Name: Analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji CENP-A znakowanego EYFP (EYFP-CENP-A) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj analizę spektrometrii mas do identyfikacji ubikwitylacji EYFP-CENP-A w komórkach ludzkich. Ta metoda umożliwia wykrycie miejsc modyfikacji białek centromerowych kluczowych dla funkcjonowania komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Chao-Jun Li z Centrum Badań nad Modelowymi Zwierzętami Uniwersytetu w Nankinie za analizę spektrometrii mas. Dziękujemy Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawie i obecnym naukowcom z Model Animal Research Center, Nanjing University i Greehey Children's Cancer Research Institute za pomocną dyskusję, wskazówki eksperymentalne i odczynniki. Dziękujemy Donowi W. Clevelandowi, Daniele Fachinettiemu, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, Johnowi Thompsonowi, Lawrence'owi S. Kirschnerowi, Amruta Ashtekar, Benowi E. Blackowi, Glennisowi A. Logsdonowi, Kenjiemu Tago i Dawn S. Chandler za hojne dary w postaci odczynników. Y.N. był wspierany przez Fundusz Budowlany Prowincji Jiangsu "Podwójnie Pierwszej Klasy", Fundusz Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (SBK2019021248), Szesnasty Fundusz Sześciu Szczytów Wielkich Talentów Prowincji Jiangsu (TD-SWYY-001), Fundusz Prowincji Jiangsu "Program Stu Talentów Ekspertów Zagranicznych" (SBK2019010048) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych w Chinach (31970665). Badanie to było częściowo wspierane przez grant NCI R21 CA205659.

<ol><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li>
<li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li>
<li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li>
<li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment%2C+Maintenance%2C+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li>
<li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+CENP-A%3A+marks+of+distinction%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li>
<li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li>
<li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).</li>
<li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratrico+peptide+repeat+interactions%3A+to+TPR+or+not+to+TPR%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li>
<li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li>
<li>Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W tym miejscu opisaliśmy metody analizy spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji mutanta EYFP-CENP-A K124R, co sugeruje, że znakowanie EYFP indukuje ubikwitylację przy innej lizynie w zmutowanym białku CENP-A K124R8. W naszych wynikach udało nam się zidentyfikować ubikwitylację lizyny 306 (K306) w EYFP-CENP-A K124R, która odpowiada lizynie 56 (K56) w CENP-A poprzez analizę spektrometrii mas. Opisana tutaj analiza spektrometrii mas jest metodą mimiczną, ponieważ wcześniej zidentyfikowal...

U większości eukariontów mikrotubule wrzecionowate muszą przyczepiać się do pojedynczego regionu każdego chromosomu, określanego jako centromer. Kinetochor to kompleks białek, które znajdują się w centromerze. Badanie czasu ruchów centromerów i białek kinetochorowych oraz struktury kinetochorów i centromerów jest ważne dla zrozumienia niestabilności chromosomów (CIN) i progresji raka. Kluczowe pytania dotyczą tego, w jaki sposób określa się lokalizację i funkcję chromosomów centromerów (tj. tożsamość centromerów) oraz w jaki sposób uczestniczą one w dokładnej segregacji chromosomów. U większości gatunków obecność specjalnego nukleosomu zawierającego specyficzne białko podobne do histonów zwane CENP-A określa tożsamość centromerów. W związku z tym proponuje się, że CENP-A jest nie-DNA wskaźnikiem (znacznikiem epigenetycznym) tożsamości centromerów. Ważne jest, aby wyjaśnić mechanizm, w jaki sposób CENP-A definiuje tożsamość centromerów u ludzi.
Białko rozpoznające złącze Hollidaya (HJURP) to opiekun specyficzny dla CENP-A, który deponuje CENP-A w centromerowych nukleosomach1,2,3. Wcześniej informowaliśmy, że ligaza CUL4A-RBX1-COPS8 E3 jest wymagana do ubikwitylacji CENP-A na lizynie 124 (K124) i lokalizacji centromerów4. Ponadto nasze wyniki pokazały, że rekrutacja centromerów nowo zsyntetyzowanego CENP-A wymaga wcześniej istniejącego ubikwitylowanego CENP-A5. W związku z tym dostarczono model sugerujący, że ubikwitylacja CENP-A jest dziedziczona poprzez dimeryzację między podziałami komórkowymi.
W przeciwieństwie do naszych ustaleń oraz wyników Yu et al., ostatnio opublikowano negatywne wyniki dotyczące CENP-A i jego lokalizacji centromerowej6. W artykule stwierdzono, że modyfikacje CENP-A lizyny 124 (K124) są zbędne dla ustanowienia, utrzymania i długotrwałego funkcjonowania ludzkich centromerów, w oparciu o ich negatywne wyniki pokazujące, że mutacja K124R nie wpłynęła na lokalizację centromerów CENP-A ani na żywotność komórek6. Jest jednak wystarczająco dużo miejsca na dyskusję w ich wynikach i wnioskach, a jaki problem może wystąpić już w ich poprzedniej publikacji7. Należy zwrócić uwagę, że połączyli białka z CENP-A, które mają znacznie większą masę cząsteczkową niż rozmiar endogennego CENP-A: np. połączyli białko żółtej fluorescencji o masie ~30 kDa (EYFP) do ~16 kDa CENP-A i przeanalizowali białko fuzyjne EYFP-CENP-A K124R w swoim systemie nokautującym RPE-1 CENP-A-/F. Nie oczekuje się, że ubikwityna K124 wiąże się bezpośrednio z HJURP na podstawie przewidywań strukturalnych4, jednak przewiduje się, że dodanie mono-ubikwityny będzie miało wpływ na konformację białka CENP-A. Białko konformacji CENP-A może być zmienione przez obecność dużego białka fuzyjnego, a ta zmiana konformacyjna może maskować zmiany strukturalne spowodowane utratą ubikwitylacji. Sugerujemy, że fuzja białka o dużych rozmiarach indukuje ubikwitylację lizyny innej niż K124 w mutancie EYFP-CENP-A K124R, a ta ubikwitylacja w innym miejscu hamuje / maskuje oryginalny fenotyp pojedynczego mutanta K124R. Dowody na to, że ubikwitylacja zachodzi przy różnych lizynach w zmutowanym białku CENP-A K124R z białkiem dużego znacznika (EYFP), zostały przedstawione w naszej poprzedniej publikacji8. Stwierdzono, że znakowanie EYFP indukuje ubikwitynację innego miejsca lizyny EYFP-CENP-A K124R i że mutant EYFP-CENP-A K124R wiąże się z HJURP. W rezultacie, ta ubikwitylacja w innym miejscu hamuje/maskuje oryginalny fenotyp pojedynczego mutanta K124R, a zarówno mutanty EYFP-CENP-A WT, jak i K124R wykazały lokalizację centromerów (użyliśmy i porównaliśmy mutanta pBabe-EYFP-CENP-A WT i K124R, wraz z kontrolą pBabe-EYFP). Wyniki wykazały, że mutanty CENP-A K124R znakowane lub nieoznakowane są śmiertelne, ale można je uratować przez fuzję monoubikwityny, co sugeruje, że ubikwitylacja CENP-A jest niezbędna do żywotności komórek.
W ostatnich latach wiele badań opracowało różne testy do identyfikacji modyfikacji potranslacyjnych (PTM) białka CENP-A i innych białek centromer-kinetochoru zarówno in vivo, jak i in vitro9,10,11. Analogicznie do PTM białek histonowych, które są głównym mechanizmem regulującym funkcję chromatyny, PTM składników chromatyny centromerowej są również zaangażowane w niezbędny mechanizm regulacji ogólnej struktury i funkcji centromerów. Większość miejsc CENP-A PTM jest specyficzna dla nukleosomów zawierających CENP-A, chociaż kilka z nich jest konserwatywnych w histonie H3, co sugeruje, że modyfikacja tych reszt przyczynia się do funkcji specyficznej dla centromeru. PTM CENP-A, w tym fosforylacja, acetylacja, metylacja i ubikwitylacja, były wcześniej opisywane9, co sugeruje, że CENP-A jest poddawany różnym PTM i ich układom kombinatorycznym na swoim końcu aminowym i domenie fałdowania histonów C-końca. Znaczenie modyfikacji CENP-A w wielu funkcjach zostało ujawnione przez wiele grup, w tym naszą. Funkcje te obejmują depozycję CENP-A w centromerach, stabilność białka i rekrutację CCAN (konstytutywnej sieci związanej z centromerami)9. Jednak ograniczone badania i odkrycia dotyczące PTM CENP-A są tworzone, w których dokonuje się porównań z jednym z kanonicznych histonów, które bezpośrednio lub pośrednio regulują ich funkcję. Raporty techniczne koncentrujące się na metodologii identyfikacji tych PTM CENP-A są również ograniczone.
Ponieważ ubikwitylacja CENP-A jest wymagana do depozycji CENP-A w centromerze12, dziedziczona przez dimeryzację między podziałami komórek5, i niezbędna do żywotności komórki8, metoda identyfikacji ubikwitylacji CENP-A będzie w przyszłości niezbędna do zbadania funkcjonalnej aktywności, położenia i struktury centromeru. Dlatego tutaj opisujemy analizę spektrometrii mas w celu zidentyfikowania ubikwitylacji mutanta EYFP-CENP-A K124R, co sugeruje, że znakowanie EYFP indukuje ubikwitylację przy innej lizynie w zmutowanym białku CENP-A K124R8. Przedstawiono również protokoły innych testów kontrolnych i analiz (analiza immunofluorescencyjna, test przerostu kolonii i test ubikwitylacji in vivo) w celu omówienia prawidłowego wyniku analizy głównej spektrometrii mas.

<table><tbody><tr><td>Akcesoria/Narzędzia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml probówki białkowe o niskim poziomie wiązania</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td>Do analizy spektrometrii mas</td></tr><tr><td>10-centymetrowa szalka do hodowli komórkowych</td><td>BIOFIL/JET, Chiny</td><td>700224</td><td>10-dołkowa miska do hodowli tkankowych (Yohei lab, PN63)</td></tr><tr><td>6-dołkowy klaster do hodowli komórkowych</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>Hodowla 6-dołkowa płyta</td></tr><tr><td>CentriVap</td><td>LABCONCO-Stacjonarny</td><td></td> <td>koncentrator próżniowy do suchych peptydów próżniowych do analizy metodą spektrometrii mas</td></tr><tr><td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &mu; m</td><td>Eksigent Technologies</td><td>805-00120</td><td>Kolumna do chromatografii cieczowej (RPLC) do analizy spektrometrii mas</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x soczewka zanurzeniowa w oleju</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X Soczewka olejowa</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x Soczewka olejowa</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X Soczewka olejowa</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF Membrana transferowa</td><td>EMD Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Do</td></tr><tr><td>zmotoryzowanego mikroskopu fluorescencyjnego Western blot Leica DM IRE2 Mikroskop fluorescencyjny</td> z <td></td><td>napędem silnikowym</td><td></td></tr> <tr><td>Leica Kompaktowe źródło światła Leica EL6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Zewnętrzne źródło światła do wzbudzenia fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Szkło Micro Cover (22 mm x 22 mm)</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>Szkło nakrywkowe (22 mm x 22 mm)</td></tr><tr><td>Model V16-2 aparat do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym</td><td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td><td>31071010</td><td>Aparatura do elektroforezy żelowej I do aplikacji większego żelu SDS-PAGE</td></tr><tr><td>nanoLC.2D</td><td>Eksigent</td> <td>Technologies-system</td> <td>chromatografii cieczowej do analizy spektrometrii</td></tr><tr><td>mas NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0335BOX</td><td>Dostępne na rynku żele białkowe Bis-Tris 4%-12% do analizy</td></tr> <tr><td>spektrometrii masKonfokalny laserowy mikroskop skaningowy Olympus FLUOVIEW FV3000</td><td></td> <td>Olympus-Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ pliki do pobrania/#!dlOpen=%23detail847250519)</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-R2 Degital CCD</td><td>kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td> Miejsce</tr><tr><td>wiązania</td><td>pióra PAP</td><td>AD100.1</td><td>Do hydrofobowej bariery w barwieniu immunofluorescencyjnym</td></tr><tr><td>TKANKA NACZYNIE HODOWLANE 10 CM</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td>Naczynie do hodowli tkankowych 10 cm</td></tr><tr><td>Pionowa elektroforeza do biegania z żelem (duży rozmiar)</td><td>Junyi, Chiny</td><td>JY-SCZ6 +</td> <td>Aparat do elektroforezy żelowej II do nakładania większego żelu SDS-PAGE (Yohei lab, PE23)</td></tr><tr><td>Mikroprowadnice VWR, matowe</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Mikroszkiełka</td></tr> <tr><td><silne>Przeciwciała pierwotne</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CENP-A</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CENP-B</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne</td></tr><tr><td>anty-GAPDH</td><td>ABCAM</td><td>ab37168</td><td>Królicze przeciwciało poliklonalne</td></tr><tr><td>anty-GAPDH</td><td>Invitrogen</td><td>PA1987</td><td>Przeciwciało</td></tr> <tr><td>poliklonalne królikaprzeciwciało anty-GFP</td><td>ANTI # 76 (przeciwciało domowej roboty)</td><td></td> <td>Przeciwciało poliklonalne królika</td></tr><tr><td>anty-HA (3F10)</td> <td>Roche</td><td>11815016001</td><td>Przeciwciało monoklonalne przeciw</td></tr><tr><td>HJURP</td><td>Proteintech Group</td><td>15283&ndash; 1-AP</td><td>Królicze przeciwciało poliklonalne</td></tr><tr><td>anty-Ubikwityna</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-317A-1</td><td>Królicze przeciwciało poliklonalne</td></tr> <tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Test białkowy</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Komercyjny odczynnik do oznaczania białek I do pomiaru stężenia białka (zgodny z 0,1% SDS)</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics Sonicator Microtip Step, solidny, gwintowany 9,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33995-325</td><td>Klakson zakłócający do sonikacji</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics sonikator Mikrokońcówka stożkowa 6,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33996-185</td><td>Mikrokońcówka do sonikacji</td></tr><tr><td>Bufor A1</td><td>-</td><td></td><td>-20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% deoksycholan; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; kompletny odczynnik inhibitora proteazy wolny od EDTA</td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Roche</td><td>11-873-580-001</td><td>Kompletny odczynnik inhibitora proteazy bez EDTA do buforu A1</td></tr><tr><td>Coomassie błękit brylantowy R-250</td><td>BBI Nauki przyrodnicze</td><td>CAS 6104-59-2</td><td>Niebieski roztwór Coomassie do analizy spektrometrii mas</td></tr><tr><td>Roztwór fioletu krystalicznego (2,3% fioletu krystalicznego, 0,1% oksylanu amonu, 20% etanolu)</td><td>SigmaI-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td>Do barwienia kolonii</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Do barwienia jądrowego</td></tr><tr><td>DMEM: F12 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>DMEM: F12 Średnia</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, ciepło inaktywowany, pochodzenia amerykańskiego</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy (Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Odczynnik do transfekcji transfekcyjnej I do transfekcji chemicznej</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000, roztwór P3000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Odczynnik do transfekcji chemicznej</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>Fixation reagant</td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku (zatwierdzony zamiennik mleka w proszku z goździków)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (nr zamówienia 190915; Lot# 90629)</td><td>Odtłuszczone mleko odtłuszczone</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>Zredukowane podłoże surowicy</td></tr><tr><td>p-fenylenodiamina</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>Do montażu podłoża</td></tr><tr><td>Penicylina, Streptomycyna; Liquid</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Penicylina-streptomycyna</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna ROZTWÓR</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poli-L-lizyna, 0,1% w/v, w wodzie</td></tr><tr><td>Polietylenoimina [PEI]; 1,0 mg/ml</td><td>Polysciences</td><td>23966&ndash; 2</td><td>Odczynnik do transfekcji III do transfekcji chemicznej</td></tr><tr><td>Sefaroza białka A Koraliki CL-4B</td><td>GE Healthcare/Amersham</td><td>17-0963-03</td><td>Białko A sefaroza CL-4B kulki do testów ubikwitylacji in vivo przy użyciu pQCXIP-EYFP-CENP-A</td></tr><tr><td>Przywróć bufor do usuwania Western Blot</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21059</td><td>Western Blot Stripping Buffer I</td></tr><tr><td>Trypsyna klasy sekwencjonowania</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>Do analizy spektrometrii</td></tr><tr><td>mas SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>Ultraczuły ulepszony substrat chemiluminescencyjny (ECL)</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Sterylna woda klasy kulturowej</td></tr><tr><td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6,85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-merkaptoetanol)</td><td>-</td><td>-</td><td>Bufor do usuwania Western Blot II</td></tr><<tr><td>silne> przeciwciała drugorzędowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit</td><td>IgG Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td> przeciwciało <td>drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition FV31S-SW software</td><td>Olympus-Sofware</td><td></td> <td>C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne FV31S-DT</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>Oprogramowanie Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ pliki do pobrania/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>oprogramowanie cellSens Dimension Ver. 1. 18</td><td>Olympus-Sofware</td><td></td> <td>C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td></tr><tr><td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td><td>LI-COR Biosciences-Software</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>D Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>Obrazowanie chemiluminescencyjne do wykrywania immunoblot</td></tr><tr><td>System obrazowania w podczerwieni Odyssey CLx</td><td>LI-COR Biosciences-System</td><td></td> <td>obrazowania w podczerwieni do wykrywania immunoblot</td></tr><tr><td>OpenCFU saftware</td> <td>-</td><td></td> <td>Do liczenia kolonii (http://opencfu.sourceforge.net/)</td></tr><tr><td>Openlab wersja 5.5.2. Oprogramowanie do obrazowania naukowego</td><td>Improvision/PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>A</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ProteinPilot wersja 4.5</td><td>AB SCIEX-Software</td><td></td> <td>F do analizy spektrometrii mas</td></tr><tr><td>Ilość Jedno oprogramowanie do analizy 1-D</td><td>Bio-Rad-Software</td><td></td> <td>E</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600+ System</td><td>AB SCIEX-Przyrząd</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>do spektrometrii masVolocity wersja 6.3 Oprogramowanie do analizy obrazu 3D (akwizycja objętości)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B1</td></tr><tr><td>Volocity wersja 6.3 Oprogramowanie do analizy obrazu 3D (kwantyfikacja objętości)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B2</td></tr></tbody></table>

analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji cenp-a znakowanego eyfp (eyfp-cenp-a)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Badanie struktury i dynamiki kinetochorów i centromerów jest ważne dla zrozumienia niestabilności chromosomalnej (CIN) i progresji raka. Fundamentalnym pytaniem jest, w jaki sposób lokalizacja i funkcja chromosomów centromeru (tj. tożsamość centromerów) są określane i uczestniczą w dokładnej segregacji chromosomów. Proponuje się, że CENP-A jest nie-DNA wskaźnikiem (znacznikiem epigenetycznym) tożsamości centromerów, a ubikwitylacja CENP-A jest wymagana do odkładania CENP-A w centromerze, dziedziczona przez dimeryzację między podziałami komórkowymi i niezbędna do żywotności komórki.
Tutaj opisujemy analizę spektrometrii mas w celu zidentyfikowania ubikwitylacji mutanta EYFP-CENP-A K124R, sugerując, że ubikwitylacja przy innej lizynie jest indukowana przez znacznikowanie EYFP w białku mutanta CENP-A K124R. Udało się zidentyfikować ubikwitylację lizyny 306 (K306) w EYFP-CENP-A K124R, która odpowiada lizynie 56 (K56) w CENP-A za pomocą analizy spektrometrii mas. Omówiono zastrzeżenie dotyczące stosowania GFP/EYFP lub znakowania białka o dużej masie cząsteczkowej jako narzędzia do analizy funkcji białka. Omówiono również obecne limity techniczne dla wykrywania ubikwitylowanych prążków, identyfikacji ubikwitylacji specyficznej dla miejsca oraz wizualizacji ubikwitylacji w żywych komórkach lub określonej pojedynczej komórce podczas całego cyklu komórkowego.
Przedstawiona tutaj metoda analizy spektrometrii mas może być zastosowana do ludzkiego białka CENP-A z różnymi znacznikami i innych białek centromer-kinetochoru. Te metody łączące, składające się z kilku testów/analiz, mogą być zalecane dla badaczy, którzy są zainteresowani identyfikacją funkcjonalnych ról ubikwitylacji.

Mutant EYFP-CENP-A K124 wykazuje ubikwitynację, interakcję z HJURP oraz brak defektów w lokalizacji centromerycznej i brak letalności komórkowej. W niniejszej pracy odtworzono system opisany przez Fachinetti i wsp. (2017)6: w diploidalnych ludzkich komórkach (RPE-1) posiadających jeden uszkodzony i jeden „floxed” allel CENP-A (CENP-A-/F), EYFP-CENP-A był ekspresowany z wektora retrowirusowego pBabe-EYFP. W tym systemie ekspresja endogennego CENP-A z al...

Ubikwitylacja CENP-A jest ważnym wymogiem dla depozycji CENP-A w centromerze, dziedziczonym przez dimeryzację między podziałami komórkowymi i nieodzownym dla żywotności komórki. Tutaj opisujemy analizę spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji białka CENP-A (EYFP-CENP-A) znakowanego EYFP.

Analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji CENP-A znakowanego EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Metoda ta umożliwia identyfikację ubikwitylacji białka CENP-A znakowanego EYFP. Może być również stosowany do ludzkiego białka CENP-A za pomocą różnych testów i innych białek. Główną zaletą tego rozwiązania jest to, że można go wykorzystać do identyfikacji wszechobecnych miejsc EYFP CENP-A K124R o kluczowym znaczeniu biologicznym.Badanie może zostać rozszerzone w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych szerokiego zakresu funkcjonalnych białek. Zacznij od przygotowania kulek białka A związanych przeciwciałem anty-GFP. Przemyć 25 mikrolitrów kulek białka A na reakcję immunoprecypitacji buforem A1 co najmniej trzy razy w celu usunięcia etanolu.Następnie przygotuj 50% roztwór kulek z buforem A1. Dodaj dwa mikrolitry przeciwciała anty-GFP do kulek. Następnie dodaj bufor A1 do 20-krotności objętości koralików netto. Wykonuj obrót od końca do końca w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery do 18 godzin.Optymalny czas trwania rotacji należy określić empirycznie na podstawie skuteczności immunoprecypitacji. Po obróceniu odwirować kulki w ilości 100 razy g przez jedną minutę i usunąć niezwiązany supernatant. Dodaj bufor A1, aby uzyskać 50% roztwór kulek i użyj 25 mikrolitrów tego roztworu do każdej reakcji immunoprecypitacji.Aby przeprowadzić immunoprecypitację, należy poddać komórki lizie w buforze A1 za pomocą sonikacji i zamrozić/rozmrozić. Zmierz stężenia białek i znormalizuj ilości białka w różnych próbkach IP. Następnie usuń 5% próbki z każdej probówki, aby uruchomić ją na stronie SDS.Wymieszaj resztę lizatu z 25 mikrolitrami kulek białka A związanych z przeciwciałem anty-GFP i wykonuj rotację od końca do końca w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery do 18 godzin. Po lizie komórek w buforze A i przeprowadzeniu immunoprecypitacji zgodnie z wcześniejszym opisem, należy zachować 10% całkowitej ilości leków immunostrącających w celu potwierdzenia ubikwitylacji EYFP CENP-A i precyzyjnego określenia pozycji ubikwitylowanego EYFP CENP-A. Użyj pozostałych 90% do analizy spektrometrii mas.Uruchom próbkę spektrometrii mas w dostępnym na rynku 4-12% żelu białkowym Bis-Tris. Następnie wykonaj barwienie Coomassie na niebiesko i wytnij obszar żelu o mocy 50-70 kilodaltonów do analizy spektrometrii mas. Pokrój każdy plasterek żelu na małe kawałki i umieść je w 0,5 mililitrowej tubie wiążącej białko.Umyj kawałki żelu 100 mikrolitrami 50% acetonitrylu w 25 milimolowym wodorowęglanie amonu. Wiruj je przez 10-15 minut. Następnie odkręć je w dół i wyrzuć supernatant.Po ostatnim praniu wysusz kawałki żelu za pomocą stołowego koncentratora próżniowego przez 30 minut. Dodaj 10 mikrolitrów 10 nanogramów na mikrolitr trypsyny do sekwencjonowania i pozwól kawałkom żelu nawodnić się przez pięć minut. Następnie dodaj 25 milimolowych wodorowęglanów amonu, tylko tyle, aby przykryć kawałki żelu i strawić je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia przenieś strawiony supernatant do czystej 0,65 mililitra silikonowanej probówki i dodaj 50% roztwór acetonitrylu i 5% kwasu mrówkowego. Wirować próbkę przez 10 minut. Następnie odwiruj go w dół i przenieś supernatant do probówki ekstrakcyjnej.Ponownie zagęścić próbkę do dwóch mikrolitrów. Następnie dodaj osiem mikrolitrów 3% roztworu acetonitrylu i 2% kwasu mrówkowego. Wiruj przez 15 minut i wiruj z prędkością 16 000 razy g przez 30 minut.Przeprowadzić akwizycję danych MS za pomocą LC-MS/MS przy użyciu systemu chromatografii cieczowej sprzężonego z instrumentem do spektrometrii mas. Wstrzyknąć osiem mikrolitrów próbki do kolumny chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i oddzielić peptydy za pomocą 2-80% gradientu rozpuszczalnika B w ciągu 60 minut zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Zbieraj dane spektrometrii mas przy użyciu trybu akwizycji zależnej od danych.Otwórz komercyjne oprogramowanie, aby przeanalizować dane spektrometrii mas na pulpicie. Aby rozpocząć nowe wyszukiwanie, kliknij przycisk LC w górnym menu. Następnie kliknij przycisk dodawania, aby przesłać oryginalne pliki surowych danych MS.Wybierz identyfikator białka ludzkiego w metodzie paragon jako metodę przeszukiwania bazy danych i przeszukaj oryginalne pliki surowych danych MS w bazie danych UniProt homo sapiens. Wybierz trypsynę jako enzym wytrawiający i ustaw pozostałe parametry zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Wprowadź nazwę pliku wyników i kliknij przycisk Zapisz jako po prawej stronie menu.Następnie wybierz folder do przechowywania wyników wyszukiwania i kliknij przycisk Zapisz. Kliknij przycisk procesu, aby rozpocząć wyszukiwanie. Po zakończeniu wyszukiwania dane z wprowadzoną nazwą wyszukiwania zostaną automatycznie zapisane w wybranym folderze.Aby uzyskać widma MS/MS dowolnego określonego peptydu, otwórz wyniki wyszukiwania w oprogramowaniu F. Następnie kliknij białko na liście białek w górnym menu i kliknij peptyd w środkowym menu. MS/MS tego peptydu pojawi się na dole menu. Aby wyeksportować i zapisać widma MS/MS, skopiuj widma i wklej je do odpowiedniego formatu pliku.Konstrukty genów EYFP, CENP-A typu dzikiego lub mutanta K124R, który ratuje utratę endogennego CENP-A, ulegały stabilnej ekspresji, gdy przeprowadzono integrację retrowirusową. Ekspresji endogennego CENP-A nie wykryto siedem dni po indukcji rekombinazy Cre. Stwierdzono, że zarówno ekspresja białka EYFP CENP-A typu dzikiego, jak i K124R są na podobnym poziomie do początkowego endogennego białka CENP-A.Zarówno mutanty EYFP CENP-A typu dzikiego, jak i K124R wykazały lokalizację centromerów po siedmiu dniach od przerwania pozostałej ekspresji endogennego CENP-A. Dziki typ EYFP CENP-A i mutant K124R wykazywały ubikwitylację i interakcję z HJURP, w przeciwieństwie do oflagowanego, oznakowanego lub nieoznakowanego dzikiego typu CENP-A i mutanta K124R. Żywotność komórek oceniano, wykonując test wzrostu kolonii 14 dni po przerwaniu pozostałego endogennego allelu CENP-A.Zarówno mutanty EYFP CENP-A typu dzikiego, jak i K124R wykazały podobną liczbę uratowanych kolonii 14 dni po przerwaniu pozostałego endogennego allelu CENP-A. Spektrometria mas IP wykazała ubikwitylację lizyny 306 w EYFP CENP-A K124R w komórkach CENP-A minus F. Podsumowując, wyniki te sugerowały, że fuzja białka o dużych rozmiarach indukuje ubikwitylację lizyny innej niż K124R w CENP-A, która hamuje oryginalny fenotyp pojedynczego mutanta K124R.Próbując skorzystać z tego protokołu, należy użyć dostępnych na rynku żeli białkowych 4%12%Bis-Tris do uruchomienia próbek spektrometrii mas. Dodaj odpowiednią ilość trypsyny do kawałków żelu i nawadniaj je, aż wszystkie enzymy zostaną wchłonięte. Technika znakowania lub sondowania o niższej masie cząsteczkowej jest w rzeczywistości wymagana do wizualizacji ubikwitylacji i badania przestrzennej sygnalizacji ubikwitylacji białek czasowych na poziomie całego organizmu.

mass-spectrometry-analysis-to-identify-ubiquitylation-eyfp-tagged

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano nową metodę badania kinetyki enzymatycznej, wykorzystującą ilościową analizę sygnałów FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Wyznaczono wartości KM oraz kcat dla hydrolizy domeny katalitycznej SENP1 (proteazy 1 specyficznej dla SUMO/Sentryny) w odniesieniu do pre-SUMO1 (małego modyfikatora podobnego do ubikwityny). Ogólne zasady tego ilościowego badania kinetyki proteaz w oparciu o technikę FRET mogą zostać zastosowane do innych proteaz.

Ilościowa analiza FRET (Förster Resonance Energy Transfer) w celu oznaczenia kinetyki proteazy SENP1

Ten manuskrypt opisuje wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80, u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80

Tutaj opisujemy protokoły wykrywania endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich i ilościowego określania tych poziomów białek w centromerach-kinetochorach poprzez pośrednie barwienie immunofluorescencyjne za pomocą utrwalania (utrwalanie paraformaldehydu, acetonu lub metanolu).

Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromerowo-kinetochorowych

Badanie wielu, endogennych modyfikacji potranslacyjnych dla docelowego białka może być niezwykle trudne. Opisane tutaj techniki wykorzystują zoptymalizowany bufor do lizy i system filtrów opracowany ze specyficznymi matrycami powinowactwa do kierowania PTM, do wykrywania modyfikacji acetylacji, ubikwitynacji, SUMOylacji 2/3 i fosforylacji tyrozyny dla białka docelowego przy użyciu jednego, usprawnionego systemu.

Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Ta metoda opisuje ocenę globalnych zmian w topologii łańcucha ubikwityny. Ocena jest przeprowadzana poprzez zastosowanie ukierunkowanego podejścia proteomicznego opartego na spektrometrii mas.

Analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj analizę spektrometrii mas do identyfikacji ubikwitylacji EYFP-CENP-A w komórkach ludzkich. Ta metoda umożliwia wykrycie miejsc modyfikacji białek centromerowych kluczowych dla funkcjonowania komórki.

Analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji CENP-A znakowanego EYFP (EYFP-CENP-A)

Przeglądaj więcej filmów