Name: Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj metodę izolacji ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem. Protokół zapewnia wysokie wydajności do 200 komórek na miligram tkanki, umożliwiając badania elektrofizjologiczne i biochemiczne mechanizmów chorób serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Andreasowi Dendorferowi z Centrum Medycyny Eksperymentalnej im. Waltera Brendela, LMU w Monachium, za pomoc w opracowaniu protokołu krojenia. Za dostarczenie próbek tkanek mięśnia sercowego chcielibyśmy podziękować Ghazali Minabari i Christianowi Heimowi z Oddziału Kardiochirurgii Szpitala Uniwersyteckiego w Erlangen, Hendrikowi Miltingowi z Instytutu Ericha i Hanny Klessmannów Uniwersytetu Ruhry w Bochum oraz Muhannadowi Alkassarowi z Oddziału Kardiologii Dziecięcej Szpitala Uniwersyteckiego w Erlangen. Za wsparcie w zakresie cytometrii przepływowej chcielibyśmy podziękować Simonowi Völklowi i kolegom z Centrum Badań Translacyjnych (TRC) Szpitala Uniwersyteckiego w Erlangen. Chcielibyśmy również podziękować Lorenzowi McCargo i Celine Grüninger z Instytutu Fizjologii Komórkowej i Molekularnej w Erlangen za doskonałe wsparcie techniczne.
Ta praca była wspierana przez DZHK (Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych), przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) w Szpitalu Uniwersyteckim Uniwersytetu w Erlangen-Norymberdze oraz Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

Wszystkie eksperymenty na szczurach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Mittelfranken, Bawaria, Niemcy. Pobieranie i wykorzystywanie próbek tkanek ludzkiego serca zostało zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje Rewizyjne Uniwersytetu w Erlangen-Norymberdze i Uniwersytetu Ruhry w Bochum. Badania przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej. Pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę przed pobraniem tkanek.
Samice szczurów rasy Wistar (150–200 g) zostały pozyskane komercyjnie, znieczulone przez wstrzyknięcie 100 mg/kg tiopentalu sodowego dootrzewnowo i poddane eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie torakotomię i wycięcie serca. Próbki tkanki ludzkiego serca pobierano z rdzenia wierzchołkowego lewej komory podczas implantacji mechanicznych urządzeń wspomagających, z miektomii przegrody, z tetralogii chirurgii korekcyjnej Fallota lub z wolnej ściany lewej komory eksplantowanych serc. Poniższy protokół opisuje izolację z ludzkiej tkanki komorowej. Izolację kardiomiocytów szczurów przeprowadzono odpowiednio, ale przy użyciu różnych enzymów (patrz tabela materiałów). Schematyczny przebieg działania protokołu jest zilustrowany w Rysunek 1.
1. Przygotowanie, roztworów i enzymów
<ol>
	<li>Przygotować i roztwory zgodnie z tabelą 1.</li>
	<li>Rozgrzać roztwory 1, 2, 3 i zmodyfikowany roztwór Tyrode'a do temperatury 37 °C. Roztwór do cięcia przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: W przypadku 1-2 wycinków mięśnia sercowego do izolacji w jednym naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm wymagane jest łącznie około 15 ml, 8 ml i 5 ml roztworów 1, 2 i 3. Odpowiednio zwiększ skalę, aby uzyskać jednoczesne izolacje miocytów w wielu naczyniach. Roztwór do cięcia można zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Odważyć 1 mg proteinazy XXIV (patrz tabela materiałów) do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i przechowywać na lodzie do czasu użycia. Służy to do przetworzenia jednej próbki. Odpowiednio zwiększ kwotę. Nie mieszaj proteinazy i kolagenazy.</li>
	<li>Odważyć 8 mg kolagenazy CLSI (patrz Tabela Materiałów) do wstępnie schłodzonej 15 ml probówki wirówkowej i przechowywać na lodzie do czasu użycia. Służy to do przetworzenia jednej próbki. Odpowiednio zwiększ kwotę. Nie mieszaj proteinazy i kolagenazy. 
	UWAGA: Nosić maskę na twarz lub pracować pod wyciągiem, aby uniknąć wdychania proszku enzymatycznego. 
	UWAGA: Aktywność enzymu może się różnić w zależności od partii. W związku z tym optymalne stężenie może się różnić i powinno być ustalane dla każdego nowo zakupionego enzymu16.</li>
</ol>
2. Przechowywanie i transport tkanki mięśnia sercowego
<ol>
	<li>Przechowuj i transportuj próbki serca ludzkiego w schłodzonym roztworze tnącym o temperaturze 4 °C (Tabela 1).</li>
	<li>Użyj tego samego roztworu do dalszego przetwarzania tkanek i krojenia wibratomem. 
	UWAGA: Biopsje i chirurgiczne próbki serca należy natychmiast przenieść do roztworu tnącego w temperaturze 4 °C, a następnie przechowywać lub transportować w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 36 godzin przed zastosowaniem tego protokołu.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie i krojenie tkanki
UWAGA: Protokół krojenia tkanek jest zgodny z Fischer et al.15.
<ol>
	<li>Przycinanie bloku tkankowego 
	UWAGA: Ludzka tkanka serca jest potencjalnie zakaźna. Zawsze używaj odzieży ochronnej i przestrzegaj przepisów bezpieczeństwa obowiązujących w Twojej instytucji. Ostrożnie obchodź się ze zużytymi ostrzami i wyrzuć je do bezpiecznych pojemników.
	<ol>
		<li>Umieścić próbkę w naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm wypełnionym 20 ml roztworu do cięcia na zimno i przechowywać na schłodzonej płytce o temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usuń nadmiar tkanki zwłóknieniowej i tłuszczu nasierdziowego za pomocą skalpela. W przypadku próbki przezściennej należy usunąć beleczki i warstwy tkanek w pobliżu wsierdzia. 
		UWAGA: Tkanka zwłóknieniowa jest sztywna i wydaje się biała. Tłuszcz jest zazwyczaj miękki i ma barwę od białej do żółtej. Beleczki i warstwy tkanki wsierdzia można zidentyfikować na podstawie ich luźnego składu tkankowego i niewyrównanej orientacji włókien w porównaniu z mięśniem sercowym warstw nasierdzia</li>
		<li>Aby uzyskać optymalną obróbkę wibratomową, wytnij skalpelem prostokątne bloki tkanek o wymiarach około 8 mm x 8 mm x 8 mm z większej próbki tkanki. W przypadku mniejszych biopsji pomiń ten krok i przejdź do osadzania agarozy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie tkanki serca w agarozie o niskiej temperaturze topnienia
	<ol>
		<li>Zagotować 400 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 10 ml roztworu tnącego w szklanej zlewce. 
		UWAGA: Nosić rękawice i okulary ochronne, aby uniknąć oparzeń. Z gorącymi naczyniami szklanymi należy obchodzić się tylko w odzieży chroniącej przed wysoką temperaturą.</li>
		<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml gorącym, rozpuszczonym żelem agarozowym. Zamknąć strzykawkę i pozostawić agarozę do zrównoważenia w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 15 minut.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy umieść przyciętą próbkę serca lub biopsję w czystym naczyniu do hodowli tkanek o średnicy 35 mm z nasierdziem skierowanym w dół i usuń nadmiar płynu sterylnym wacikiem.</li>
		<li>Wylać zrównoważoną agarozę (krok 3.2.2) na tkankę, opróżniając strzykawkę. Zabezpiecz tkankę przed ruchem kleszczami podczas nalewania agarozy. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w agarozie.</li>
		<li>Natychmiast umieść naczynie na lodzie i pozwól agarozie zastygnąć przez 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cięcie mięśnia sercowego
	<ol>
		<li>Zamontuj nową żyletkę do uchwytu ostrza wibratomu i skalibruj wibratom, regulując ugięcie ostrza w osi z, jeśli to możliwe. 
		UWAGA: W tym protokole wykorzystuje wibratomium z urządzeniem do kalibracji wspomaganym podczerwienią w celu wyrównania ostrza w pozycji poziomej z minimalnym ugięciem z (zmierzone ugięcie <0,1 μm).</li>
		<li>Użyj skalpela, aby wyciąć blok tkanki agarozowej, który pasuje do uchwytu próbki wibratomu. Aby zapewnić stabilność, upewnij się, że tkanka jest nadal wystarczająco zanurzona w agarozie (brzegi agarozy ≥ 8 mm).</li>
		<li>Przymocuj blok agarozy do uchwytu próbki za pomocą cienkiej warstwy kleju cyjanoakrylowego i delikatnego nacisku.</li>
		<li>Umieść uchwyt na próbkę wraz z chusteczką w kąpieli wibratomowej. Napełnić kąpiel roztworem tnącym i utrzymywać temperaturę 4–6 °C przez cały czas przetwarzania za pomocą kruszonego lodu, napełnionego zewnętrznym zbiornikiem chłodzącym wibratomu.</li>
		<li>Generuj plastry o grubości 300 μm z prędkością posuwania ≤0,1 mm/s, częstotliwością oscylacyjną 80 Hz, amplitudą boczną 1,5 mm i kątem ostrza 15°. Podczas obchodzenia się z plastrami trzymaj agarozę zamiast samej tkanki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki. Przechowywać plastry w roztworze do krojenia w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 2 godziny, jeśli to konieczne. 
		UWAGA: Kardiomiocyty są zorientowane równolegle do nasierdzia. Dlatego ważne jest, aby ciąć równolegle do nasierdzia, aby uniknąć nadmiernego uszkodzenia miocytów. Zaleca się wyrzucenie pierwszych 1–3 plastrów, ponieważ do izolacji należy używać tylko jednolitych plastrów o stałej grubości. Jednak w przypadku biopsji małych tkanek należy wyrzucić tylko pierwszy plasterek.</li>
		<li>Sprawdź ustawienie kardiomiocytów pod standardowym mikroskopem świetlnym o powiększeniu 40-100x.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Trawienie tkankowe
<ol>
	<li>Umieść płytę grzewczą na wytrząsarce laboratoryjnej i podgrzej ją do 37 °C. Uruchom wytrząsarkę laboratoryjną z prędkością 65 obr./min.</li>
	<li>Rozpuścić proteinazę (przygotowaną w kroku 1.3) w 2 ml roztworu 1 (etapy 1.1 i 1.2) i inkubować w temperaturze 37 °C aż do użycia. Nie mieszaj proteinazy i kolagenazy.</li>
	<li>Rozpuścić kolagenazę (przygotowaną w kroku 1.4) w 2 ml roztworu 1 (etapy 1.1 i 1.2) i inkubować w temperaturze 37 °C aż do użycia. Nie mieszaj proteinazy i kolagenazy. 
	UWAGA: Nosić okulary i rękawice ochronne, ponieważ rozpuszczone enzymy mogą powodować urazy skóry i oczu.</li>
	<li>Dodać chlorek wapnia (CaCl2) do roztworu zawierającego kolagenazę (przygotowanego w kroku 4.3) do końcowego stężenia 5 μM.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś plasterek tkanki z kąpieli wibratomicznej do czystego naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm wypełnionego 5 ml wstępnie schłodzonego roztworu do cięcia (kroki 1.1 i 1.2) i trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Ostrożnie usuń agarozę z tkanki mięśnia sercowego za pomocą ostrza lub kleszczy. 
	UWAGA: Unikaj nadmiernego napięcia i naprężeń ścinających na plasterkach mięśnia sercowego, ponieważ mogą one uszkodzić kardiomiocyty.</li>
	<li>Aby przeprowadzić wstępne płukanie, umieść czyste naczynie do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm na płycie grzewczej i napełnij je 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu 1. Przenieś 1-2 plastry mięśnia sercowego do przygotowanego naczynia za pomocą kleszczy. Odessać roztwór pipetą o pojemności 1 ml i wykonać czynności płukania 2x, aby usunąć resztki roztworu tnącego. 
	UWAGA: Nie zasysaj plastrów serca. Roztwory i plastry powinny pozostawać w stałej temperaturze 35 °C na wymieszanej płycie grzewczej. W razie potrzeby wyreguluj temperaturę płyty grzewczej.</li>
	<li>Wyjąć roztwór 1 z naczynia i dodać 2 ml roztworu proteinazy (krok 4.2). Inkubować przez 12 minut na płycie grzewczej z prędkością 65 obr./min.</li>
	<li>Przemyć 2x 2 ml podgrzanego roztworu 1 (37 °C).</li>
	<li>Usunąć roztwór 1 z naczynia i dodać 2 ml roztworu kolagenazy (kroki 4.3 i 4.4). Inkubować co najmniej 30 minut na płycie grzewczej z prędkością 65 obr./min.</li>
	<li>Sprawdź wolne pojedyncze miocyty po 30, 35, 40 minutach itd., umieszczając naczynie pod mikroskopem świetlnym. Pracuj szybko, aby uniknąć znacznego wychłodzenia roztworu. 
	UWAGA: Wymagany czas trawienia może się różnić w zależności od budowy tkanki i stopnia zwłóknienia. Gdy tylko tkanka stanie się widocznie miękka i łatwo dysocjuje po delikatnym pociągnięciu, osiągnięty został optymalny czas trawienia. Jeśli dostępna jest wystarczająca ilość tkanki, kilka plastrów może być trawionych równolegle z różnym czasem trawienia.</li>
	<li>Gdy tkanka zostanie strawiona i widoczne są poszczególne miocyty (krok 4.11), przemyć 2x 2 ml podgrzanego roztworu 2 (37 °C) i ponownie napełnić 2 ml.</li>
</ol>
5. Dysocjacja tkanek
<ol>
	<li>Oddziel strawione plastry tkanki za pomocą kleszczy, ostrożnie rozsuwając włókna.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować kilka razy jednorazową pipetą Pasteura (średnica otworu >2 mm). 
	UWAGA: Stosowanie kleszczy i pipetowania może wywoływać naprężenia mechaniczne i powodować uszkodzenie kardiomiocytów. Jest to jednak kluczowy krok do rozdzielenia komórek. Użyj cienkich kleszczy, aby zminimalizować uszkodzenia komórek i ostrożnie rozdziel plasterki na mniejsze kawałki.</li>
	<li>Sprawdź, czy pod mikroskopem świetlnym nie ma uwolnionych kardiomiocytów w kształcie pręcików.</li>
</ol>
6. Przywrócenie fizjologicznego stężenia wapnia
<ol>
	<li>Powoli zwiększać stężenie wapnia z 5 μM do 1,5 mM, mieszając w temperaturze 35 °C na płycie grzewczej. Stosować roztwory podstawowe CaCl2 o stężeniach 10 mM i 100 mM. Zalecane kroki: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1,200, 1,500 μM. Pozwól komórkom przystosować się do zwiększonego poziomu wapnia w 5-minutowych odstępach inkubacji między każdym etapem.</li>
	<li>Ostrożnie usuń niestrawione kawałki tkanki za pomocą kleszczy lub przefiltruj zawiesinę komórkową przez nylonową siatkę o wielkości porów 180 μm pod koniec wzrostu wapnia.</li>
</ol>
7. Usunięcie mechanicznego środka rozprzęgającego
<ol>
	<li>Przestań mieszać i powoli usuń jedną trzecią roztworu (~700 μL) z góry za pomocą pipety o pojemności 1 000 μL. Unikać aspiracji kardiomiocytów. 
	UWAGA: Jeśli niestrawiona tkanka została usunięta, kardiomiocyty zgromadzą się w środku naczynia, co ułatwi aspirację roztworu bezkomórkowego. W przeciwnym razie przenieść roztwór komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i pozostawić komórki do osadzania się przez 10 minut w temperaturze 35 °C, następnie odessać 700 μl supernatantu i wyrzucić, ponownie zawiesić komórki, przenieść je z powrotem do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm i postępować zgodnie z krokiem 7.2.</li>
	<li>Dodać 700 μl roztworu 3 do komórek, wznowić mieszanie na płytce grzewczej i inkubować przez 10 minut.</li>
	<li>Powtórz kroki 7.1 i 7.2.</li>
	<li>Przenieść roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i pozostawić kardiomiocyty do osadu przez co najmniej 10 minut, a maksymalnie 30 minut w temperaturze pokojowej lub wirować przy 50 x g przez 1 minutę. Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić w zmodyfikowanym roztworze Tyrode'a lub w żądanym buforze eksperymentalnym. 
	UWAGA: Kardiomiocyty mogą być przechowywane w zmodyfikowanym roztworze Tyrode'a (Tabela 1) przez kilka godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed użyciem.</li>
	<li>Sprawdź jakość komórek za pomocą standardowego mikroskopu świetlnego przy powiększeniu 40x i 200x. 
	UWAGA: Około 30–50% kardiomiocytów powinno mieć kształt pręcików, być gładkie, bez pęcherzyków błonowych i mieć wyraźne poprzeczne prążki. Tylko 5-10% żywotnych komórek powinno wykazywać spontaniczne skurcze.</li>
</ol>

<ol><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).</li>
<li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Tolerant+Ventricular+Myocytes+Prepared+by+preincubation+in+a+KB+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).</li>
<li>Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+handling+in+isolated+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Circulation. 85, 1046-1055 (1992).</li>
<li>Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force%2Fshortening-frequency+relationship+in+multicellular+muscle+strips+and+single+cardiomyocytes+of+human+failing+and+nonfailing+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Failure%22%5BJournal%5D)">Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts.</a> Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).</li>
<li>Peeters, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+human+ventricular+myocytes+from+single+endocardial+and+epicardial+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies.</a> The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Functional+Characterization+of+Human+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Fresh+Surgical+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51116(2014).</li>
<li>Seidel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheet-Like+Remodeling+of+the+Transverse+Tubular+System+in+Human+Heart+Failure+Impairs+Excitation-Contraction+Coupling+and+Functional+Recovery+by+Mechanical+Unloading%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading.</a> Circulation. 135, 1632-1645 (2017).</li>
<li>Hartmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiarrhythmic+effects+of+dantrolene+in+human+diseased+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).</li>
<li>Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+preparation+of+isolated+single+adult+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new method for preparation of isolated single adult myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).</li>
<li>Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrube%2C+G+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).</li>
<li>Schlüter, K. D., Schreiber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Ventricular+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22%5BJournal%5D)">Adult Ventricular Cardiomyocytes.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).</li>
<li>Del Monte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+contractile+function+in+isolated+cardiomyocytes+from+failing+human+hearts+by+gene+transfer+of+SERCA2a%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a.</a> Circulation. 100, 2308-2311 (1999).</li>
<li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).</li>
<li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li>
<li>Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html">http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html</a> (2019).</li>
<li>Seidel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+preserve+the+t-tubular+system+in+ventricular+cardiomyocytes+by+upregulation+of+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux.</a> Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47(2019).</li>
<li>Lipsett, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+substructure+reverts+to+an+immature+phenotype+during+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure.</a> Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).</li>
<li>Guo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+method+for+isolation+of+human+cardiomyocytes+to+model+cardiac+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).</li>
<li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices%3A+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).</li>
<li>Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+MTT+assay+in+adult+ventricular+cardiomyocytes+to+assess+viability%3A+Effects+of+adenosine+and+potassium+on+cellular+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).</li>
<li>Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211, 646-647 (1966).</li>
<li>Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium+paradox+revisited+An+artefact+of+great+heuristic+value%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value.</a> Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).</li>
<li>Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hypothermia+on+the+occurrence+of+the+calcium+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).</li>
<li>Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+human+left+ventricular+myocardium+from+cutting+injury+with+2%2C3-butanedione+monoxime%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime.</a> Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).</li>
<li>Busselen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sodium+on+the+calcium+paradox+in+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Atrial+Myocytes+for+Simultaneous+Measurements+of+Ca2%2BTransients+and+Membrane+Currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50235(2013).</li>
<li>Leor, J., Kloner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Experimental+Model+Examining+the+Role+of+Magnesium+in+the+Therapy+of+Acute+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction.</a> The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).</li>
<li>Herzog, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+Magnesium+Therapy+Affects+Experimental+Infarct+Size%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size.</a> Circulation. 92, 2622-2626 (1995).</li>
<li>Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty-hour+preservation+of+the+rabbit+heart%3A+Optimal+osmolarity%2C+%5BMg2%2B%5D%2C+and+pH+of+a+modified+UW+solution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).</li>
<li>Hall, S. K., Fry, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium+affects+excitation%2C+conduction%2C+and+contraction+of+isolated+mammalian+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).</li>
<li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Slices+from+Adult+Mammalian+Hearts+as+a+Model+for+Pharmacological+Drug+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+cardiac+tissue+slices%3A+An+organotypic+pseudo+two-dimensional+model+for+cardiac+biophysics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).</li>
<li>Thomas, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Myocardial+Slice+Culture+Model+Reveals+Alpha-1A-Adrenergic+Receptor+Signaling+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart.</a> Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).</li>
<li>Perreault, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+basis+of+negative+inotropic+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+in+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).</li>
<li>Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+desensitization+of+the+myocardial+contractile+apparatus+forcalcium%3A+A+new+concept+for+improving+tolerance+to+cold+ischemia+in+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardio-thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium.</a> European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).</li>
<li>Horiuti, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+2%2C+3-butanedione+2-monoxime+on+contraction+of+frog+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).</li>
<li>Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diacetyl+monoxime+on+cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).</li>
<li>Sellin, L. C., Mcardle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Effects+of+2%2C3+Butanedione+Monoxime%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime.</a> Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).</li>
<li>Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEghbali-Webb%2C+M+%22Novel+Methods+in+Molecular+and+Cellular+Biochemistry+of+Muscle%22">Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle</a>. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).</li>
<li>Camelliti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+heart+slices+are+a+multicellular+system+suitable+for+electrophysiological+and+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10, 2168(2019).</li>
<li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Slices%3A+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż izolacja żywych kardiomiocytów została ustalona ponad 40 lat temu i nadal stanowi warunek wstępny dla wielu podejść eksperymentalnych w badaniach kardiologicznych, pozostaje trudną techniką o nieprzewidywalnych wynikach. Izolacja kardiomiocytów poprzez perfuzję tętnic wieńcowych roztworem enzymu jest powszechnie stosowana w przypadku serc małych zwierząt i daje dużą liczbę żywotnych komórek. Wymaga to jednak stosunkowo złożonego systemu i specjalistycznej wiedzy. Ponadto większość próbek tkanek ludzkich nie nadaj...

Przełomowa technika, która utorowała drogę do ważnych wglądów w fizjologię kardiomiocytów, polega na izolowaniu żywych kardiomiocytów komorowych z nienaruszonych serc1. Izolowane kardiomiocyty mogą być wykorzystywane do badania normalnej struktury i funkcji komórkowej lub konsekwencji eksperymentów in vivo; Na przykład do oceny zmian w elektrofizjologii komórkowej lub sprzężenia pobudzenie-skurcz w zwierzęcych modelach chorób serca. Dodatkowo izolowane kardiomiocyty mogą być wykorzystywane do hodowli komórkowych, interwencji farmakologicznych, transferu genów, inżynierii tkankowej i wielu innych zastosowań. W związku z tym skuteczne metody izolacji kardiomiocytów mają fundamentalną wartość dla podstawowych i translacyjnych badań kardiologicznych.
Kardiomiocyty małych ssaków, takich jak gryzonie, oraz większych ssaków, takich jak świnie czy psy, są zwykle izolowane przez perfuzję wieńcową serca roztworami zawierającymi prymitywne kolagenazy i/lub proteazy. Została ona opisana jako "złoty standard" metody izolacji kardiomiocytów, w wyniku której uzyskuje się do 70% żywotnych komórek2. Podejście to zostało również zastosowane w przypadku ludzkich serc, co dało akceptowalną wydajność kardiomiocytów3,4,5. Ponieważ jednak perfuzja wieńcowa jest możliwa tylko wtedy, gdy dostępne jest nienaruszone serce lub duży klin mięśnia sercowego zawierający gałąź tętnicy wieńcowej, większość próbek serca u ludzi nie nadaje się do tego podejścia ze względu na ich mały rozmiar i brak odpowiedniego unaczynienia. Dlatego izolacja ludzkich kardiomiocytów jest wyzwaniem.
Ludzkie próbki mięśnia sercowego składają się głównie z fragmentów tkanek o różnych rozmiarach (około 0,5 x 0,5 x 0,5 cm do 2 x 2 x 2 cm), uzyskanych poprzez biopsje endomięśnia sercowego6, miektomie przegrody międzymięśniowej7, implantacje VAD8, lub z eksplantowanych serc9. Najczęstsze procedury izolacji kardiomiocytów rozpoczynają się od rozdrobnienia tkanki za pomocą nożyczek lub skalpela. Kontakty międzykomórkowe są następnie zakłócane przez zanurzenie w bezwapniowych lub o niskiej zawartości wapnia. Następnie następuje wiele etapów trawienia z surowymi ekstraktami enzymatycznymi lub oczyszczonymi enzymami, takimi jak proteazy (np. Trypsyna), kolagenaza, hialuronidaza lub elastaza, co powoduje rozpad macierzy zewnątrzkomórkowej i uwolnienie kardiomiocytów. W ostatnim, krytycznym kroku, fizjologiczne stężenie wapnia musi zostać ostrożnie przywrócone, w przeciwnym razie może dojść do uszkodzenia komórek z powodu paradoksu wapnia10,11,12. Takie podejście do izolacji jest wygodne, ale zwykle nieefektywne. Na przykład jedno z badań wykazało, że prawie 1 g tkanki mięśnia sercowego był potrzebny do uzyskania wystarczającej liczby kardiomiocytów odpowiednich do kolejnych eksperymentów13. Możliwą przyczyną niskich plonów jest stosunkowo surowa metoda mielenia tkanki. Może to szczególnie uszkodzić kardiomiocyty znajdujące się na krawędziach kawałków, chociaż te miocyty najprawdopodobniej zostaną uwolnione przez trawienie enzymatyczne.
Innym aspektem, który może wpływać na skuteczność izolacji i jakość komórek uzyskanych z próbek ludzkich, jest czas trwania niedokrwienia tkanek. Większość protokołów wspomina o krótkim czasie transportu do laboratorium jako warunku wstępnym dobrych wyników. Ogranicza to badania ludzkich kardiomiocytów komorowych do laboratoriów z pobliskimi ośrodkami kardiochirurgicznymi. Łącznie ograniczenia te utrudniają weryfikację ważnych wyników z modeli zwierzęcych w ludzkich kardiomiocytach. W związku z tym pożądane są ulepszone protokoły izolacji, które pozwalają na uzyskanie wysokiej wydajności kardiomiocytów z niewielkich ilości tkanki, najlepiej bez poważnych uszkodzeń po dłuższym czasie transportu.
Opisany tutaj jest protokół izolacji oparty na enzymatycznym trawieniu cienkich wycinków tkanki mięśnia sercowego generowanych za pomocą vibratome14,15. Pokazujemy, że izolacja z wycinków tkanek jest znacznie bardziej efektywna niż izolacja z kawałków tkanek zmielonych nożyczkami. Opisana metoda nie tylko pozwala na uzyskanie wysokiej wydajności żywotnych ludzkich kardiomiocytów z niewielkich ilości tkanki mięśnia sercowego, ale ma również zastosowanie do próbek przechowywanych lub transportowanych w zimnym roztworze kardioplegicznym przez okres do 36 godzin.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3-butanodionemonoksym</td><td>Carl Roth</td><td>3494.1</td><td>Czystość>99%</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Carl Roth</td><td>163.2</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat kreatyny</td><td>Alfa Aesar</td><td>B250009</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Merck</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>P017.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>Fluka Biochemica</td><td>49450</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Carl Roth</td><td>6351.5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x 6H2O</td><td>Carl Roth</td><td>A537.1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Carl Roth</td><td>8551.2</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Dyes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10488</td><td></td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza CLS typu I</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td>Stosowana do tkanek ludzkich w dawce 4 mg / ml (aktywność: 280 U / mg)</td></tr> <tr><td>Kolagenaza CLS typu II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Stosowana do tkanek szczurów w dawce 1,5 mg / ml (aktywność 330 U / mg)</td></tr><tr><td>Proteaza XIV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8038</td><td>Stosowana do tkanek szczurów w dawce 0,5 mg / ml (aktywność & 3,5 U / mg)</td></tr><tr><td>Proteinaza XXIV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5147</td><td>Używany do tkanek ludzkich w ilości 0,5 mg / ml (aktywność: 7-14 U / mg)</td></tr> <tr><td>Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizator komórek (LSR Fortessa)</td><td>BD Bioscience</td><td>649225</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa, 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa, 50 ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowa wytrząsarka</td><td>Edmund B&uuml; hler</td><td>KS-15 B Sterowanie</td><td>Kierunek mieszania: poziomy</td></tr><tr><td>Jednorazowe plastikowe pipety pasteura</td><td>Carl Roth</td><td>EA65.1</td><td>Do rozcierania komórek należy używać wyłącznie pipet o wewnętrznej średnicy końcówki &ge; </td></tr><tr><td>Kleszczyki</td><td>2 mm FST</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>VWR</td><td>BARN88880030</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy nylonowy, 180 &mikro; m</td><td>Merck</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 100, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 35, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 60, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome (VT1200S)</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td>Zawiera VibroCheck do wspomaganej podczerwienią korekcji odchylenia Z</td></tr></tbody></table>

izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Izolacja komorowych miocytów serca od serc zwierzęcych i ludzkich jest podstawową metodą w badaniach kardiologicznych. Kardiomiocyty zwierzęce są zwykle izolowane przez perfuzję wieńcową z enzymami trawiennymi. Jednak izolowanie ludzkich kardiomiocytów jest trudne, ponieważ próbki ludzkiego mięśnia sercowego zwykle nie pozwalają na perfuzję wieńcową, a alternatywne protokoły izolacji skutkują słabą wydajnością żywotnych komórek. Ponadto próbki ludzkiego mięśnia sercowego są rzadkie i regularnie dostępne tylko w placówkach z chirurgią kardiochirurgiczną na miejscu. Utrudnia to translację wyników z kardiomiocytów zwierzęcych na ludzkie. Opisano tutaj niezawodny protokół, który umożliwia skuteczną izolację miocytów komorowych z mięśnia sercowego ludzkiego i zwierzęcego. Aby zwiększyć stosunek powierzchni do objętości przy jednoczesnej minimalizacji uszkodzeń komórek, z próbek mięśnia sercowego za pomocą wibratomu generowane są plastry tkanki mięśnia sercowego o grubości 300 μm. Plastry tkanek są następnie trawione za pomocą proteazy i kolagenazy. Mięsień sercowy szczura wykorzystano do ustalenia protokołu i ilościowego określenia plonów żywotnych, tolerujących wapń miocytów za pomocą cytometrycznego zliczania komórek. Porównanie z powszechnie stosowaną metodą fragmentów tkanek wykazało istotnie wyższą wydajność kardiomiocytów pręcikowych (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). Protokół został przełożony na uszkodzony i niezawodny ludzki mięsień sercowy, gdzie wydajność była podobna jak w mięśniu sercowym szczura i, ponownie, znacznie wyższa niż w przypadku metody fragmentów tkanki (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 komórek/mg, p < 0,05). Warto zauważyć, że dzięki przedstawionemu protokołowi możliwe jest wyizolowanie rozsądnej liczby żywotnych ludzkich kardiomiocytów (9–200 komórek/mg) z minimalnych ilości tkanki (<50 mg). W związku z tym metoda ma zastosowanie do zdrowego i niewydolnego mięśnia sercowego zarówno z serca, jak i ludzkiego. Ponadto możliwe jest wyizolowanie pobudliwych i kurczliwych miocytów z próbek tkanek ludzkich przechowywanych do 36 godzin w zimnym roztworze kardioplegicznym, co czyni tę metodę szczególnie przydatną w laboratoriach w placówkach, w których nie przeprowadza się kardiochirurgii na miejscu.

Aby zweryfikować wydajność izolacji, protokół zastosowano w odniesieniu do mięśnia sercowego szczura, a otrzymaną liczbę żywych miocytów porównano z liczbami uzyskanymi poprzez izolację z perfuzją wieńcową oraz izolację z małych fragmentów tkanki (izolacja z fragmentów, Rysunek 2). Izolację z fragmentów oraz izolację z plastrów tkanki przeprowadzono z tych samych serc. W przypadku izolacji z perfuzją wieńcową wykorzystano jednak całe serce. Perfuzja wieńcowa pozwoliła uzyskać głównie kardiom...

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (<50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Protokół ten działa w przypadku próbek z ludzkich i zwierzęcych serc, nawet po wielu godzinach transportu. Z wyciętych wibratomem plastrów tkanki można wyizolować do 200 miocytów na miligram. Analiza elektrofizjologiczna, strukturalna i biochemiczna kardiomiocytów pomaga odkryć i lepiej zrozumieć mechanizmy chorób serca.Po napełnieniu 100-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej 20 mililitrami roztworu do cięcia na zimno, umieść próbkę tkanki w naczyniu hodowlanym. Trzymaj naczynie hodowlane na talerzu schłodzonym do 4 stopni Celsjusza. Należy pamiętać, że żywe próbki tkanek od zwierząt, a zwłaszcza od ludzi, są potencjalnie zakaźne.Użyj nożyczek lub skalpela, aby usunąć nadmiar tkanki zwłóknieniowej i tłuszczu nasierdziowego z próbki. Aby uzyskać optymalne przetwarzanie wibratomu większych próbek tkanek, użyj skalpela, aby wyciąć osiem milimetrów sześcianów z tkanki. W przypadku mniejszych próbek z biopsji nie jest to konieczne.Nasierdzie można zidentyfikować po warstwie tłuszczu nasierdzia. Po usunięciu nadmiaru tłuszczu umieść blok tkanki w naczyniu, nasierdziem skierowanym w dół. Aby przygotować się do zatopienia w tkance, zagotuj 400 miligramów agarozy o niskiej temperaturze topnienia w dziesięciu mililitrach roztworu tnącego.Napełnij dziesięciomililitrową strzykawkę gorącym, rozpuszczonym żelem agarozowym. Zamknąć strzykawkę i umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej 15 minut, aby umożliwić zrównoważenie agarozy. Za pomocą kleszczy przenieś wycinek do czystego naczynia do hodowli tkankowej o grubości 35 milimetrów, z nasierdziem skierowanym w dół.Następnie usuń nadmiar płynu z próbki za pomocą sterylnego wacika. Zabezpiecz próbkę przed przemieszczaniem się, przytrzymując ją kleszczami. I opróżnij strzykawkę z agarozą na wierzchu, upewniając się, że próbka jest całkowicie zanurzona.Natychmiast umieść naczynie na lodzie i pozwól agarozie zastygnąć przez 10 minut. Zamontuj nieużywaną żyletkę do uchwytu ostrza wibratomu. Jeśli to możliwe, skalibruj wibratom, regulując odchylenie ostrza w kształcie litery Z.Użyj skalpela, aby wyciąć blok tkanki agarozowej, który pasuje do uchwytu próbki wibratomu. Aby zapewnić stabilność, upewnij się, że tkanka jest nadal wystarczająco zanurzona w agarozie. Z brzegami agarozy, co najmniej ośmiomilimetrowymi.Nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na uchwyt próbki. I delikatnie dociśnij blok tkanki agarozowej do uchwytu. Zbuduj wannę wibratomową z roztworem tnącym.Następnie napełnij zewnętrzny zbiornik chłodzący wibratomu kruszonym lodem, aby utrzymać temperaturę od czterech do sześciu stopni Celsjusza przez cały proces cięcia. Umieścić uchwyt na próbkę, zawierający blok tkanki agarozowej, w kąpieli wibratomowej. Korzystając z ustawień wibratomu opisanych w manuskrypcie, wygeneruj plastry o grubości 300 mikrolitrów.Bardzo ważne jest tworzenie odcinków w równoległym nasierdziu, ponieważ w ten sposób włókna kardiomiocytów są ustawione w ścianie komory. W przeciwnym razie będzie zbyt dużo uszkodzeń. Użyj standardowego mikroskopu świetlnego, aby sprawdzić wyrównanie kardiomiocytów i wycinków tkanki.Aby uniknąć uszkodzenia tkanki, trzymaj agarozę zamiast samej tkanki. Włókna kardiomiocytów powinny być równomiernie wyrównane, a miocyty nie powinny być skurczone. Umieść płytę grzewczą na wytrząsarce laboratoryjnej i podgrzej ją do 37 stopni Celsjusza.Uruchom wytrząsarkę laboratoryjną z prędkością 65 obr./min. Rozpuść proteinazę w dwóch mililitrach roztworu. I rozpuść kolagenazę w dwóch mililitrach roztworu.Ale nie mieszaj proteinazy i kolagenazy. Dodać chlorek wapnia do roztworu kolagenazy, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu mikromolowych. Inkubować oba roztwory w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Użyj kleszczy, aby przenieść plasterek tkanki do czystego naczynia do hodowli tkankowej o grubości 60 milimetrów. Z pięciomilimetrową wstępnie schłodzoną roztworem do cięcia. Trzymając naczynie na lodzie lub zimnym talerzu, ostrożnie usuń agarozę z tkanki za pomocą ostrza lub kleszczy.Aby przeprowadzić wstępne mycie plastrów tkanki, umieść czyste naczynie do hodowli tkankowych o grubości 35 milimetrów na ostrzu grzewczym. I napełnij go dwoma milimetrami wstępnie podgrzanego roztworu. Przełóż jeden lub dwa plasterki tkanki do przygotowanego naczynia.Następnie użyj pipety o długości jednego milimetra do etapów mycia. Po umyciu plastrów wyjmij roztwór pierwszy z naczynia i dodaj dwa mililitry roztworu proteinazy. Inkubuj plastry przez 12 minut na ostrzu grzewczym, z wytrząsarką na 65 obr./min.Umyj plastry chusteczki jeszcze dwa razy, dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego roztworu. Następnie wyjmij roztwór pierwszy z naczynia i dodaj dwa mililitry roztworu kolagenazy. Inkubuj plastry przez co najmniej 30 minut na ostrzu grzewczym, potrząsając z prędkością 65 obr./min.Po 15 minutach inkubacji sprawdź, czy poszczególne miocyty są wolne, badając naczynie pod mikroskopem świetlnym. Kontynuuj sprawdzanie co pięć minut, aż poszczególne miocyty będą widoczne. Następnie przeprowadź trawienie alternatywne, myjąc plastry dwukrotnie, dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego roztworu.I napełnij naczynie dwoma mililitrami roztworu dwa. Ostrożnie rozsuń włókna tkanki za pomocą cienkich kleszczy. Kontynuuj ostrożną pracę, aby uniknąć uszkodzenia kardiomiocytów.I pipetować kilka razy, przy czym jednorazowe użycie obok pipety. Następnie potwierdź, że kardiomiocyty w kształcie pręcików oddzieliły się, badając naczynie pod mikroskopem świetlnym. Umieść naczynie z powrotem na płycie grzewczej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zamieszaj, potrząsając.Dodając 10 milimolowe i 100-milimolowe roztwory podstawowe chlorku wapnia, powoli zwiększaj stężenie wapnia w zawiesinie tkankowej z pięciu mikromolowych do 1,5 milimolowych. Kiedy przyrost wapnia zostanie zakończony, użyj kleszczy, aby usunąć wszelkie pozostałe niestrawione kawałki tkanki. Najpierw przestań mieszać zawiesinę.Następnie, za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, powoli usuń 1/3 roztworu z górnej części zawiesiny. Unikać aspiracji kardiomiocytów. Następnie dodaj 700 mikrolitrów roztworu trzeciego do komórek.Po 10 minutach mieszania powtórz te kroki prania. Przenieść zawiesinę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. I pozwól kardiomiocytom ustabilizować się w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut i maksymalnie 30 minut.Całkowicie usunąć supernatant. I ponownie zawiesić osad w zmodyfikowanym roztworze tyrodowym lub pożądanym buforze eksperymentalnym. Za pomocą mikroskopu świetlnego sprawdź jakość komórek.30 do 50% kardiomiocytów powinno mieć kształt pręcików, gładkich bez pęcherzyków błonowych. I wyświetlaj, wyraźne prążki krzyżowe. Aby zweryfikować skuteczność izolacji, protokół zastosowano do mięśnia sercowego szczura.I w porównaniu z izolacją przez perfuzję wieńcową i izolację z małych fragmentów tkanki. Mniejszy odsetek komórek pręcikowych zaobserwowano podczas stosowania protokołu, a następnie po izolacji przez perfuzję. Ale ogólna liczba była nadal wysoka.W przeciwieństwie do tego, izolacja od fragmentów tkanek dała mniej komórek w kształcie pręcików. Cytometria przepływowa została wykorzystana do ilościowego porównania wyników. Izolacja kardiomiocytów z wycinków tkanek nie osiąga wydajności uzyskanej przez perfuzję wieńcową.Ale zapewnia znacznie wyższe plony niż izolacja miocytów z fragmentów tkanki. Następnie protokół zastosowano do mięśnia sercowego u człowieka. Izolacja z wycinków mięśnia sercowego pozwoliła uzyskać liczbę Hyde'a i dużą część ludzkich miocytów w kształcie pręcików.I tylko niewielka część, zaokrąglonych kardiomiocytów. Izolacja z wycinków mięśnia sercowego spowodowała uderzająco większą liczbę miocytów w kształcie pręcików niż izolacja z fragmentów tkanki. Kwantyfikacja fotometryczna potwierdziła znacznie wyższą żywotność miocytów po wyizolowaniu z wycinków mięśnia sercowego.Komórki ludzkie, wyizolowane za pomocą opisanego protokołu, mogą być poddane analizie strukturalnej. Barwienie alfa aktyniną ujawniło gęsty, regularny wzór linii Z i średnią długość sarkomeru 1,92 mikrometra w spoczynkowych kardiomiocytach. Barwienie LTCC i RyR wykazało, że wyraźny klaster jest kolokalizowany w pobliżu błony komórkowej i kanalików T.Wyizolowane kardiomiocyty były pobudliwe i mogły być wykorzystane do badań nad elektrofizjologią komórkową lub sprzężeniem skurczu pobudzenia. Kształt i czas trwania potencjału czynnościowego mieścił się w zakresie zgłaszanym przez innych, dla kardiomiocytów komorowych, od niewydolnych ludzkich serc. Przejściowe stany wapnia zarejestrowane przez skanowanie linii głosowych Khana wykazały wyraźny wzrost po stymulacji.I akceptowalny stosunek sygnału do szumu. Skrócenie kardiomiocytów przez skurcz można zaobserwować po odchyleniu dolnej granicy komórek. Ze względu na dużą liczbę izolatorów kardiomiocytów uzyskanych za pomocą tego protokołu, hodowla komórkowa jest możliwa.Może to pozwolić na transfer genów, badania farmakologiczne i inżynierię tkankową ludzkich kardiomiocytów. Ważnym zastosowaniem jest weryfikacja wyników z modeli zwierzęcych w komórkach ludzkich. Niewydolność serca jest zespołem klinicznym o bardzo ograniczonych możliwościach terapeutycznych.Ulepszone techniki izolacji kardiomiocytów pomogą zidentyfikować cele komórkowe do diagnozy i przyszłych terapii.

isolation-human-ventricular-cardiomyocytes-from-vibratome-cut

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Tutaj opisujemy przygotowanie żywotnych wycinków komorowych od dorosłych myszy i ich wykorzystanie do rejestracji potencjału czynnościowego elektrod ostrych. Te wielokomórkowe preparaty zapewniają zachowaną in vivo strukturę tkankową, co czyni je cennym modelem do badań elektrofizjologicznych i farmakologicznych in vitro.

Mysie plastry serca o krótkiej osi do badań elektrofizjologicznych

Ten protokół jest używany do izolowania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych z serca dorosłej myszy za pomocą metody trawienia fragmentów. Podejście to stosuje się do izolacji miocytów prawego lub lewego przedsionka, które można wykorzystać do scharakteryzowania elektrofizjologii miocytów przedsionków w badaniach typu patch-clamp.

Izolacja miocytów przedsionkowych od dorosłych myszy

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Obecny protokół opisuje ostrą izolację żywotnych komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłego, młodocianego, larwalnego i embrionalnego danio pręgowanego (Danio rerio), nadającego się do badań elektrofizjologicznych.

Izolacja komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłych, młodocianych, larwalnych i embrionalnych danio pręgowanego do badań elektrofizjologicznych

Przedstawiamy protokół do hodowli ex vivo ludzkiej tkanki mięśnia sercowego komorowego. Pozwala na szczegółową analizę siły skurczu i kinetyki, a także zastosowanie obciążenia wstępnego i następczego w celu dokładniejszego naśladowania środowiska fizjologicznego in vivo.

Przygotowanie ludzkiej tkanki mięśnia sercowego do długotrwałej hodowli

Poznaj metodę izolacji ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem. Protokół zapewnia wysokie wydajności do 200 komórek na miligram tkanki, umożliwiając badania elektrofizjologiczne i biochemiczne mechanizmów chorób serca.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Przeglądaj więcej filmów