Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych
16 maja 2020
Ten protokół ilustruje 1) izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego łydki dorosłej myszy, a także 2) oczyszczanie i charakterystykę egzosomów za pomocą różnicowej metody ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizami western blot.
Zaletą stosowania wirowania różnicowego w tym protokole jest to, że można je łatwo skalować do litrów, a zatem idealnie nadaje się do izolowania egzosomów od pierwotnych fibroblastów. Oczyszczone egzosomy można uzyskać z różnych typów komórek i tkanek wyizolowanych z różnych modeli chorobowych. Egzosomy mogą być używane jako biomarkery diagnostyczne.
Demonstruje tę procedurę Diantha van de Vlekkert, naukowiec z Laboratorium d'Azzo Na początek zważ mięśnie myszy, a następnie przenieś je na 10-centymetrową szalkę. Pracując pod kapturem bezpieczeństwa biologicznego, zmiel mięśnie skalpelami, aby uzyskać delikatną pastę. Przenieś drobno zmieloną pastę mięśniową do 50-mililitrowej probówki i dodaj roztwór trawiący, używając 3,5-krotności objętości na miligram tkanki.
Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby pomóc w całkowitej dysocjacji, należy dokładnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety o pojemności 5 mililitrów co 10 minut. Aby dezaktywować roztwór wytrawiający, dodaj 20 mililitrów DMEM Complete do zawiesiny komórek.
Pipetować przez 70-mikrometrowe nylonowe sitko komórkowe umieszczone na 50-mililitrowej probówce, a następnie umyć sitko komórkowe dodatkowymi 5 mililitrami DMEM Complete. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach DMEM Complete.
Zasiej komórki w 10-centymetrowym naczyniu, a następnie umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 3% tlenu. Kultury fibroblastów mięśni szkieletowych muszą być utrzymywane na niskim poziomie tlenu, aby zapewnić fizjologiczne warunki świetlne. Poziom tlenu w mięśniach szkieletowych wynosi około 2,5%Po osiągnięciu przez komórki 100% zbieżności, hoduj je przez dodatkowy dzień, a następnie przepłucz je PBS i dodaj jeden mililitr roztworu trypsynizacji.
Po inkubacji komórek przez 10 minut przerwij trypsynizację, dodając 10 mililitrów DMEM Complete. Przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki, a następnie odwiruj komórki w sile 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić osad w 20 mililitrach DMEM i zasiać komórki w 15-centymetrowym naczyniu.
Zbierz kondycjonowaną pożywkę z hodowanych fibroblastów w 15-mililitrowej probówce. Odwirować kondycjonowaną pożywkę o masie 300 g przez 10 minut, aby osadzać żywe komórki. Przenieść supernatant do nowej 50-mililitrowej probówki i zagnieździć martwe komórki, odwirowując probówkę o wadze 2 000 g przez 10 minut.
Następnie przenieś supernatant do 38,5-mililitrowej probówki polipropylenowej i odwiruj probówkę o wadze 10 000 g przez 30 minut, aby usunąć organelle, ciała apoptotyczne i fragmenty błony. Aby osadzać egzosomy, przenieś supernatant do ultraprzezroczystej probówki o pojemności 38,5 mililitra i ultraodwiruj go przy 100 000 g przez 1,5 godziny. Ostrożnie wyrzucić supernatant, pozostawiając około jednego mililitra kondycjonowanego podłoża.
Umyj granulkę egzosomu i ponownie zawieś ją w maksymalnie 30 mililitrach lodowatego PBS. Ponownie odwiruj egzosomy przy 100 000 g przez 1,5 godziny. Aby zakończyć oczyszczanie, usunąć supernatant przez pipetowanie, uważając, aby nie naruszyć egzosomalnego osadu.
Krok granulatu egzosomu może być luźny i łatwo odczepiony. Dlatego usuwanie supernatantu PBS powinno być wykonane bardzo ostrożnie za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Ponownie zawiesić granulkę w lodowatym PBS, używając 25 mikrolitrów na 15-centymetrowe naczynie fibroblastów.
Na koniec zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA i czytnika mikropłytek o długości 562 nanometrów. Protokół ten jest wysoce powtarzalną i spójną metodą oczyszczania egzosomów. Transmisyjna mikroskopia elektronowa pokazuje stosunkowo jednolite rozmiary tych egzosomów.
Immunoblot lizatów egzosomów wykazuje kanoniczny wzorzec ekspresji białek i brak zanieczyszczeń białkowymi LDH i kalneksyną. Egzosomy oddzielono gradientem gęstości sacharozy, a poszczególne frakcje badano na western blot z przeciwciałami przeciwko Alix, CD9 i CD81. Egzosomy konsekwentnie sedymentowały się we frakcjach od trzeciej do szóstej.
Wyizolowane i skoncentrowane bioaktywne egzosomy mogą być wykorzystywane do analiz mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas, a także do eksperymentów absorpcyjnych in vitro i in vivo do badań funkcjonalnych. Protokół ten jest odpowiedni do izolacji egzosomów z komórek o niskim poziomie wydzielniczym i może być stosowany do badania udziału egzosomów w chorobach zwłóknienia u ludzi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego dorosłej myszy oraz oczyszczanie i charakterystykę egzosomów z wykorzystaniem metody różnicowego ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizy western blot. Zdolność do izolacji egzosomów z pierwotnych fibroblastów sprawia, że metoda ta jest istotna dla badania ich potencjału jako biomarkerów diagnostycznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórki
- Badania nad egzosomami
- Choroby włókniejące
Wstęp
- Izolacja pierwotnych fibroblastów pozwala na zrozumienie mechanizmów komórkowych.
- Egzosomy odgrywają kluczową rolę w komunikacji międzykomórkowej i mogą służyć jako biomarkery chorób.
- Technika ta umożliwia skalowalną izolację egzosomów z różnych tkanek.
Zastosowane metody
- Różnicowe ultrawirowanie w celu oczyszczania egzosomów
- Mięsień brzuchaty łydki myszy jako system biologiczny
- Analizy Western blot w celu charakterystyki
Główne wyniki
- Pomyślnie wyizolowano i scharakteryzowano egzosomy z fibroblastów.
- Zaobserwowano spójny wzorzec sedymentacji egzosomów w gradientach sacharozy.
- Wykazano brak zanieczyszczeń białkowych w oczyszczonych egzosomach.
Wnioski
- Niniejsze badanie ustanawia powtarzalną metodę izolacji egzosomów, która może przyczynić się do zrozumienia chorób włókniejących.
- Wyniki podkreślają potencjalne zastosowania terapeutyczne egzosomów w diagnostyce.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja egzosomów z pierwotnych fibroblastów mięśni szkieletowych umożliwia skalowalną produkcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do odkrywania biomarkerów oraz badań funkcjonalnych w modelach chorób włóknistych. Protokół ten zapewnia powtarzalne oczyszczanie z wykorzystaniem wirowania różnicowego oraz gradientów gęstości sacharozy, co ułatwia dalsze zastosowania, takie jak spektrometria mas i mikroskopia elektronowa. Podejście to usprawnia walidację celów terapeutycznych poprzez dostarczenie spójnego źródła bioaktywnych egzosomów do oceny mechanizmów w badaniach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę zawartości egzosomów pochodzących z fibroblastów w celu wyjaśnienia mechanizmów sygnalizacji parakrynnej w homeostazie tkankowej i włóknieniu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia skalowalną metodę izolacji egzosomów z komórek pierwotnych, co pozwala na uzyskanie spójnych próbek do analizy wybranych szlaków sygnałowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Oczyszczone egzosomy dostarczają ilościowych profili białkowych i lipidowych, które nadają się do standaryzacji testów i opracowywania paneli biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Metoda ta pozwala na przetwarzanie dużych objętości, co umożliwia wysokoprzepustowy screening ładunku związanego z egzosomami w różnych warunkach eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Egzosomy wyizolowane z fibroblastów istotnych dla danej choroby wspierają dopasowanie translacyjnych biomarkerów oraz przedkliniczną walidację funkcjonalną.
- Wartość operacyjna: Adaptacyjność protokołu do różnych tkanek i płynów ułatwia zachowanie ciągłości między różnymi modelami w badaniach nad redukcją ryzyka związanego z celem terapeutycznym.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od wczesnych badań nad biologią celu po walidację przedkliniczną, w szczególności w badaniach dotyczących komunikacji komórek zrębowych oraz sygnalizacji za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących roli egzosomów fibroblastów w progresji włóknienia i sygnalizacji międzykomórkowej.
- Screening: Umożliwia standaryzowane przygotowanie próbek egzosomów do analizy porównawczej składu ładunku w różnych warunkach.
- Analityka: Pozwala na generowanie próbek gotowych do analizy metodą western blot, mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas w celu charakterystyki multiomicznej.
- Badania translacyjne: Łączy izolację egzosomów fibroblastów z przedklinicznymi modelami chorób włóknistych poprzez spójną i skalowalną produkcję pęcherzyków.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Protokół jest adaptowalny dla różnych typów komórek i tkanek, co pozycjonuje go jako platformę wielokrotnego użytku dla programów poszukiwania biomarkerów opartych na egzosomach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie zmienności czystości i wydajności egzosomów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji etapów wirowania i oczyszczania w gradiencie.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wiarygodnych kandydatów na biomarkery z mechanistycznie istotnych źródeł komórkowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację diagnostycznych lub terapeutycznych kierunków opartych na egzosomach z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o spójne dane funkcjonalne.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w zakresie pierwotnych kultur komórkowych, ultrawirowania oraz technik western blot.
- Metoda jest zależna od dostępu do sprzętu do ultrawirowania oraz możliwości przygotowania gradientu sacharozy.
- Konieczna jest standaryzacja działań między zespołami w celu zapewnienia spójnej wydajności izolacji i oceny czystości egzosomów.
- Adaptacja do modeli ludzkich lub tkanek chorobowych może wymagać optymalizacji warunków trawienia i hodowli.
- Ograniczenia praktyczne obejmują możliwość współizolacji agregatów białkowych, jeśli stopnie gradientu nie zostaną precyzyjnie wykonane.
