Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych
May 16th, 2020
Ten protokół ilustruje 1) izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego łydki dorosłej myszy, a także 2) oczyszczanie i charakterystykę egzosomów za pomocą różnicowej metody ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizami western blot.
Zaletą stosowania wirowania różnicowego w tym protokole jest to, że można je łatwo skalować do litrów, a zatem idealnie nadaje się do izolowania egzosomów od pierwotnych fibroblastów. Oczyszczone egzosomy można uzyskać z różnych typów komórek i tkanek wyizolowanych z różnych modeli chorobowych. Egzosomy mogą być używane jako biomarkery diagnostyczne.
Demonstruje tę procedurę Diantha van de Vlekkert, naukowiec z Laboratorium d'Azzo Na początek zważ mięśnie myszy, a następnie przenieś je na 10-centymetrową szalkę. Pracując pod kapturem bezpieczeństwa biologicznego, zmiel mięśnie skalpelami, aby uzyskać delikatną pastę. Przenieś drobno zmieloną pastę mięśniową do 50-mililitrowej probówki i dodaj roztwór trawiący, używając 3,5-krotności objętości na miligram tkanki.
Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby pomóc w całkowitej dysocjacji, należy dokładnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety o pojemności 5 mililitrów co 10 minut. Aby dezaktywować roztwór wytrawiający, dodaj 20 mililitrów DMEM Complete do zawiesiny komórek.
Pipetować przez 70-mikrometrowe nylonowe sitko komórkowe umieszczone na 50-mililitrowej probówce, a następnie umyć sitko komórkowe dodatkowymi 5 mililitrami DMEM Complete. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach DMEM Complete.
Zasiej komórki w 10-centymetrowym naczyniu, a następnie umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 3% tlenu. Kultury fibroblastów mięśni szkieletowych muszą być utrzymywane na niskim poziomie tlenu, aby zapewnić fizjologiczne warunki świetlne. Poziom tlenu w mięśniach szkieletowych wynosi około 2,5%Po osiągnięciu przez komórki 100% zbieżności, hoduj je przez dodatkowy dzień, a następnie przepłucz je PBS i dodaj jeden mililitr roztworu trypsynizacji.
Po inkubacji komórek przez 10 minut przerwij trypsynizację, dodając 10 mililitrów DMEM Complete. Przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki, a następnie odwiruj komórki w sile 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić osad w 20 mililitrach DMEM i zasiać komórki w 15-centymetrowym naczyniu.
Zbierz kondycjonowaną pożywkę z hodowanych fibroblastów w 15-mililitrowej probówce. Odwirować kondycjonowaną pożywkę o masie 300 g przez 10 minut, aby osadzać żywe komórki. Przenieść supernatant do nowej 50-mililitrowej probówki i zagnieździć martwe komórki, odwirowując probówkę o wadze 2 000 g przez 10 minut.
Następnie przenieś supernatant do 38,5-mililitrowej probówki polipropylenowej i odwiruj probówkę o wadze 10 000 g przez 30 minut, aby usunąć organelle, ciała apoptotyczne i fragmenty błony. Aby osadzać egzosomy, przenieś supernatant do ultraprzezroczystej probówki o pojemności 38,5 mililitra i ultraodwiruj go przy 100 000 g przez 1,5 godziny. Ostrożnie wyrzucić supernatant, pozostawiając około jednego mililitra kondycjonowanego podłoża.
Umyj granulkę egzosomu i ponownie zawieś ją w maksymalnie 30 mililitrach lodowatego PBS. Ponownie odwiruj egzosomy przy 100 000 g przez 1,5 godziny. Aby zakończyć oczyszczanie, usunąć supernatant przez pipetowanie, uważając, aby nie naruszyć egzosomalnego osadu.
Krok granulatu egzosomu może być luźny i łatwo odczepiony. Dlatego usuwanie supernatantu PBS powinno być wykonane bardzo ostrożnie za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Ponownie zawiesić granulkę w lodowatym PBS, używając 25 mikrolitrów na 15-centymetrowe naczynie fibroblastów.
Na koniec zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA i czytnika mikropłytek o długości 562 nanometrów. Protokół ten jest wysoce powtarzalną i spójną metodą oczyszczania egzosomów. Transmisyjna mikroskopia elektronowa pokazuje stosunkowo jednolite rozmiary tych egzosomów.
Immunoblot lizatów egzosomów wykazuje kanoniczny wzorzec ekspresji białek i brak zanieczyszczeń białkowymi LDH i kalneksyną. Egzosomy oddzielono gradientem gęstości sacharozy, a poszczególne frakcje badano na western blot z przeciwciałami przeciwko Alix, CD9 i CD81. Egzosomy konsekwentnie sedymentowały się we frakcjach od trzeciej do szóstej.
Wyizolowane i skoncentrowane bioaktywne egzosomy mogą być wykorzystywane do analiz mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas, a także do eksperymentów absorpcyjnych in vitro i in vivo do badań funkcjonalnych. Protokół ten jest odpowiedni do izolacji egzosomów z komórek o niskim poziomie wydzielniczym i może być stosowany do badania udziału egzosomów w chorobach zwłóknienia u ludzi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół ilustruje izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z dorosłego mięśnia brzucha myszy i oczyszczanie oraz charakteryzację egzosomów metodą dyferencyjnej ultrawirówki w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, następującą po analizach western blot. Zdolność do izolacji egzosomów z pierwotnych fibroblastów sprawia, że ta metoda jest istotna do badania ich potencjału jako biomarkerów diagnostycznych.
Kluczowe komponenty badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Badania egzosomów
- Choroby włóknienia
Tło
- Izolacja pierwotnych fibroblastów zapewnia wgląd w mechanizmy komórkowe.
- Egzosomy odgrywają krytyczną rolę w komunikacji komórkowej i mogą służyć jako biomarkery chorobowe.
- Technika ta pozwala na skalowalną izolację egzosomów z różnych tkanek.
Zastosowane metody
- Dyferencyjna ultrawirówka do oczyszczania egzosomów
- Mięsień brzucha myszy jako układ biologiczny
- Analizy western blot do charakteryzacji
Główne wyniki
- Pomyślnie izolowano i scharakteryzowano egzosome z fibroblastów.
- Obserwowano spójny wzór sedymentacji egzosomów przez gradienty sacharozy.
- Wykazano brak zanieczyszczeń białkowych w oczyszczonych egzosomach.
Wnioski
- To badanie ustanawia reproduktywnę metodę izolacji egzosomów, która może przyczynić się do zrozumienia chorób włóknienia.
- Wyniki podkreślają potencjalne zastosowania terapeutyczne egzosomów w diagnostyce.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolating exosomes from primary skeletal muscle fibroblasts enables scalable production of extracellular vesicles for biomarker discovery and functional studies in fibrotic disease models. The protocol supports reproducible purification using differential centrifugation and sucrose density gradients, facilitating downstream applications such as mass spectrometry and electron microscopy. This approach enhances target validation by providing a consistent source of bioactive exosomes for mechanistic de-risking in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fibroblast-derived exosome content to clarify paracrine signaling mechanisms in tissue homeostasis and fibrosis.
- Operational Value: Provides a scalable method to isolate exosomes from primary cells, supporting consistent supply for target pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Purified exosomes yield quantitative protein and lipid profiles suitable for assay standardization and biomarker panel development.
- Operational Value: The method allows for large-volume processing, enabling high-throughput screening of exosome-associated cargo across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Exosomes isolated from disease-relevant fibroblasts support translational biomarker alignment and preclinical functional validation.
- Operational Value: The protocol’s adaptability to various tissues and fluids facilitates cross-model continuity in target de-risking studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from early target biology to preclinical validation, particularly for studies involving stromal cell communication and extracellular vesicle-mediated signaling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on fibroblast exosome roles in fibrosis progression and intercellular signaling.
- Screening: Enables standardized preparation of exosome samples for comparative analysis of cargo composition under varying conditions.
- Analytics: Generates western blot, electron microscopy, and mass spectrometry-ready samples for multi-omic characterization.
- Translational Research: Connects fibroblast exosome isolation to preclinical models of fibrotic disease through consistent, scalable vesicle production.
- Enterprise Reuse: The protocol is adaptable across cell types and tissues, positioning it as a reusable platform for exosome-based biomarker programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability in exosome purity and yield.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized centrifugation and gradient purification steps.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing reliable biomarker candidates from mechanistically relevant cell sources.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of exosome-driven diagnostic or therapeutic avenues based on consistent functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, ultracentrifugation, and western blot techniques.
- Dependent on access to ultracentrifugation equipment and sucrose gradient preparation capabilities.
- Necessitates standardization across teams for consistent exosome yield and purity assessment.
- Adaptation to human or diseased tissue models may require optimization of digestion and culture conditions.
- Practical limitations include potential co-isolation of protein aggregates if gradient steps are not carefully executed.
