Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Protokół ten działa w przypadku próbek z ludzkich i zwierzęcych serc, nawet po wielu godzinach transportu. Z wyciętych wibratomem plastrów tkanki można wyizolować do 200 miocytów na miligram. Analiza elektrofizjologiczna, strukturalna i biochemiczna kardiomiocytów pomaga odkryć i lepiej zrozumieć mechanizmy chorób serca.

Po napełnieniu 100-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej 20 mililitrami roztworu do cięcia na zimno, umieść próbkę tkanki w naczyniu hodowlanym. Trzymaj naczynie hodowlane na talerzu schłodzonym do 4 stopni Celsjusza. Należy pamiętać, że żywe próbki tkanek od zwierząt, a zwłaszcza od ludzi, są potencjalnie zakaźne.

Użyj nożyczek lub skalpela, aby usunąć nadmiar tkanki zwłóknieniowej i tłuszczu nasierdziowego z próbki. Aby uzyskać optymalne przetwarzanie wibratomu większych próbek tkanek, użyj skalpela, aby wyciąć osiem milimetrów sześcianów z tkanki. W przypadku mniejszych próbek z biopsji nie jest to konieczne.

Nasierdzie można zidentyfikować po warstwie tłuszczu nasierdzia. Po usunięciu nadmiaru tłuszczu umieść blok tkanki w naczyniu, nasierdziem skierowanym w dół. Aby przygotować się do zatopienia w tkance, zagotuj 400 miligramów agarozy o niskiej temperaturze topnienia w dziesięciu mililitrach roztworu tnącego.

Napełnij dziesięciomililitrową strzykawkę gorącym, rozpuszczonym żelem agarozowym. Zamknąć strzykawkę i umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej 15 minut, aby umożliwić zrównoważenie agarozy. Za pomocą kleszczy przenieś wycinek do czystego naczynia do hodowli tkankowej o grubości 35 milimetrów, z nasierdziem skierowanym w dół.

Następnie usuń nadmiar płynu z próbki za pomocą sterylnego wacika. Zabezpiecz próbkę przed przemieszczaniem się, przytrzymując ją kleszczami. I opróżnij strzykawkę z agarozą na wierzchu, upewniając się, że próbka jest całkowicie zanurzona.

Natychmiast umieść naczynie na lodzie i pozwól agarozie zastygnąć przez 10 minut. Zamontuj nieużywaną żyletkę do uchwytu ostrza wibratomu. Jeśli to możliwe, skalibruj wibratom, regulując odchylenie ostrza w kształcie litery Z.

Użyj skalpela, aby wyciąć blok tkanki agarozowej, który pasuje do uchwytu próbki wibratomu. Aby zapewnić stabilność, upewnij się, że tkanka jest nadal wystarczająco zanurzona w agarozie. Z brzegami agarozy, co najmniej ośmiomilimetrowymi.

Nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na uchwyt próbki. I delikatnie dociśnij blok tkanki agarozowej do uchwytu. Zbuduj wannę wibratomową z roztworem tnącym.

Następnie napełnij zewnętrzny zbiornik chłodzący wibratomu kruszonym lodem, aby utrzymać temperaturę od czterech do sześciu stopni Celsjusza przez cały proces cięcia. Umieścić uchwyt na próbkę, zawierający blok tkanki agarozowej, w kąpieli wibratomowej. Korzystając z ustawień wibratomu opisanych w manuskrypcie, wygeneruj plastry o grubości 300 mikrolitrów.

Bardzo ważne jest tworzenie odcinków w równoległym nasierdziu, ponieważ w ten sposób włókna kardiomiocytów są ustawione w ścianie komory. W przeciwnym razie będzie zbyt dużo uszkodzeń. Użyj standardowego mikroskopu świetlnego, aby sprawdzić wyrównanie kardiomiocytów i wycinków tkanki.

Aby uniknąć uszkodzenia tkanki, trzymaj agarozę zamiast samej tkanki. Włókna kardiomiocytów powinny być równomiernie wyrównane, a miocyty nie powinny być skurczone. Umieść płytę grzewczą na wytrząsarce laboratoryjnej i podgrzej ją do 37 stopni Celsjusza.

Uruchom wytrząsarkę laboratoryjną z prędkością 65 obr./min. Rozpuść proteinazę w dwóch mililitrach roztworu. I rozpuść kolagenazę w dwóch mililitrach roztworu.

Ale nie mieszaj proteinazy i kolagenazy. Dodać chlorek wapnia do roztworu kolagenazy, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu mikromolowych. Inkubować oba roztwory w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Użyj kleszczy, aby przenieść plasterek tkanki do czystego naczynia do hodowli tkankowej o grubości 60 milimetrów. Z pięciomilimetrową wstępnie schłodzoną roztworem do cięcia. Trzymając naczynie na lodzie lub zimnym talerzu, ostrożnie usuń agarozę z tkanki za pomocą ostrza lub kleszczy.

Aby przeprowadzić wstępne mycie plastrów tkanki, umieść czyste naczynie do hodowli tkankowych o grubości 35 milimetrów na ostrzu grzewczym. I napełnij go dwoma milimetrami wstępnie podgrzanego roztworu. Przełóż jeden lub dwa plasterki tkanki do przygotowanego naczynia.

Następnie użyj pipety o długości jednego milimetra do etapów mycia. Po umyciu plastrów wyjmij roztwór pierwszy z naczynia i dodaj dwa mililitry roztworu proteinazy. Inkubuj plastry przez 12 minut na ostrzu grzewczym, z wytrząsarką na 65 obr./min.

Umyj plastry chusteczki jeszcze dwa razy, dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego roztworu. Następnie wyjmij roztwór pierwszy z naczynia i dodaj dwa mililitry roztworu kolagenazy. Inkubuj plastry przez co najmniej 30 minut na ostrzu grzewczym, potrząsając z prędkością 65 obr./min.

Po 15 minutach inkubacji sprawdź, czy poszczególne miocyty są wolne, badając naczynie pod mikroskopem świetlnym. Kontynuuj sprawdzanie co pięć minut, aż poszczególne miocyty będą widoczne. Następnie przeprowadź trawienie alternatywne, myjąc plastry dwukrotnie, dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego roztworu.

I napełnij naczynie dwoma mililitrami roztworu dwa. Ostrożnie rozsuń włókna tkanki za pomocą cienkich kleszczy. Kontynuuj ostrożną pracę, aby uniknąć uszkodzenia kardiomiocytów.

I pipetować kilka razy, przy czym jednorazowe użycie obok pipety. Następnie potwierdź, że kardiomiocyty w kształcie pręcików oddzieliły się, badając naczynie pod mikroskopem świetlnym. Umieść naczynie z powrotem na płycie grzewczej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zamieszaj, potrząsając.

Dodając 10 milimolowe i 100-milimolowe roztwory podstawowe chlorku wapnia, powoli zwiększaj stężenie wapnia w zawiesinie tkankowej z pięciu mikromolowych do 1,5 milimolowych. Kiedy przyrost wapnia zostanie zakończony, użyj kleszczy, aby usunąć wszelkie pozostałe niestrawione kawałki tkanki. Najpierw przestań mieszać zawiesinę.

Następnie, za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, powoli usuń 1/3 roztworu z górnej części zawiesiny. Unikać aspiracji kardiomiocytów. Następnie dodaj 700 mikrolitrów roztworu trzeciego do komórek.

Po 10 minutach mieszania powtórz te kroki prania. Przenieść zawiesinę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. I pozwól kardiomiocytom ustabilizować się w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut i maksymalnie 30 minut.

Całkowicie usunąć supernatant. I ponownie zawiesić osad w zmodyfikowanym roztworze tyrodowym lub pożądanym buforze eksperymentalnym. Za pomocą mikroskopu świetlnego sprawdź jakość komórek.

30 do 50% kardiomiocytów powinno mieć kształt pręcików, gładkich bez pęcherzyków błonowych. I wyświetlaj, wyraźne prążki krzyżowe. Aby zweryfikować skuteczność izolacji, protokół zastosowano do mięśnia sercowego szczura.

I w porównaniu z izolacją przez perfuzję wieńcową i izolację z małych fragmentów tkanki. Mniejszy odsetek komórek pręcikowych zaobserwowano podczas stosowania protokołu, a następnie po izolacji przez perfuzję. Ale ogólna liczba była nadal wysoka.

W przeciwieństwie do tego, izolacja od fragmentów tkanek dała mniej komórek w kształcie pręcików. Cytometria przepływowa została wykorzystana do ilościowego porównania wyników. Izolacja kardiomiocytów z wycinków tkanek nie osiąga wydajności uzyskanej przez perfuzję wieńcową.

Ale zapewnia znacznie wyższe plony niż izolacja miocytów z fragmentów tkanki. Następnie protokół zastosowano do mięśnia sercowego u człowieka. Izolacja z wycinków mięśnia sercowego pozwoliła uzyskać liczbę Hyde'a i dużą część ludzkich miocytów w kształcie pręcików.

I tylko niewielka część, zaokrąglonych kardiomiocytów. Izolacja z wycinków mięśnia sercowego spowodowała uderzająco większą liczbę miocytów w kształcie pręcików niż izolacja z fragmentów tkanki. Kwantyfikacja fotometryczna potwierdziła znacznie wyższą żywotność miocytów po wyizolowaniu z wycinków mięśnia sercowego.

Komórki ludzkie, wyizolowane za pomocą opisanego protokołu, mogą być poddane analizie strukturalnej. Barwienie alfa aktyniną ujawniło gęsty, regularny wzór linii Z i średnią długość sarkomeru 1,92 mikrometra w spoczynkowych kardiomiocytach. Barwienie LTCC i RyR wykazało, że wyraźny klaster jest kolokalizowany w pobliżu błony komórkowej i kanalików T.

Wyizolowane kardiomiocyty były pobudliwe i mogły być wykorzystane do badań nad elektrofizjologią komórkową lub sprzężeniem skurczu pobudzenia. Kształt i czas trwania potencjału czynnościowego mieścił się w zakresie zgłaszanym przez innych, dla kardiomiocytów komorowych, od niewydolnych ludzkich serc. Przejściowe stany wapnia zarejestrowane przez skanowanie linii głosowych Khana wykazały wyraźny wzrost po stymulacji.

I akceptowalny stosunek sygnału do szumu. Skrócenie kardiomiocytów przez skurcz można zaobserwować po odchyleniu dolnej granicy komórek. Ze względu na dużą liczbę izolatorów kardiomiocytów uzyskanych za pomocą tego protokołu, hodowla komórkowa jest możliwa.

Może to pozwolić na transfer genów, badania farmakologiczne i inżynierię tkankową ludzkich kardiomiocytów. Ważnym zastosowaniem jest weryfikacja wyników z modeli zwierzęcych w komórkach ludzkich. Niewydolność serca jest zespołem klinicznym o bardzo ograniczonych możliwościach terapeutycznych.

Ulepszone techniki izolacji kardiomiocytów pomogą zidentyfikować cele komórkowe do diagnozy i przyszłych terapii.