjonowaną pożywkę z hodowanych fibroblastów w 15-mililitrowej probówce. Odwirować kondycjonowaną pożywkę o masie 300 g przez 10 minut, aby osadzać żywe komórki. Przenieść supernatant do nowej 50-mililitrowej probówki i zagnieździć martwe komórki, odwirowując probówkę o wadze 2 000 g przez 10 minut.Następnie przenieś supernatant do 38,5-mililitrowej probówki polipropylenowej i odwiruj probówkę o wadze 10 000 g przez 30 minut, aby usunąć organelle, ciała apoptotyczne i fragmenty błony. Aby osadzać egzosomy, przenieś supernatant do ultraprzezroczystej probówki o pojemności 38,5 mililitra i ultraodwiruj go przy 100 000 g przez 1,5 godziny. Ostrożnie wyrzucić supernatant, pozostawiając około jednego mililitra kondycjonowanego podłoża.Umyj granulkę egzosomu i ponownie zawieś ją w maksymalnie 30 mililitrach lodowatego PBS. Ponownie odwiruj egzosomy przy 100 000 g przez 1,5 godziny. Aby zakończyć oczyszczanie, usunąć supernatant przez pipetowanie, uważając, aby nie naruszyć egzosomalnego osadu.Krok granulatu egzosomu może być luźny i łatwo odczepiony. Dlatego usuwanie supernatantu PBS powinno być wykonane bardzo ostrożnie za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Ponownie zawiesić granulkę w lodowatym PBS, używając 25 mikrolitrów na 15-centymetrowe naczynie fibroblastów.Na koniec zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA i czytnika mikropłytek o długości 562 nanometrów. Protokół ten jest wysoce powtarzalną i spójną metodą oczyszczania egzosomów. Transmisyjna mikroskopia elektronowa pokazuje stosunkowo jednolite rozmiary tych egzosomów.Immunoblot lizatów egzosomów wykazuje kanoniczny wzorzec ekspresji białek i brak zanieczyszczeń białkowymi LDH i kalneksyną. Egzosomy oddzielono gradientem gęstości sacharozy, a poszczególne frakcje badano na western blot z przeciwciałami przeciwko Alix, CD9 i CD81. Egzosomy konsekwentnie sedymentowały się we frakcjach od trzeciej do szóstej.Wyizolowane i skoncentrowane bioaktywne egzosomy mogą być wykorzystywane do analiz mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas, a także do eksperymentów absorpcyjnych in vitro i in vivo do badań funkcjonalnych. Protokół ten jest odpowiedni do izolacji egzosomów z komórek o niskim poziomie wydzielniczym i może być stosowany do badania udziału egzosomów w chorobach zwłóknienia u ludzi.

isolation-characterization-exosomes-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Prezentujemy techniki izolacji, hodowli, charakterystyki i różnicowania ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych mięśni (hMPC) uzyskanych z tkanki biopsji mięśni szkieletowych.  hMPC uzyskane i scharakteryzowane za pomocą tych metod mogą być wykorzystane do późniejszego rozwiązywania problemów badawczych związanych z ludzką miogenezą i regeneracją mięśni szkieletowych.

Izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych mięśni i fibro-adipogennych komórek progenitorowych z indywidualnych mięśni szkieletowych u myszy. Protokół obejmuje rozwarstwienie pojedynczego mięśnia, izolację komórek macierzystych przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, ocenę czystości za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz ilościowy pomiar wejścia w fazę S za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny.

Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

Ten protokół ma na celu izolację i oczyszczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych (SkM-EVs) z tkanek mięśni gryzoni poprzez mechaniczne oderwanie, dysocjację enzymatyczną, filtrację i ultrawirowanie różnicowe. Świadczy o spójności i niezawodności. Wyizolowane SkM-EV dostarczają informacji na temat homeostazy i chorób mięśni, z potencjalnymi zastosowaniami jako biomarkery diagnostyczne lub nośniki terapeutyczne.

Enzymatyczna izolacja śródmiąższowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Ten protokół opisuje izolację nienaruszonych pojedynczych włókien mięśniowych z utlenianego mięśnia podkolanowego oraz ustanowienie wysoce czystych kultur mioblastów pochodzących z tych włókien. Zoptymalizowana procedura niezawodnie przynosi około 300–500 nienaruszonych miofibryli na jednego mysza, umożliwiając dalszą molekularną i komórkową analizę.

Test izolacji pojedynczych włókien do oceny utleniania zachowania miofibrili

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Poznaj metodę izolacji egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych myszy przy użyciu różnicowej ultrawirówki i gradientu gęstości sacharozy. Ta technika umożliwia badanie biomarkerów diagnostycznych.

Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów