Skalowalne generowanie dojrzałych organoidów móżdżku z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i charakterystyka za pomocą barwienia immunologicznego

Ten protokół opisuje dynamiczny system hodowli do produkcji kontrolowanych agregatów ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i dalszego stymulowania różnicowania w organoidach móżdżku w chemicznie zdefiniowanych warunkach i bez karmienia za pomocą jednorazowego bioreaktora.

Po raz pierwszy prezentujemy nowe podejście do powtarzalnego i skalowalnego generowania komórek IPS pochodzących z organoidów móżdżku oraz warunków zdefiniowanych chemicznie, przy użyciu bioreaktorów jednorazowego użytku. Aby uzyskać komórki do wysiewu w bioreaktorze, dodaj jeden mililitr pożywki do oddzielania komórek do każdej studzienki sześciodołkowej płytki ludzkich iPSC. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem minut, aż delikatne potrząsanie z łatwością oderwie komórki od dołka.

Za pomocą mikropipety P 1000 odpipetuj pożywkę oddzielającą komórki, w górę i w dół, aż komórki rozdzielą się na pojedyncze komórki. Następnie dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki, co dezaktywuje trawienie enzymatyczne. Następnie za pomocą pipety delikatnie przenieś komórki do sterylnej stożkowej probówki.

Odwiruj probówkę pod ciśnieniem 210-krotności grawitacji przez trzy minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce hodowlanej. Policz komórki za pomocą hemocytometru i niebieskiego barwnika trypanowego.

Zobacz zbiornik bioreaktora z iPSC, o gęstości 250 000 komórek na mililitr. Włóż naczynie bioreaktora do uniwersalnej jednostki bazowej do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wilgotności 95% i 5% dwutlenku węgla. Aby promować agregację iPSC, ustaw szybkość mieszania podstawowej jednostki sterującej na 27 obr./min.

Pierwszego dnia, przy czym dzień zero jest dniem wysiewu bioreaktora, umieść bioreaktor i jednostkę bazową w sterylnym okapie przepływowym, a następnie użyj pipety serologicznej, aby pobrać jednomililitrową próbkę zawiesiny komórek. Umieść zawiesinę komórek w bardzo niskiej nasadce, 24-dołkowej płytce. Użyj mikroskopu, aby potwierdzić, że uformowały się agregaty pochodzące z iPSC.

Jeśli tak, zrób obrazy agregatów przy 40 X lub 100 X. Kontynuuj hodowlę iPSC i bioreaktora, aż średnia średnica agregatów wyniesie 100 mikrometrów, a następnie zastąp 80% pożywki świeżym MT01 bez inhibitora skał. Gdy agregaty osiągną średnicę od 200 do 250 mikrometrów, pozwól wszystkim organoidom osiąść na dnie bioreaktora, a następnie zastąp całe zużyte podłoże pożywką różnicującą gfCDM. Umieść jednostkę bazową i bioreaktor w inkubatorze i zmniejsz mieszanie do 25 obr./min.

Po usunięciu supernatantu z przechowywanych organoidów, dodaj jeden mililitr 15% sacharozy do granulki i dobrze wymieszaj, delikatnie mieszając. Po inkubacji organoidów przez noc, w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usuń roztwór sacharozy, a następnie dodaj jeden mililitr 15% sacharozy, 7,5% żelatyny i szybko wymieszaj, delikatnie mieszając. Podczas inkubacji organoidów w temperaturze 37 stopni Celsjusza napełnij plastikowy pojemnik do połowy 15% sacharozą 7,5% roztworem żelatyny i pozwól mu zastygnąć.

Po godzinnej inkubacji organoidów należy użyć pipety Pasteura, aby umieścić kroplę mieszaniny organoidów i sacharozy z żelatyną na wierzchu zestalonej sacharozy i żelatyny. Po odczekaniu 15 minut, aż kropla stwardnieje, napełnij pozostałą część plastikowego pojemnika większą ilością 15% sacharozy, 7,5% żelatyny, pozwól jej całkowicie zestalić się w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pokrój żelatynę w kostkę, z organoidami pośrodku, przymocuj kostkę do kawałka tektury z kroplą związku OCT, a następnie umieść 250 mililitrów izopentanu w kubku o pojemności 500 mililitrów, napełnij odpowiedni pojemnik ciekłym azotem.

Za pomocą kleszczy i grubych rękawic ostrożnie umieść kubek z izopentanem na powierzchni ciekłego azotu. Izopentan i ciekłe azoty są odczynnikami niebezpiecznymi. Stosowanie tych dwóch odczynników wymaga środków ochrony osobistej, w tym grubych rękawic i odpowiedniej wentylacji.

Gdy izopentan ostygnie do minus 80 stopni Celsjusza, umieść kostkę żelatyny w izopentanie, aż zamarznie. Dobrze zamrożona kostka po lekkim stuknięciu kleszczami wydaje metaliczny dźwięk, co oznacza, że jest gotowa do przechowywania. Umyj szkiełka mikroskopowe zawierające skrawki organoidów 50 mililitrami 1X PBS przez pięć minut, a następnie przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego świeży 1X PBS.

Przenieś szkiełka do słoika Coplin, zawierającego 50 mililitrów świeżo przygotowanej glicyny i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś szkiełka do słoika Coplin, zawierającego 50 mililitrów 0,1% Tritonu i przepuszczalnego przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą 1X PBS, za każdym razem przez pięć minut. Przygotuj naczynie do barwienia immunologicznego z trzymilimetrowego papieru nasączonego 1X PBS.

Osusz szkiełka chusteczką wokół plastrów i umieść je na trzymilimetrowym papierze. Za pomocą pipety Pasteura przykryj każde szkiełko 0,5 mililitra roztworu blokującego. Po inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej usuń nadmiar roztworu blokującego i nabij szkiełka chusteczką wokół plastrów.

Umieścić 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego na każdym szkiełku podstawowym i przykryć je szkiełkami nakrywkowymi. Zasznuruj szkiełka w przygotowanym wcześniej naczyniu do barwienia immunologicznego i inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji przenieś szkiełka do słoika Coplin z 50 mililitrami TBST, pozwalając szkiełkom nakrywkowym odpaść, a następnie umyj szkiełka trzykrotnie TBST, za każdym razem przez pięć minut.

Umieścić 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała wtórnego na każdym szkiełku podstawowym i przykryć szkiełkami nakrywkowymi. Umieścić szkiełka w przygotowanym wcześniej naczyniu do barwienia immunologicznego, inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Przenieś szkiełka ponownie do słoika Coplin i umyj je trzy razy 50 mililitrami TBST, za każdym razem przez pięć minut.

Za pomocą pipety Pasteura, w 0,5 mililitra roztworu do smażenia, na całej powierzchni każdego szkiełka i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po 24 godzinach w bioreaktorze iPSC efektywnie uformowały sferoidalne agregaty. Morfologia była dobrze utrzymana do piątego dnia, ze stopniowym wzrostem rozmiaru.

Wykazuje wysoki stopień jednorodności. Analiza ilościowa za pomocą mikroskopii ujawniła również normalny rozkład rozmiarów agregatów w pierwszym dniu, a obie linie komórkowe osiągnęły optymalną wielkość agregatu w drugim dniu. Po osiągnięciu pożądanej średnicy agregatu indukowane było zaangażowanie neuronalne, a następnie promowane było generowanie różnych komórek progenitorowych móżdżku.

Podczas różnicowania organoidy wykazywały wyraźniejszą epitelializację podobną do struktur przypominających cewy nerwowe z przestrzenią świetlną. Dodatkowo, rozkład średnicy organoidu był jednorodny podczas początkowego zaangażowania móżdżku do 14 dnia. Analiza immunofluorescencyjna potwierdza, że efektywne zaangażowanie neuronalne organoidów pochodzących z iPSC jest już osiągane w siódmym dniu różnicowania.

Wykazano również, że barwienie immunologiczne skutecznie angażuje móżdżek i skutecznie dojrzewa organoidy móżdżku. Co więcej, po 80 dniach w bioreaktorze barwienie organoidów żywymi trupami wykazało wysoką żywotność komórek i brak dowodów na obszary martwicze. Technika ta stanowi ważne narzędzie do badania szlaków patologicznych zaangażowanych w degenerację móżdżku obserwowaną w i do oceny efektu terapeutycznego nowych leków.