Synteza nanocząstek złota modyfikowanych aptamerem-PEI-g-PEG obciążonych doksorubicyną w celu celowanego dostarczania leków

Ze względu na lekooporność i toksyczność, stosowanie doksorubicyny jest ograniczone w klinice. Protokół ten zapewnia degradowalny nośnik do utrzymania uwalniania tego środka terapeutycznego. Zaletą tej metody jest to, że zsyntetyzowany nośnik może być wykorzystany do dostarczenia leku bezpośrednio do komórek nowotworowych, indukując śmierć komórki tylko w komórkach nowotworowych.

Do syntezy CT-PEG najpierw dodaj 1,46 grama bezwodnika bursztynowego i 209 miligramów 4-dimetyloaminopirydyny do 100-mililitrowej kolby okrągłodennej. Następnie dodać 15 mililitrów bezwodnego tetrahydrofuranu do kolby i włożyć szklany korek do kolby, przed inkubacją reakcji przez 30 minut w temperaturze zero stopni Celsjusza. Podczas inkubacji dodać 4,208 grama PEG, 1,8 mililitra trietyloaminy i 15 mililitrów bezwodnego tetrahydrofuranu do nowej kolby i zamknąć kolbę szklanym korkiem.

Pod koniec inkubacji użyć strzykawki w atmosferze azotu, aby powoli przenieść drugi roztwór do pierwszej kolby. Mieszaj nowy roztwór przez dwie godziny w temperaturze zero stopni Celsjusza, a następnie kontynuuj reakcję w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego ranka użyj wyparki obrotowej o temperaturze 40 stopni Celsjusza i 0,1 megapaskali do zagęszczenia roztworu reakcyjnego i usunięcia rozpuszczalnika tetrahydrofuranu.

Po godzinie rozpuścić roztwór reakcyjny w 15 mililitrach 1,325 grama na mililitr dichlorometanu w temperaturze pokojowej, a następnie dodać 15 mililitrów zimnego eteru dietylowego w celu uzyskania produktu wytrącania dwukwasu PEG. Następnie usunąć rozpuszczalnik przez bibułę filtracyjną i wysuszyć osad w próżni przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Do syntezy kopolimeru PEI-g-PEG dodać 305,47 miligramów osadu CT-PEG i pięć mililitrów DMSO do nowej kolby i mieszać reakcję w temperaturze pokojowej, aż do całkowitego rozpuszczenia CT-PEG.

Następnie rozpuść 49,46 miligrama EDC w pięciu mililitrach DMSO i dodaj roztwór do kolby. Mieszać reakcję przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przed rozpuszczeniem 29,69 miligramów N-hydroksysukcynimidu i pięcioma mililitrami DMSO i dodaniem otrzymanego roztworu do kolby. Kontynuuj mieszanie reakcji przez trzy godziny w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji rozpuścić 28,6 mikrolitrów PEI w 10 mililitrach DMSO i dodać roztwór kroplami do kolby. Mieszaj reakcję w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy dni. Pod koniec inkubacji przenieść przereagowany roztwór do worka dializacyjnego z odcięciem 1000 mas cząsteczkowych i umieścić worek w jednolitrowej zlewce zawierającej 500 mililitrów ultraczystej wody jako dializatu.

Pod koniec dializy przenieś roztwór do worka dializacyjnego z odcięciem 10 000 mas cząsteczkowych i umieść worek w jednolitrowej zlewce z 500 mililitrami ultraczystej wody jako dializatu. Pod koniec drugiej dializy należy użyć wyparki obrotowej o temperaturze 40 stopni Celsjusza i 0,1 megapaskali w celu zagęszczenia roztworu i wysuszenia próbki w celu uzyskania proszku PEI-g-PEG. W celu pokrycia nanocząstek złota produktem PEI-g-PEG należy rozpuścić pięć miligramów przygotowanego PEI-g-PEG w pięciu mililitrach ultra czystej wody w nowej kolbie i wyposażyć kolbę w szklany korek.

Dodać 100 mililitrów 0,3 milimolowego roztworu chlorku aury do kolby i mieszać roztwór przez trzy godziny w temperaturze pokojowej. Kolory powinny natychmiast zmienić się z jasnożółtego na ciemnożółty. Pod koniec inkubacji dodać do kolby jeden mililitr lub jeden miligram na mililitr roztworu borowodorku sodu.

Kolor powinien natychmiast zmienić się z ciemnożółtego na złotożółty i mieszać roztwór przez dodatkowe trzy godziny w temperaturze pokojowej. Następnie dializuj produkt reakcji za pomocą worka dializacyjnego o masie cząsteczkowej 1000 mas cząsteczkowych przez trzy dni, jak wykazano, aby uzyskać roztwór nanocząstek złota pokryty PEI-g-PEG. Do szczepienia doksorubicyny do nanocząstek złota pokrytych PEI-g-PEG.

Dodać jeden mililitr 2,2 miligrama na mililitr roztworu doksorubicyny i 20 mililitrów roztworu nanocząstek złota pokrytego PEI-g-PEG do nowej kolby i założyć kolbę ze szklanym korkiem. Następnie rozpuść 0,727 miligrama EDC w jednym mililitrze ultra czystej wody i dodaj roztwór EDC do kolby. Rozpuścić 0,437 miligrama N-hydroksysukcynimidu w jednym mililitrze ultra czystej wody i dodać roztwór N-hydroksysukcynimidu do kolby na jedną godzinę inkubacji z mieszaniem w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji należy dializować produkt reakcji w worku dializacyjnym o masie cząsteczkowej 1000 mas cząsteczkowych przez trzy dni, jak wykazano, w celu uzyskania roztworu nanocząstek złota pokrytego doksorubicyną g-PEI-g-PEG. Do szczepienia aptameru AS1411 na DOX-g-PEI-g-PEG. Dodać 20 mililitrów roztworu nanocząstek złota pokrytego doksorubicyną DOX-g-PEI-g-PEG do stężenia AS1411 o gęstości optycznej około czterech.

Rozpuść 28,76 miligrama EDC w jednym mililitrze ultra czystej wody i dodaj roztwór EDC do kolby. Rozpuścić 17,27 miligrama N-hydroksysukcynimidu w jednym mililitrze ultra czystej wody i dodać roztwór N-hydroksysukcynimidu do kolby na jednogodzinną inkubację z mieszaniem w temperaturze pokojowej. Następnie dializuj produkt reakcji w worku dializacyjnym o masie cząsteczkowej 1000 mas cząsteczkowych przez trzy dni, jak wykazano, aby uzyskać nanocząstki złota pokryte AS1411-g-doksorubicyną-g-PEI-g-PEG.

Spektroskopia protonowa NMR może być wykorzystana do potwierdzenia udanej syntezy polimeru CT-PEG i kopolimerów PIE-g-PEG. Spektroskopię ultrafioletową można przeprowadzić w celu określenia pomyślnej funkcjonalizacji i stopniowego ładowania przygotowanego kopolimeru na nanocząstki złota. Rentgenowska spektroskopia fotoelektronów może być wykorzystana do badania wiązania chemicznego kopolimeru na nanocząstkach złota.

Dynamiczne rozpraszanie światła można przeprowadzić w celu określenia rozkładu wielkości przygotowanych nanocząstek. W tej analizie transmisyjna mikroskopia elektronowa ujawniła nieskupione nanocząstki o jednolitej morfologii. Analiza żywotności komórek wykazała spadek liczby komórek A549 w czasie i w odpowiedzi na rosnące stężenia nanocząstek.

W porównaniu z grupą wolnej doksorubicyny, liczba komórek wzrosła, co wskazuje na zmniejszoną toksyczność. Co więcej, analiza profilu uwalniania doksorubicyny ujawnia, że przedłużone uwalnianie doksorubicyny z funkcjonalizowanych nanocząstek spowodowało spadek liczby komórek A549. Przygotowanie kopolimeru PEI-g-PEG i etapy szczepienia AS1411 są ważne dla powodzenia realizacji procedury.

Ten sam nośnik leku można osiągnąć, szczepiąc AS1411 przed przeszczepieniem leków, ale wydajność ładowania leku zostanie zmniejszona.