Name: Celowanie in vivo w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej fretki za pomocą elektroporacji in utero (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in utero do celowania w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej fretki. Technika ta umożliwia badanie ekspansji i fałdowania neokorteksu z wysoką specyficznością przestrzenną i czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni Usługom i Obiektom Instytutu Molekularnej Biologii Komórki i Genetyki im. Maxa Plancka za wyjątkowe wsparcie, w szczególności całemu zespołowi Służb Biomedycznych (BMS) za doskonałą hodowlę fretek oraz J. Peychlowi i jego zespołowi z Zakładu Mikroskopii Świetlnej. Jesteśmy szczególnie wdzięczni Katrin Reppe i Annie Pfeffer z BMS za wyjątkowe wsparcie weterynaryjne oraz Lei Xing z grupy Huttner za pomoc w operacjach fretek.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim ustawodawstwem dotyczącym dobrostanu zwierząt po zatwierdzeniu przez Landesdirektion Sachsen (licencje TVV 2/2015 i TVV 21/2017).
1. Przygotowanie do elektroporacji in utero
<ol>
	<li>Przygotuj mieszaninę DNA. W niniejszym protokole stosuje się końcowe stężenie 1 μg/μl pGFP. Rozpuść DNA w PBS i uzupełnij 0,1% Fast Green, aby ułatwić wizualizację. Po przygotowaniu wymieszaj mieszaninę DNA, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół lub stukając palcem. Przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia. 
	UWAGA: W przypadku koelektroporacji mieszaninę DNA przygotowuje się tak, aby zawierała końcowe stężenie 1 μg/μl plazmidu kodującego gen będący przedmiotem zainteresowania wraz z 0,5 μg/μL pGFP rozcieńczonego w PBS.</li>
	<li>Przygotuj stół operacyjny ze wszystkimi wymaganymi narzędziami i instrumentami.</li>
	<li>Pobrać szklane kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet. Dostosuj średnicę końcówki kapilary, odcinając dystalną część kapilary za pomocą kleszczy, jak opisano wcześniej41.</li>
</ol>
2. Przygotowanie fretek do operacji
<ol>
	<li>Trzymaj ciężarne skrzelki z zarodkami na czczo E33 przez co najmniej 3 godziny przed zabiegiem, aby zmniejszyć ryzyko wymiotów.</li>
	<li>Przed zabiegiem należy wysterylizować wszystkie narzędzia metodą autoklawowania. Operację należy wykonać w specjalnie do tego przeznaczonym pomieszczeniu w warunkach aseptycznych, aby wyeliminować potencjalne źródła zanieczyszczenia.</li>
	<li>Umieść ciężarną jill w pudełku z narkozą z 4% izofluranem.</li>
	<li>Po znieczuleniu umieść fretkę na stole operacyjnym z poduszką rozgrzewającą i przymocuj maskę narkozy ze stałym przepływem 2-3% izofluranu do nosa. Aby zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia, sprawdź, czy nie ma następujących odruchów:
	<ol>
		<li>Odruch powiekowy poprzez dotyk skóry okołogałkowej</li>
		<li>Odruch zginacza poprzez ściskanie skóry między 2. a 3. palcem lub 3. i 4. palcem obu kończyn tylnych</li>
		<li>Jeśli odruch powiekowy jest nieobecny, a odruch zginacza jest wyraźnie zmniejszony, sprawdź odruch bólowy, ściskając po jednym palcu każdej kończyny tylnej. 
		UWAGA: Upewnij się, że masz pod ręką stetoskop, aby w razie potrzeby monitorować tętno i rytm</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć fretkę podskórnie ze środkiem przeciwbólowym (0,1 ml metamizolu, 50 mg/kg masy ciała), antybiotykiem (0,1 ml/kg masy ciała z 20 mg/kg amoksycyliny + kwas klawulanowy) i glukozą (10 ml 5% roztworu glukozy).</li>
	<li>Umieść kroplę roztworu maści do oczu na oczach, aby zapobiec odwodnieniu oczu podczas zabiegu chirurgicznego.</li>
	<li>Ogol brzuch fretki za pomocą golarki.</li>
	<li>Oczyść skórę wodą z mydłem, zdezynfekuj brzuch peelingiem z 70% etanolu, zdezynfekuj 2x jodem i pozostaw do wyschnięcia.</li>
</ol>
3. Elektroporacja fretek in utero
<ol>
	<li>Upewnij się, że obszar operacyjny jest sterylny: umieść sterylne narzędzia chirurgiczne na sterylnych tkankach, zmień płaszcz i rękawice.</li>
	<li>Umieść sterylną serwetę chirurgiczną na zwierzęciu.</li>
	<li>Za pomocą skalpela chirurgicznie otwórz brzuch na kresie białym z nacięciem o długości ~5 cm.</li>
	<li>Przetnij warstwę mięśni za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Umieść waciki z gazy wokół miejsca nacięcia i zwilż je PBS. Waciki z gazy wchłoną dodatkowy PBS, który zostanie dodany podczas operacji. 
	UWAGA: Utrzymuj ciepło i wsparcie PBS przez cały czas trwania operacji.</li>
	<li>Odsłoń macicę fretki i umieść ją na wacikach z gazy.</li>
	<li>Napełnić szklaną kapilę roztworem do wstrzykiwań za pomocą pipety z długą końcówką ładującą. Upewnij się, że objętość ładunku wynosi około 5–20 μl, w zależności od liczby zarodków i liczby różnych warunków doświadczalnych. Średnia objętość wstrzykniętego zarodka wynosi 3–5 μl. Przymocuj obciążoną szklaną kapilarnę do uchwytu, a drugą stronę wsadu podłącz do rurki i ustnika.</li>
	<li>Sprawdź pierwszy zarodek i znajdź głowę.</li>
	<li>Umieść światłowodowe źródło światła obok głowy zarodka, aby ułatwić wizualizację. 
	UWAGA: Ściany macicy fretki są bardzo ciemne i trudno przez nie widzieć, chyba że światło jest świecone bezpośrednio na nie.</li>
	<li>Wykonać pojedyncze wstrzyknięcie dokomorowe do komory jednej z półkul mózgowych i utrzymać drugą półkulę w stanie nienaruszonym, aby służyła jako kontrola wewnętrzna. Sama komora nie jest łatwa do odróżnienia przez oko, więc jej lokalizację szacuje się na podstawie lokalizacji pigmentowanej tęczówki, która jest widoczna. Wstrzyknięcie dokomorowe wykonuje się poprzez pobranie uchwytu przymocowanego do szklanej naczynia włosowatej i penetrację skóry, czaszki i tkanki mózgowej końcówką szklanej naczynia włosowatego. 
	UWAGA: Upewnij się, że nie uszkodziłeś łożyska, które jest ciemniejsze niż łożysko mysie.
	<ol>
		<li>Gdy końcówka szklanej kapilary znajdzie się w komorze, wstrzyknąć około 3–5 μl roztworu do wstrzykiwań, pipetując ustnie za pomocą ustnika podłączonego do szklanego uchwytu kapilary. Ponieważ wstrzyknięty roztwór zawiera 0,1% Fast Green, wstrzyknięta komora zmieni kolor na ciemnozielony i będzie widoczna jako struktura w kształcie nerki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść elektrody pęsety na macicy nad głową zarodka tak, aby biegun dodatni znajdował się nad obszarem, który będzie celowany, a biegun ujemny poniżej obszaru wstrzykniętego.</li>
	<li>Ustaw następujące warunki elektroporacji na elektroporatorze: Długość impulsu = 50 ms; Napięcie impulsu = 100 V; Interwał impulsów = 1 s; Liczba impulsów = 5. Następnie naciśnij przycisk "Pulse" na elektroporatorze.</li>
	<li>Szybko upuść kilka kropli ciepłego 1x PBS na elektroporowany zarodek.</li>
	<li>Powtórz procedurę dla wszystkich zarodków. Utrzymuj macicę stale mokrą ciepłym PBS. 
	UWAGA: Jeśli pierwsze zarodki skierowane w stronę pochwy nie są łatwo dostępne, najlepiej nie poddawać ich elektropoturowaniu.</li>
	<li>Gdy wszystkie zarodki zostaną poddane elektroporacji, umieść macicę z powrotem w jamie otrzewnej.</li>
	<li>Zszyj warstwę mięśniową z otrzewną za pomocą szwu 4-0.</li>
	<li>Zszyj skórę o tej samej grubości i spryskaj ranę sprayem aluminiowym.</li>
	<li>Umieść zwierzę w klatce i utrzymuj je w cieple za pomocą źródła ciepła. Uważnie monitoruj zwierzę, aż się obudzi.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna i trzymanie docelowych zwierząt
<ol>
	<li>Przez 3 dni po zabiegu należy upewnić się, że zwierzęta są poddawane następującej opiece pooperacyjnej: 20 mg/kg amoksycyliny (antybiotyk) 1 raz na dobę; 25 mg/kg metamizolu (przeciwbólowego) 3 razy na dobę.</li>
	<li>Upewnij się, że fretki są trzymane indywidualnie.</li>
	<li>Upewnij się, że fretki są badane przez lekarza weterynarii co najmniej 1 raz dziennie.</li>
	<li>Upewnij się, że fretki są jak najmniej niepokojone podczas porodu.</li>
	<li>Po odsadzeniu szczeniąt od piersi lub uśmierceniu przygotuj je do histerektomii.</li>
</ol>
5. Histerektomia fretek
UWAGA: Histerektomia jest wykonywana w celu zmniejszenia liczby zwierząt składanych w ofierze, tak aby wysterylizowane zwierzęta mogły być oddane do adopcji jako zwierzęta domowe. Procedura przedoperacyjna histerektomii jest taka sama jak w kroku 2.
<ol>
	<li>Ogolić i wysterylizować brzuch fretki zgodnie z opisem w krokach 3.1 i 3.2.</li>
	<li>Chirurgicznie otwórz brzuch na kresie białej. Przetnij warstwę mięśni. Podnieś warstwę mięśniową i osłoń jelito palcem, jednocześnie całkowicie otwierając warstwę mięśniową.</li>
	<li>Umieść waciki z gazy wokół miejsca nacięcia i zwilż je sterylnym PBS. Odsłoń macicę fretki i jajniki i umieść je na wacikach z gazy.</li>
	<li>Histerektomię należy rozpocząć po jednej stronie, podwiązując tętnicę jajnika i żyłę jajnika czaszkowego do mezowaru. Umieść zacisk po każdej stronie podwiązania i wykonaj kolejne podwiązanie czaszkowe do zacisków. Przymocuj trzeci zacisk na końcach podwiązania, aby je zapisać. Powtórz po drugiej stronie.</li>
	<li>Przeciąć między zaciskami i odłączyć rogówkę macicy od krezki po obu stronach.</li>
	<li>Podwiązać tętnicę uterinę po obu stronach macicy, ogonową do ujścia macicy. Następnie podwiąż pochwę i zamocuj ligatrę. Przymocuj zacisk na końcach podwiązań, aby je zapisać. Umieść dwa zaciski czaszkowe do ligatury. Przeciąć między zaciskami i odłączyć macicę od pochwy. Usuń macicę i jajniki i wyrzuć je. Zeskrob resztki błony śluzowej z kolby macicy.</li>
	<li>Odłącz wszystkie pozostałe zaciski i skróć końce ligatury. Upewnij się, że kontrolujesz krwawienie po clamps zostały usunięte.</li>
	<li>Zszyj warstwę mięśniową i skórę zgodnie z opisem w krokach 3.16 i 3.17. Postępuj zgodnie z protokołem pooperacyjnym, jak w krokach 3.18 i 4.1–4.3. Trzymaj zwierzęta w obiekcie dla zwierząt przez co najmniej 2 tygodnie z regularnymi wizytami weterynaryjnymi. Po całkowitym wyzdrowieniu zwierzęta mogą zostać oddane do adopcji.</li>
</ol>

<ol><li>Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKalebic%2C+N+%22Evolution+of+Nervous+Systems+2e%22">Evolution of Nervous Systems 2e</a>. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neocortex%3A+a+perspective+from+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology.</a> Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).</li>
<li>Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outer+subventricular+zone+and+primate-specific+cortical+complexification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification.</a> Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).</li>
<li>Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cortex+expansion+and+folding%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned.</a> EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).</li>
<li>Molnar, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+development+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">New insights into the development of the human cerebral cortex.</a> Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).</li>
<li>Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral-based+gene+transfer+to+the+mammalian+CNS+for+functional+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies.</a> Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e239(2007).</li>
<li>Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knock-down+in+post-mitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons.</a> PLoS One. 9 (8), 105584(2014).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knockout+in+the+mouse+brain+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation.</a> Science Reports. 6, 20611(2016).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-induced+disruption+of+gene+expression+in+mouse+embryonic+brain+and+single+neural+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo.</a> EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).</li>
<li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing.</a> Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).</li>
<li>Albert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome+profiling+and+editing+of+neocortical+progenitor+cells+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development.</a> EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e236(2007).</li>
<li>Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+genetic+manipulation+of+gyrencephalic+carnivores+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation.</a> Molecular Brain. 5, 24(2012).</li>
<li>Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genetic+manipulation+of+cortical+progenitors+in+gyrencephalic+carnivores+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation.</a> Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+expansion+due+to+increased+proliferation+of+basal+progenitors+is+linked+to+changes+in+their+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology.</a> Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).</li>
<li>Martinez-Martinez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restricted+period+for+formation+of+outer+subventricular+zone+defined+by+Cdh1+and+Trnp1+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels.</a> Nature Communication. 7, 11812(2016).</li>
<li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Inner+and+Outer+Fiber+Layers+in+the+Developing+Cerebral+Cortex+of+Gyrencephalic+Ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets.</a> Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+Cerebral+Cortex+Requires+Cdk5+in+Upper-Layer+Neurons+in+Gyrencephalic+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals.</a> Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).</li>
<li>Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gyrification+of+the+cerebral+cortex+requires+FGF+signaling+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain.</a> Elife. 6, 29285(2017).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+ARHGAP11B+induces+hallmarks+of+neocortical+expansion+in+developing+ferret+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex.</a> Elife. 7, 41241(2018).</li>
<li>Masuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+analyses+of+cortical+malformation+using+gyrencephalic+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals.</a> Science Reports. 5, 15370(2015).</li>
<li>Matsumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+analyses+of+periventricular+nodular+heterotopia+using+gyrencephalic+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals.</a> Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).</li>
<li>Barnette, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+brain+development+in+the+ferret+via+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of brain development in the ferret via MRI.</a> Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).</li>
<li>Smart, I. H., McSherry, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gyrus+formation+in+the+cerebral+cortex+in+the+ferret.+I.+Description+of+the+external+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes.</a> Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).</li>
<li>Sawada, K., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cerebral+sulci+and+gyri+in+ferrets+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies+%28Kyoto%29%22%5BJournal%5D)">Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius).</a> Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).</li>
<li>Reillo, I., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+zones+in+the+developing+cerebral+cortex+of+ferret%3A+ontogeny%2C+cell+cycle+kinetics%2C+and+diversity+of+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors.</a> Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).</li>
<li>Smart, I. H., McSherry, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gyrus+formation+in+the+cerebral+cortex+of+the+ferret.+II.+Description+of+the+internal+histological+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes.</a> Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).</li>
<li>Borrell, V., Reillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+neural+stem+cells+in+cerebral+cortex+development+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution.</a> Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).</li>
<li>Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+intermediate+radial+glia+in+the+tangential+expansion+of+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).</li>
<li>Fietz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSVZ+progenitors+of+human+and+ferret+neocortex+are+epithelial-like+and+expand+by+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling.</a> Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).</li>
<li>Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the human neocortex.</a> Cell. 146 (1), 18-36 (2011).</li>
<li>Fietz, S. A., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+progenitor+expansion%2C+self-renewal+and+neurogenesis-a+polarized+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).</li>
<li>De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+domains+of+gene+expression+in+germinal+layers+distinguish+the+development+of+gyrencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly.</a> EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).</li>
<li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+investigations+of+the+brain+of+higher+mammals+using+gyrencephalic+carnivore+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosciences+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets.</a> Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).</li>
<li>Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+to+the+postnatal+ferret+cerebral+cortex+by+DNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).</li>
<li>Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+radial+migration+of+neurons+by+long-distance+somal+translocation+in+the+developing+ferret+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex.</a> Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).</li>
<li>Johnson, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspm+knockout+ferret+reveals+an+evolutionary+mechanism+governing+cerebral+cortical+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size.</a> Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).</li>
<li>Vaid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+population+of+Hopx-dependent+basal+radial+glial+cells+in+the+developing+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex.</a> Development. 145 (20), 169276(2018).</li>
<li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+progenitors+in+the+mammalian+telencephalon+includes+a+new+radial+glial+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type.</a> Nature Communications. 4, 2125(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Elektroporacja in utero u fretki jest ważną techniką, mającą zalety i wady w stosunku do innych metod. Istnieją krytyczne kroki i ograniczenia tej metody, a także potencjalne modyfikacje i przyszłe zastosowania, o których należy pamiętać.
Od czasu pionierskiej pracy Victora Borrella i współpracowników nad manipulacją genetyczną kory nowej fretki po urodzeniu za pomocą elektroporacji lub iniekcji wirusowej 35,42,43, fretka stała się genetycznie dostępnym organizmem modelowym.<...

Kora nowa jest zewnętrzną warstwą mózgu ssaków i siedzibą wyższych funkcji poznawczych1,2,3,4,5. W celu uzyskania ostrej manipulacji genetycznej w korze nowej ssaków in vivo podczas rozwoju embrionalnego, zbadano dwie różne metody: infekcja wirusowa6 i elektroporacja in utero7. Obie metody pozwalają na skuteczne celowanie w komórki kory nowej, ale mają pewne ograniczenia. Główną zaletą elektroporacji in utero w porównaniu z infekcją wirusową jest możliwość osiągnięcia specyficzności przestrzennej w obrębie kory nowej, którą osiąga się poprzez regulację kierunku pola elektrycznego.
Odkąd po raz pierwszy wykazano, że elektroporacja ułatwia wprowadzanie DNA do komórek in vitro8, została zastosowana do dostarczania DNA różnym kręgowcom in vivo. W neurobiologii rozwojowej, elektroporacja kory nowej myszy w macicy została po raz pierwszy opisana w 2001 roku9,10. Metoda ta polega na wstrzyknięciu mieszaniny DNA do bocznej komory embrionalnej mózgu, a następnie zastosowaniu pola elektrycznego za pomocą elektrod pęsetowych, co pozwala na precyzję przestrzenną7,11. Od tego czasu elektroporacja in utero jest stosowana do dostarczania kwasów nukleinowych w celu manipulowania ekspresją endogennych lub ektopowo dodanych genów w korze nowej myszy. Ostatnio poczyniono ważne postępy dzięki zastosowaniu metodologii edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 za pomocą elektroporacji in utero w korze nowej myszy w celu przeprowadzenia (1) zakłócenia genów w neuronach postmitotycznych 12,13 i neuronalnych komórek progenitorowych14, oraz (2) edycji genome15 i epigenome16.
Bardzo szybko po pierwszym raporcie u myszy, elektroporacja in utero została zastosowana do embrionalnej kory nowej szczura17,18. Nie-gryzonie pozostawały wyzwaniem do czasu pierwszego wystąpienia elektroporacji in utero fretek, małego drapieżnika, w 2012 roku19,20. Od tego czasu elektroporacja in utero fretek jest stosowana do badania mechanizmów rozwoju kory nowej poprzez znakowanie progenitorów neuronalnych i neuronów20,21,22,23, manipulując ekspresją endogennych genów, w tym wykorzystując technologię CRISPR/Cas924, oraz dostarczając geny ektopowe21,22,25, w tym geny specyficzne dla człowieka26. Co więcej, elektroporacja in utero fretek została wykorzystana do określenia cech rozwoju kory nowej człowieka w warunkach patologicznych27,28.
W kontekście rozwoju kory nowej, zalety używania fretek jako organizmu modelowego w porównaniu do myszy wynikają z faktu, że fretki lepiej odwzorowują szereg cech podobnych do ludzkich. Na poziomie anatomicznym fretki wykazują charakterystyczny wzór fałdowania kory mózgowej, który jest również obecny u ludzi i większości innych naczelnych, ale jest całkowicie nieobecny u myszy lub szczurów4,29,30,31. Na poziomie histologicznym fretki mają dwie odrębne podkomorowe strefy rozrodcze, określane jako wewnętrzna i zewnętrzna strefa podkomorowa (odpowiednio ISVZ i OSVZ)32,33, oddzielone wewnętrzną warstwą włókien23. Te cechy są również wspólne dla naczelnych, w tym ludzi, ale nie dla myszy34. ISVZ i OSVZ u fretek i ludzi są wypełnione licznymi neuronalnymi komórkami progenitorowymi, podczas gdy strefa podkomorowa (SVZ) myszy zawiera tylko nieliczne neuronalne komórki progenitorowe21,32,35,36. Na poziomie komórkowym fretki wykazują wysoki odsetek podtypu progenitorów nerwowych określanych jako podstawowy lub zewnętrzny promienisty glej (odpowiednio bRG lub oRG), które są uważane za kluczowe dla ewolucyjnej ekspansji kory nowej ssaków34,37,38. bRG są zatem bardzo obfite w płodowej korze nowej ludzkiej i embrionalnej fretki, ale są bardzo rzadkie w embrionalnej korze nowej myszy 35,36. Co więcej, bRG fretki wykazuje niejednorodność morfologiczną podobną do ludzkiej bRG, znacznie przewyższającą bRG myszy bRG21. Wreszcie, na poziomie molekularnym, rozwijająca się kora nowa fretki wykazuje wzorce ekspresji genów bardzo podobne do tych w ludzkiej korze nowej, która przypuszczalnie kontroluje między innymi rozwój fałdowania kory mózgowej39.
Biologiczne i molekularne cechy komórek bRG fretek sprawiają, że są one wysoce proliferacyjne, podobne do ludzkiego bRG. Powoduje to zwiększoną produkcję neuronów i rozwój rozszerzonej i wysoce złożonej kory nowej34. Te cechy sprawiają, że fretki są doskonałymi organizmami modelowymi do badania podobnych do ludzkich cech rozwoju kory nowej, których nie można modelować u myszy26,40. Aby w pełni wykorzystać fretkę jako organizm modelowy, opracowano prezentowaną metodę. Polega na elektroporacji in utero zarodków fretek E33 z plazmidem eksprymującym GFP (pGFP) pod kontrolą wszechobecnego promotora, CAG. Elektropostowane zarodki mogą być następnie analizowane embrionalnie lub po urodzeniu. W celu zmniejszenia liczby ofiarowanych zwierząt, samice fretek (skrzelków) są sterylizowane przez histerektomię i przekazywane do adopcji jako zwierzęta domowe. Jeśli docelowe zarodki są pobierane w stadium embrionalnym, przeprowadza się drugą operację i zarodki są usuwane przez cesarskie cięcie, podczas gdy skrzelki są poddawane histerektomii. Jeśli docelowe zarodki są analizowane w stadium postnatalnym, źlęce są histerektomizowane po odsadzeniu szczeniąt od piersi lub uśmierceniu. W związku z tym przedstawiono również protokół histerektomii skrzelów.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1ml</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>4-0 Szew Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V392ZG</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Spray</td><td>aluminiowy cp-pharma</td><td>98017</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Amoksycylina + kwas klawulanowy (Synulox RTU)</td><td>WDT</td><td>6301</td><td>Chirurgiczny</td></tr><tr><td>uchwyt na</td><td>kapsułkę WPI</td><td>MPH6S12</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>Roztwór maści dekspantenol</td><td>Bayer</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Prześcieradło chirurgiczne 45x75cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pęseta elektrodowa Hartmann 2513052 Surgery, platynowa 5mm</td><td>BTX</td><td>45-0489</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td></td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>Szybka Zielona</td><td>Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>Fretka Mustela putorius furo</td><td>Marshall</td><td>NA</td><td>Organizm eksperymentalny</td></tr><tr><td>Światłowodowe źródło światła</td><td>Olympus</td><td>KL1500LCD</td><td>Kleszcze do elektroporacji</td></tr><tr><td></td><td>Allgaier Instrumente</td><td>08-033-130</td><td>Kleszcze chirurgiczne</td></tr><tr><td>3C-SA</td> Kleszcze <td>chirurgiczne</td><td>Rubis Tech</td><td>3C-SA</td></tr><tr><td>55</td><td>Dumostar</td><td>11295-51</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Kleszcze 5-SA</td><td>Rubis Tech</td><td>5-SA</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Waciki z gazy duże</td><td>Hartmann</td><td>401723</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Waciki z gazy małe</td><td>Hartmann</td><td>401721</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Przeciwciało GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Aves labs</td><td>GFP1020</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Szklane kapspilary (szkło borokrzemianowe z żarnikiem, OD: 1,2 mm, ID: 0,69 mm, długość 10 cm)</td> <td>Sutter Instrument</td><td>BF120-69-10</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Bela-pharm</td><td>K4011-02</td><td>Chirurgiczna</td></tr><tr><td>poduszka grzewcza</td><td>Hans Dinslage</td><td>Sanitas SHK18</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Jod (roztwór betadyny 100 mg / ml)</td> <td>Meda</td><td></td><td>997437 Surgery</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>CP</td><td>21311</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Końcówki ładowania 20 i mikro; l</td><td>Eppendorf</td><td>#5242 956.003</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>Metamizol</td><td>WDT</td><td>99012</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne Metzenbaum</td><td>Aesculap</td><td>BC600R</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Instrument Sutter</td><td>Model P-97</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>pCAGGS-GFP</td><td>NA</td><td></td><td>Z Kalebic i wsp., eLife, 2018</td></tr><tr><td>Przeciwciało PCNA</td><td>Przeciwciało Millipore</td><td>CBL407</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pH3</td><td>Abcam</td><td>ab10543</td><td>Skalpel przeciwciał</td></tr><tr><td></td><td>Aesculap</td><td>294200104</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Golarka</td><td>Braun</td><td>EP100</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Przeciwciało Sox2</td><td>Systemy R + D</td><td>AF2018</td> Zacisk chirurgiczny <td>przeciwciała</td></tr><tr><td>13 cm</td><td>WDT</td><td>27080</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Podwójna łyżka chirurgiczna (Williger)</td><td>WDT</td><td>27232</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Serweta chirurgiczna</td><td>WDT</td><td>28800</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne małe</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę do szycia</td><td>Aesculap</td><td>BM149R</td><td>Chirurgia Przeciwciało</td></tr><tr><td>Tbr2</td><td>Abcam</td><td>ab23345</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta do przenoszenia przeciwciał 3ml</td><td>Fischer 13439108 naukowy</td><td></td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Julabo</td><td>TW2</td><td>Surgery</td></tr></tbody></table>

celowanie in vivo w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej fretki za pomocą elektroporacji in utero

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulowanie ekspresją genów in vivo podczas rozwoju embrionalnego jest metodą z wyboru przy analizie roli poszczególnych genów podczas rozwoju ssaków. Elektroporacja in utero jest kluczową techniką manipulacji ekspresją genów w embrionalnym mózgu ssaków in vivo. Przedstawiono tutaj protokół elektroporacji in utero embrionalnej kory nowej fretek, małego mięsożercy. Fretka jest coraz częściej wykorzystywana jako model rozwoju kory nowej, ponieważ jej kora nowa wykazuje szereg cech anatomicznych, histologicznych, komórkowych i molekularnych, które są również obecne u naczelnych i innych niż ludzie, ale nieobecne w modelach gryzoni, takich jak myszy lub szczury. Elektroporację in utero przeprowadzono w 33 dniu embrionalnym (E), w środkowym stadium neurogenezy u fretki. Elektroporacja in utero jest ukierunkowana na neuronalne komórki progenitorowe wyściełające boczne komory mózgu. Podczas neurogenezy te komórki progenitorowe dają początek wszystkim innym typom komórek nerwowych. Praca ta przedstawia reprezentatywne wyniki i analizy w E37, dniu po urodzeniu (P) 1 i P16, odpowiadające odpowiednio 4, 9 i 24 dni po elektroporacji in utero. Na wcześniejszych etapach potomstwo docelowych komórek składa się głównie z różnych podtypów progenitorów nerwowych, podczas gdy na późniejszych etapach większość znakowanych komórek to neurony postmitotyczne. Tak więc elektroporacja in utero umożliwia badanie wpływu manipulacji genetycznej na cechy komórkowe i molekularne różnych typów komórek nerwowych. Ze względu na swój wpływ na różne populacje komórek, elektroporacja in utero może być również stosowana do manipulacji cechami histologicznymi i anatomicznymi kory nowej fretki. Co ważne, wszystkie te efekty są dotkliwe i wykonywane są ze specyficznością czasoprzestrzenną określoną przez użytkownika.

Elektroporacja in utero fretkek w dniu E33 doprowadziła do ukierunkowania na komórki progenitorowe neuronów wyścielające powierzchnię komorową embrionalnej nowokory (Rysunek 1). Komórki te nazywane są progenitorami apikalnymi i wykazują wysoką zdolność do proliferacji, dając początek wszystkim innym typom komórek podczas rozwoju. W wyniku podziału asymetrycznego progenitory apikalne generowały kolejny progenitor apikalny oraz komórkę bardziej zróżnicowaną, zazwyczaj progenitor bazalny (BP), ...

Prezentowany tutaj jest protokół do przeprowadzenia manipulacji genetycznej w mózgu fretki embrionalnej za pomocą elektroporacji in utero. Metoda ta pozwala na celowanie w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej in vivo.

Celowanie in vivo w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej fretki za pomocą elektroporacji in utero

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Protokół ten pozwala nam na przeprowadzenie manipulacji genetycznej in vivo w kluczowym modelu zwierzęcym, który pozwala nam badać rozszerzanie się i fałdowanie rozwijającej się kory nowej. Główną zaletą tej metody jest wykorzystanie wysokiej specyficzności przestrzennej i czasowej w celowaniu w te nerwowe komórki macierzyste, które są kluczowym typem komórek dla rozwoju mózgu. Przed rozpoczęciem zabiegu należy naciągnąć szklane naczynia włosowate na ściągacz do mikropipet i za pomocą kleszczyków odciąć dystalną część kapilary, aby wyregulować średnicę końcówki kapilary.W 33 dniu embrionalnym dodaj odpowiednie stężenie DNA w PBS, uzupełnione 0,1%Fast Green z delikatnym mieszaniem i umieść 3-godzinną, znieczuloną, ciężarną samicę fretki na stole operacyjnym z poduszką rozgrzewającą. Potwierdź odpowiedni poziom sedacji, dotykając skóry okołogałkowej i ściskając skórę między drugim a trzecim lub trzecim i czwartym palcem obu kończyn tylnych. Izofluran może powodować działania niepożądane, w tym nudności i zawroty głowy.Podczas obchodzenia się z izofluranem w postaci płynnej należy stosować wyposażenie ochronne. Podczas zabiegu należy użyć odpowiednich kanistrów do wychwytywania gazu.

in-vivo-targeting-neural-progenitor-cells-ferret-neocortex-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wewnątrzmaciczna iniekcja in vivo oraz elektroporacja nowokory embrionalnego szczura stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi...

Wewnątrzkomorowe wstrzykiwanie i elektroporacja in utero embrionów szczura w 16. dniu rozwoju (E16)

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Powierzchnia pial to unikalna strefa progenitorowa w OUN, której poświęca się coraz więcej uwagi.  W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy metodę szybkiej manipulacji genetycznej tej strefy progenitorowej przy użyciu zmodyfikowanej metody elektroporacji.  Procedura ta może być stosowana do badań komórkowych i molekularnych linii komórkowych i szlaków sygnałowych zaangażowanych w różnicowanie komórek oraz do wyjaśnienia losów i właściwości komórek potomnych.

Elektroporacja powierzchni pialu noworodków

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Tutaj prezentujemy ostrą manipulację genetyczną pokrojonych ludzkich organoidów korowych za pomocą elektroporacji. Te korowe modele organoidów są szczególnie podatne na wstrzykiwanie, ponieważ struktury podobne do komór można łatwo zidentyfikować po pokrojeniu, co umożliwia funkcjonalne badanie rozwoju kory mózgowej człowieka, zaburzeń neurorozwojowych i ewolucji kory mózgowej.

Elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów

Poznaj metodę elektroporacji in utero do celowania w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej fretki. Technika ta umożliwia badanie ekspansji i fałdowania neokorteksu z wysoką specyficznością przestrzenną i czasową.

Celowanie in vivo w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej fretki za pomocą elektroporacji in utero

Przeglądaj więcej filmów