Name: Okołodobowe porywanie Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj metodę synchronizacji Drosophila melanogaster do rytmów okołodobowych w badaniach chronobiologicznych. Technika ta umożliwia analizę białek okresu i zachowań cyrkadianalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Specjalne podziękowania dla University of Missouri-Kansas City i laboratorium Jeffreya L. Price'a.

1. Produkcja żywności dla much
<ol>
	<li>Na każdy 1 l wody przygotuj pokarm na muchy składający się z 4,69 g suszonej melasy, 19,70 g suchych aktywnych drożdży, 87,22 g mączki kukurydzianej i 7,83 g agaru.</li>
	<li>Połącz powyższą zawartość w garnku i zmniejsz ogień do 250 °F. Dobrze wymieszaj, gdy dodasz składniki.</li>
	<li>Trzymaj pokrywkę na garnku, ponieważ pokarm na muchy się nagrzewa, jednocześnie mieszając zawartość co 10 minut, aż osiągnie wrzenie. Pozwól wrzeć przez 20 minut przed wyłączeniem ognia.</li>
	<li>Dodaj 83,60 ml wody i zdejmuj pokrywkę garnka, gdy jedzenie ostygnie.</li>
	<li>Mieszaj i rejestruj temperaturę żywności co 10 minut za pomocą szklanego termometru. Nie pozwól, aby warstwa filmu osiadła na wierzchu żywności.</li>
	<li>Gdy żywność ostygnie do 60 °C, dodać 10,44 ml Tegosept i 5,51 ml kwasu propionowego na litr dodanej wody (patrz krok 1.1).</li>
	<li>Dobrze wymieszaj i podgrzej do 60 °C, aby potrawa nie stała się zbyt chłodna.</li>
	<li>W razie potrzeby pompuj pokarm na muchy za pomocą wypełniacza Droso.</li>
	<li>W przypadku wąskich fiolek pompuj 10 ml, a w przypadku butelek o kwadratowym dnie 60 ml.</li>
</ol>
2. Zbieranie much w określonym wieku
<ol>
	<li>Monitoruj butelki much dzikich przechowywanych w temperaturze 25 °C przez 5-7 dni, aż duże ilości poczwarek (około 200 poczwarek) zostaną przyczepione do boku butelki. Użyte butelki to butelki magazynowe Drosophila o pojemności 6 uncji z kwadratowym dnem.</li>
	<li>Usuń istniejące dorosłe osobniki z butelki. Wrzuć dorosłe osoby do nowej butelki lub umieść je w 70% etanolu. Użyj końca pędzla #0, aby wepchnąć pozostałe dorosłe osobniki do pokarmu dla much. Pamiętaj, aby przetrzeć pędzel 70% etanolem przed i po użyciu.</li>
	<li>Oczyszczone butelki należy pozostawić na 3 dni w inkubatorze w temperaturze 25 °C, aby umożliwić zamknięcie następnego pokolenia. Te muchy będą miały od 0 do 3 dni.</li>
</ol>
3. Separacja much
<ol>
	<li>Po 3 dniach oddziel samce od samic i zbierz żądaną liczbę dla każdej płci dla każdego z czterech punktów czasowych. Muchy można odróżnić według płci, badając genitalia; Samce mają ciemno zaokrąglone genitalia, podczas gdy samice mają jaśniejsze, bardziej spiczaste genitalia. Samice są również znacznie większe niż samce much.
	<ol>
		<li>Użyj podkładki anestezjologicznej CO2 , aby skutecznie oddzielić muchy i rozróżnić płcie. Poruszaj muchami za pomocą pędzli, aby uniknąć ich zabicia.</li>
		<li>Zbierz 100 samców i 100 samic za każdy punkt czasowy, po 50 samców w fiolce i 100 samic w fiolce. Samce są zwykle bardziej agresywne, a ich interakcje społeczne prowadzą do wielu zgonów, gdy w fiolce znajduje się 100 osobników. Samice - do 100 osobników - pozostają nienaruszone, gdy są przechowywane w fiolce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj zbiórki w następujących punktach czasowych: ZT1, ZT7, ZT13 i ZT19 (Tabela 1). Należy pamiętać, że kolekcje wykonywane w ciemności (ZT12-ZT24) są wrażliwe na światło, podczas gdy kolekcje ZT0-ZT11 są wykonywane w godzinach świecenia, a światła w pomieszczeniu mogą być włączone. Należy pamiętać, że używane są dwa oddzielne inkubatory z odwróconym 12-godzinnym wzorcem światła, aby umożliwić wszystkie pobrania w ciągu dnia, a nie w nocy.</li>
	<li>Wykorzystaj nadmiar much do stworzenia nowych butelek much do przyszłego porwania. Umieścić 25 samic z 5-7 samcami w każdej nowej butelce i umieścić w inkubatorze w temperaturze 25 °C.</li>
</ol>
4. Inkubacja much
<ol>
	<li>Pozwól muchom pozostać w inkubatorach regulowanych światłem przez 3-5 dni, aby umożliwić porywanie okołodobowe. Upewnij się, że inkubatory są szczelne, ponieważ nawet niewielkie zanieczyszczenie światłem zakłóci porywanie.</li>
</ol>
5. Utrwalenie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Po porywaniu należy przygotować nowe fiolki z roztworem utrwalającym dla próbek, które zostaną użyte do immunofluorescencji. Przed usunięciem muszek z inkubatora dodaj 4,8 ml 4% formaldehydu rozcieńczonego w 1x PBS + 0,1% Tween-20 do każdej nowej wąskiej fiolki na każde 100 much, które mają być utrwalone. Każda fiolka pomieści 100 samców lub 100 samic much okołodobowych. Umieścić wąskie fiolki w lodzie.</li>
</ol>
6. Zbieranie immunofluorescencji
<ol>
	<li>Podczas zbierania much z inkubatora w celu immunofluorescencji zdejmij nakrętkę butelki i szybko odwróć butelkę do lejka. Delikatnie wklepać muchy w roztwór przez lejek, aby pomóc wprowadzić muchy do fiolki; Połączyć dwie probówki z 50 samców, co daje w sumie 100 samców w jednej fiolce i użyć jednej probówki ze 100 samicami w drugiej fiolce.</li>
	<li>Wykonuj kolekcje ZT13 i ZT19 w ciemności; użyj czerwonego światła, aby zobaczyć, ponieważ Drosophila są znacznie mniej wrażliwe na te długości fal świetlnych, a zatem są mniej podatne na zanieczyszczenie światłem13. W szczególności białko kryptochromu jest szczególnie wrażliwe na światło niebieskie, którego należy unikać14.
	<ol>
		<li>Aby zmniejszyć ekspozycję na światło, upewnij się, że pomieszczenie, w którym odbywa się zbiórka, jest szczelnie oświetlone, a wszelkie źródła światła są zasłonięte lub zasłonięte. Owinąć te fiolki w folię, tak aby muchy ZT13 i ZT19 nie były wystawione na działanie światła po umieszczeniu na mieszalniku nutacyjnym w następnym kroku. Muchy ZT1 i ZT7 nie są wrażliwe na światło i można je umieszczać na mieszalniku bez pokrycia folią.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Mieszalnik nutujący i magazyn
<ol>
	<li>Po zebraniu much, aby uniknąć rozlania, należy zakleić taśmą górną część fiolek zawierających utrwalacz i umieścić je w mieszalniku nutującym z prędkością 165 obr./min w temperaturze 4 °C na 4 godziny. Muchy nie są już wrażliwe na światło po tym etapie fiksacji, więc folię można usunąć, aby sprawdzić, czy roztwór się porusza i muchy są zanurzane w utrwalaczu.</li>
	<li>Po wyjęciu fiolek zawierających muchę z mieszalnika nutacyjnego usunąć formaldehyd i przemyć trzykrotnie 3 000 μl 1x PBS, odwracając fiolkę przy każdym płukaniu.</li>
	<li>Przechowywać fiolki z próbkami immunofluorescencyjnymi w temperaturze 4 °C w oczekiwaniu na przyszłą immunofluorescencję15.</li>
</ol>
8. Kolekcja do ekstrakcji białka
<ol>
	<li>Przygotować cztery probówki o pojemności 50 ml i dewar zawierający ciekły azot w celu zakonserwowania próbek do ekstrakcji białek</li>
	<li>W celu zebrania much do ekstrakcji białka lub kwasu nukleinowego, przenieś muchy z butelek do probówki w taki sam sposób, jak w kroku 6.1 i szybko zakryj probówkę, aby zapobiec wypuszczeniu much, a następnie umieść probówkę w ciekłym azocie w celu szybkiego zamrożenia.</li>
</ol>
9. Przechowywanie do ekstrakcji białka
<ol>
	<li>Przechowywać zamrożone próbki do ekstrakcji białek w temperaturze -80 °C. Mogą one być przetwarzane zgodnie z protokołem ekstrakcji białek odpowiednim do dalszej analizy, w tym immunoblottingu16.</li>
</ol>

<ol><li>Halberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+physiological+and+clinical+aspects+of+24-hour+periodicity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal-Lancet%22%5BJournal%5D)">Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity.</a> The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).</li>
<li>Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+to+remember%3A+the+role+of+circadian+clocks+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory.</a> Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).</li>
<li>Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+circadian+rhythms+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases.</a> The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).</li>
<li>Hood, S., Amir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+the+Circadian+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and the Circadian Clock.</a> Frontiers in aging Neuroscience. 9, 170(2017).</li>
<li>Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Circadian+Clock+and+Cancer%3A+New+Frontiers+for+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment.</a> Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).</li>
<li>Zehring, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-element+transformation+with+period+locus+DNA+restores+rhythmicity+to+mutant%2C+arrhythmic+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster.</a> Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).</li>
<li>Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+circadian+behavioural+rhythms+by+gene+transfer+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila.</a> Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).</li>
<li>Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+period+gene+product+of+Drosophila+reveal+diverse+tissue+distribution+and+rhythmic+changes+in+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system.</a> Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).</li>
<li>Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+of+the+Drosophila+period+gene+product+on+circadian+cycling+of+its+messenger+RNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels.</a> Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+period+gene+encodes+a+predominantly+nuclear+protein+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).</li>
<li>Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+in+nuclear+localization+of+period+protein+by+a+second+clock+mutation%2C+timeless%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless.</a> Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).</li>
<li>Price, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((double-time+is+a+novel+Drosophila+clock+gene+that+regulates+period+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation.</a> Cell. 94 (1), 83-95 (1998).</li>
<li>Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+entrainment+to+red+light+in+Drosophila%3A+requirement+of+Rhodopsin+1+and+Rhodopsin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6.</a> Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).</li>
<li>Vinayak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exquisite+light+sensitivity+of+Drosophila+melanogaster+cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome.</a> PLoS Genetics. 9 (7), e1003615(2013).</li>
<li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Immunofluorescent+Staining+of+Mushroom+Body+and+Photoreceptor+Neurons+in+Adult+Drosophila+melanogaster+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56174(2017).</li>
<li>Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).</li>
<li>Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+the+Drosophila+circadian+clock%3A+more+heat+than+light%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+signal+Transduction+Knowledge+Environment%22%5BJournal%5D)">Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light.</a> Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65(2007).</li>
<li>Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separate+sets+of+cerebral+clock+neurons+are+responsible+for+light+and+temperature+entrainment+of+Drosophila+circadian+locomotor+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).</li>
<li>Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+phosphorylation+of+the+Drosophila+period+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).</li>
<li>Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroarchitecture+of+the+circadian+clock+in+the+brain+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster.</a> Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).</li>
<li>Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+for+clock+mutants+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genetic screens for clock mutants in Drosophila.</a> Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).</li>
</ol>

Naukowcy wykorzystują ten protokół porywania z powodzeniem i konsekwentnie. Procedura ta pozwala na utrwalenie dużej puli próbek, która może być przechowywana do przyszłej analizy. Ponadto strategia ta zachowuje wzorce neurologiczne wywołane porwaniem do przyszłych badań.
Utrwalanie do przechowywania jest głównym elementem procesu porywania, ponieważ pomaga ustabilizować tkankę mózgową i daje więcej czasu na analizę każdego mózgu z puli danych, minimalizując w ten sposób marnotrawstwo z mózgów, które tracą żywotność z powodu21 roku życia. Głównym celem jest porwanie okołodobowo jak największej liczby much, tak aby dostępna była ciągła inwentaryzacja do wycięcia głowy i ostatecznie immunofluorescencji lub ekstrakcji białek w celu obserwacji wyników i określenia, czy wyniki są wysoce wiarygodne. Aby zapewnić utrzymanie porywania okołodobowego poprzez fiksację, konieczne jest wyeliminowanie wszelkich źródeł zanieczyszczenia światłem. Proces utrwalania pozwala na przechowywanie Drosophila przy zachowaniu jego neurologicznego "znacznika czasu", dzięki czemu można je później wypreparować i przeanalizować bez zauważalnych różnic w stosunku do much, które są preparowane i przeszły immunofluorescencję natychmiast po porwaniu. W celu utrwalenia przed immunofluorescencją laboratorium ustaliło z konsekwencją, że muchy są zdolne do życia co najmniej do 1 miesiąca. Fiksacje do ekstrakcji białka western blot sprawiają, że mózgi są zdolne do życia w nieskończoność, gdy są przechowywane w temperaturze -80 °C.
Kolejnym krytycznym krokiem protokołu jest określenie płci much. Ważne jest, aby ten krok został wykonany dokładnie, ponieważ posiadanie obu płci w tej samej fiolce przed fiksacją może prowadzić do krycia, co da nowe muchy w młodszym wieku i zniekształci analizę białek, jeśli samce zostaną przypadkowo zbadane zamiast samic lub odwrotnie. Dodatkowo podczas określania płci ważne jest, aby usunąć okazy larw, które czasami są przyczepione do samic. Zapobiega to rozwojowi nowego potomstwa wewnątrz żeńskiej fiolki, które mogłoby potencjalnie zniekształcić wyniki.
Następnym krokiem dla protokołu porywania mogą być elementy związane z analizą danych. Protokół koncentruje się na lokalizacji białek, ale jeśli istnieją inne zmienne, na które wpływa porywanie okołodobowe, muszą one zostać zbadane nowymi drogami, często wymagającymi ekstrakcji białek lub kwasów nukleinowych. Ponadto istnieją inne białka mózgu, które mogą być nadal analizowane za pomocą tego protokołu. Eksperymenty związane z protokołem analizowały pewne białka, ale lista genów i białek, które odgrywają rolę w biologii okołodobowej, nie została wyczerpana. Protokół jest skuteczny w osiąganiu celu, jakim jest ustalenie rytmu okołodobowego, jednak zastosowania są szerokie.

Prawie wszystkie organizmy na Ziemi, od największych do jednokomórkowych, mają wewnętrzny zegar biologiczny z cyklem około jednego dnia. Jest to znane jako rytm okołodobowy (ukuty w 1953 roku przez Franza Halberga od łacińskich terminów circa = około/w przybliżeniu i "umiera" = dzień)1. Chociaż składniki zegara rdzeniowego są znane, a ich podstawowe mechanizmy działania skonceptualizowane, wciąż jest wiele do zrozumienia na temat tego, w jaki sposób rytmy biologiczne są utrzymywane w całym ciele. Co ważne, nieprawidłowa regulacja rytmów biologicznych wiąże się ze złymi wynikami zdrowotnymi, w tym słabym tworzeniem pamięci, zaburzeniami snu, zaburzeniami afektywnymi sezonowymi, depresją, chorobą afektywną dwubiegunową, cukrzycą, otyłością, neurodegeneracją i rakiem2,3,4,5.
Drosophila to sprawdzony model do badania biologii okołodobowej. Genetycznie i biochemicznie podatne, duże liczby są łatwe do porwania (jak zostanie pokazane). W rzeczywistości wszystkie siedem publikacji wymienianych jako kluczowe publikacje wspierające przyznanie Nagrody Nobla za odkrycie rytmów okołodobowych wykorzystało te mocne strony modelu Drosophila6,7,8,9,10,11,12.
Dodatkowo, pokazujemy skuteczne strategie zbierania porwanych much w celu analizy opartej na immunofluorescencji, kwasach nukleinowych lub ekstrakcji białek. Korzystając z tych strategii, można przetwarzać i przechowywać większe ilości próbek do analizy w przyszłości. Metody te są bardzo korzystne, ponieważ są powtarzalne i mogą dać setki porwanych much, które mogą być częścią dużej puli danych.

<table><tbody><tr><td>Pipeta 100-1000uL</td><td>Eppendorf</td><td>ES-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 10-100uL</td><td>Eppendorf</td><td>ES-100</td><td></td></tr><tr><td>16% roztwór paraformaldehydu</td><td>15710</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL01-6X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423500</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do podłączenia filtra anestezjologicznego</td><td>Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>EZ-251A</td><td></td></tr><tr><td>Mączka kukurydziana</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-100</td><td></td></tr><tr><td>Suszona melasa</td><td>Food Service Bezpośrednia</td><td>OT280504</td><td></td></tr><tr><td>Pompa spożywcza z wypełniaczem Droso</td><td>geneseesci.com</td><td>59-169</td><td></td></tr><tr><td>Butelki Drosophila, 6 uncji kwadratowego dna z Flugs</td><td>geneseesci.com</td><td>32-130BF</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki Drosophila, wąska żywica K super bulk</td><td>geneseesci.com</td><td>32-118SB</td><td></td></tr><tr><td>Suche aktywne drożdże</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15720</td><td></td></tr><tr><td>EZ Podstawowy system anestezjologiczny</td><td>World Precision Instruments</td><td>EZ-175</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Probówki wirówkowe</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon z okrągłym dnem</td><td>Corning</td><td></td><td></td>352057</tr><tr><td>Marker Sharpie z drobną końcówką</td><td>Sharpie</td><td>30001</td><td></td></tr><tr><td>Mikser nutowy Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>Flugs-wąskie plastikowe fiolki</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>Szklany termometr</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-08008-12</td><td></td></tr><tr><td>Wąż do ciekłego azotu</td><td>Thermo Scientific</td><td>398202</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik ciekłego azotu-Dewar</td><td>Cooper Surgical Inc</td><td>900109-1</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do przenoszenia ciekłego azotu</td><td>Nauki o mirkoskopii elektronowej</td><td>61891-02</td><td></td></tr><tr><td>Pędzle malarskie (czerwony sobol) Rozmiar #0</td><td>Electro Microscopy Sciences</td><td>66100-00</td><td>Służy do oddzielania much poprzez seks bez powodowania obrażeń.</td></tr><tr><td>Lejek z tworzywa sztucznego</td><td>Plews i Edelmann</td><td>570-75-062</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop światła polaryzacyjnego</td><td>Mikroskop 1100100402241</td><td></td><td>centralny Służy do wyraźniejszego oglądania Drosophila podczas seksu</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet ProPette</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-100U</td><td></td></tr><tr><td>ProPette Końcówki do pipet</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-1M</td><td></td></tr><tr><td>ProPette Końcówki do pipet</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-5M</td><td></td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1386-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kulki ze sztucznego jedwabiu</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-100</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds wrap standardowa folia aluminiowa</td><td>Zszywki</td><td>1381273</td><td></td></tr><tr><td>piekarnik do pieczenia (garnek)</td><td>Hamilton Beach</td><td>32950</td><td></td></tr><tr><td>Scotch 810 Magiczna taśma</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>77300</td><td></td></tr><tr><td>Butelka z rozpylaczem ze spustem</td><td>US Plastic</td><td>66446</td><td>Służy do rozpylania etanolu do czyszczenia obszarów zgięć roboczych</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Termo Scientific Inkubator Drosophila</td><td>Thermo Scientific</td><td>3990FL</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Revco 4 stopnie Lodówka laboratoryjna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REL7504D</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Revco Lab Zamrażarka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REL7504A</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Anatrace</td><td>T1003-1-GA</td><td></td></tr></tbody></table>

okołodobowe porywanie drosophila melanogaster

Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

Prawie uniwersalny wśród organizmów, rytmy okołodobowe koordynują aktywność biologiczną z orbitą Ziemi wokół Słońca. Aby zidentyfikować czynniki tworzące ten rytm i zrozumieć wynikające z niego wyniki, konieczne jest porywanie organizmów modelowych do określonych punktów czasowych okołodobowych. Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę nakłaniania wielu Drosophila do określonego rytmu okołodobowego. Ponadto szczegółowo opisujemy etapy po porywaniu w celu przygotowania próbek do analizy opartej na immunofluorescencji, kwasach nukleinowych lub ekstrakcji białek.

Kontrolowana synchronizacja rytmu okołodobowego pozwala badaczom na analizę biologii w określonych punktach czasowych w ciągu doby okołodobowej, korzystając z harmonogramów ZT1-ZT19 lub dodając punkty czasowe według potrzeb. W niniejszej procedurze wykorzystujemy światło i ciemność do synchronizacji much z cyklami okołodobowymi, a poprawność synchronizacji weryfikujemy za pomocą immunoblottingu oraz analizy immunofluorescencyjnej białka period, które służy jako marker synchronizacji okołodobowej (Rysunek 1). Po prawidłowej synchronizacji białka period powinny wykazywać charakterystyczny wzorzec intensywności i mobilności (Rysunek 1A) oraz być widoczne w określonych obszarach mózgu w punkcie ZT1 (Rysunek 1B). Choć inne zmienne, w tym pokarm i temperatura, mogą wpływać na synchronizację okołodobową, światło jest najprostszym i najskuteczniejszym czynnikiem do kontroli17. Na potrzeby opisanych metod temperatury w inkubatorach pozostają stałe, co pozwala polegać na neuronalnych zegarach mózgowych, których synchronizacja jest sterowana przez światło18.
<img alt="Immunoblot anty-Per pokazujący ekspresję Per w różnych ZT, przekroje mózgu, schemat projekcji komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61176/61176fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Weryfikacja synchronizacji. (A) Analiza immunoblottingowa ekstraktów z całych komórek przygotowanych z głów zsynchronizowanych much wykazuje kanoniczne wzorce mobilności i intensywności białka period19. Głowy samic 1.4 z każdego z indicated Zeitgeber times (ZT) zostały przeanalizowane z użyciem przeciwciała anty-Per. (B) Immunofluorescencja zsynchronizowanych mózgów pobranych w ZT, gdzie białko Period występuje w charakterystycznym wzorcu (dolne panele, odtworzone z Helfrich-Forster20). Przedstawiono obrazy wykonane z różnych przekrojów mózgu, obejmujące wszystkie neurony, w których spodziewano się obecności białka Period w ZT1. Pasek skali wynosi 40 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61176/61176fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ZT1</td>
			<td>ZT7</td>
			<td>ZT13</td>
			<td>ZT19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oświetlenie w godzinach 10:00 – 22:00</td>
			<td>Światło w godzinach 10:00 – 22:00</td>
			<td>Ciemno między godziną 9:00 a 21:00</td>
			<td>Ciemno między godziną 9:00 a 21:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrało się o godzinie 11:00 po 1 godzinie ekspozycji na światło</td>
			<td>Zebrano o godzinie 17:00 po 7 godzinach ekspozycji na światło</td>
			<td>Pobrane o godzinie 10:00 po 1 godzinie w ciemności</td>
			<td>Zebrane o godzinie 16:00 po 7 godzinach w ciemności</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Harmonogramy czasowe rytmu okołodobowego ZT1-ZT19.

Tutaj szczegółowo opisujemy, jak zsynchronizować Drosophila z dniem okołodobowym. Jest to pierwszy i najważniejszy krok niezbędny do badania rytmów biologicznych i chronobiologii.

Okołodobowe porywanie Drosophila melanogaster

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this ...

Synchronizacja Drosophila w celu zdefiniowania czasu okołodobowego jest pierwszym krokiem w badaniu zdarzeń, które kontrolują lub reagują na zegar biologiczny. Synchronizacja wszystkich modeli będzie przebiegać zgodnie z tym samym podstawowym podejściem. Istnieje wiele kroków, aby zrobić to praktycznie, a zebranie ich wszystkich razem może wydawać się przytłaczające.Spodziewaj się, że spróbujesz kilka razy, zanim poczujesz się naturalnie. Utrzymuj stabilną temperaturę i chcę, aby światło zgasło w trzyminutowych krokach. Przygotuj pokarm na muchy w garnku w temperaturze 121 stopni Celsjusza, mieszając w miarę dodawania składników.Przykryj garnek i doprowadź zawartość do wrzenia, mieszając zawartość co 10 minut. Po 20 minutach gotowania wyłącz ogień i dodaj 83,6 mililitra wody do garnka. Pozostaw pokrywkę zdjętą, gdy żywność ostygnie.Gdy jedzenie stygnie, mieszaj je co 10 minut, aby nie dopuścić do powstania filmu na wierzchu. Mierz również temperaturę co 10 minut za pomocą szklanego termometru. Gdy żywność ostygnie do temperatury poniżej 60 stopni Celsjusza, dodaj Tegosept i kwas propionowy, zgodnie z opisem w manuskrypcie.Dobrze wymieszaj i dostosuj garnek, aby utrzymać temperaturę, zaledwie kilka stopni poniżej 60 stopni Celsjusza. Użyj pompy perystaltycznej, aby rozprowadzić pokarm dla much. W przypadku wąskich fiolek pompuj 10 mililitrów, a w przypadku butelek o kwadratowym dnie o pojemności sześciu uncji pompuj 60 mililitrów.Muchy typu dzikiego należy przechowywać w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 10 do 12 dni, aż około 200 poczwarek zostanie przyczepionych do wnętrza butelki. Aby wyjąć dorosłe osobniki z butelki, wrzuć je do nowej butelki i użyj końca pędzla z numerem zero, aby wepchnąć pozostałe dorosłe osobniki. Przetrzyj pędzel 70% etanolem przed i po użyciu.Wysiaduj poczwarki w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby umożliwić pojawienie się następnego pokolenia. Po trzech dniach muchy będą miały od zera do trzech dni. Pamiętaj, że temperatura, światło, a nawet wybór jedzenia będą miały wpływ na porywanie.Pamiętaj, aby zachować je, każdą kontrolę podczas eksperymentu. W wyznaczonych punktach czasowych do pobrania użyj podkładki anestezjologicznej z dwutlenkiem węgla, aby unieruchomić muchy i zbierz 100 samców i 100 samic. Samice much są znacznie większe niż samce.Muchy można również rozróżnić, badając genitalia. Samce mają ciemno zaokrąglone genitalia, podczas gdy samice mają jaśniejsze, bardziej spiczaste genitalia. Umieścić samce i samice w oddzielnych fiolkach po 100 samic w fiolce i 50 samców w fiolce.Męskie interakcje społeczne prowadzą do wielu zgonów, gdy w fiolce znajduje się 100 osobników. Aby umożliwić porywanie okołodobowe, należy umieścić fiolki w inkubatorach o regulowanym oświetleniu na trzy do pięciu dni. Aby wyprodukować muchy do przyszłego porwania, umieść 25 pozostałych samic i pięć do siedmiu pozostałych samców w nowej butelce.Inkubuj butelkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Za każde 100 much, które zostaną zebrane. Przygotuj wąską fiolkę, dodając 4,8 mililitra utrwalacza.Umieść wąskie fiolki w wiadrze z lodem i zabierz wiadro, ręczniki papierowe, folię i taśmę do inkubatora. Aby zebrać muchy, umieść lejek w wąskiej fiolce, a następnie zdejmij nakrętkę z fiolki z muchami i szybko odwróć ją do lejka. Delikatnie wklep, aby pomóc wprowadzić muchy do fiolki z utrwalaczem.Podczas zbierania samców połącz dwie fiolki z 50 muchami w jedną wąską fiolkę. Owinąć fiolki do ZT13 i ZT19 w folię. Po przeniesieniu much przyklej nakrętki taśmą, aby uniknąć rozlania.Umieść fiolki na mieszalniku nutacyjnym przy 165 obr./min i czterech stopniach Celsjusza na cztery godziny. Muchy nie są już wrażliwe na światło, więc folię można usunąć, aby sprawdzić, czy muchy są zanurzone w utrwalaczu. Po wyjęciu fiolek z miksera nutacyjnego usuń formaldehyd, a następnie umyj muchy trzy razy 3000 mikrolitrów 1X PBS, odwracając fiolkę podczas każdego mycia.Przechowywać fiolki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby poczekać na przyszłą immunofluorescencję. Światło i ciemność zostały wykorzystane do nakłonienia much do cykli okołodobowych. Porywanie zweryfikowano za pomocą immunoblottingu i analizy immunofluorescencyjnej białka miesiączkowego, markera porywania okołodobowego.Immunoblotting ekstraktów z całych komórek, przygotowanych z głów porwanych muszek, pokazuje kanoniczny wzorzec ruchliwości i intensywności białek menstruacyjnych. Immunofluorescencja porwanych mózgów, zebrana w ZT1, pokazuje białka menstruacyjne w charakterystyczny wzór. Ta metoda jest punktem wyjścia dla immunofluorescencji, immunoplotingu, immunoprecypitacji, analizy behawioralnej i każdej innej techniki, której możesz chcieć użyć do porównania, jak zmienia się szlak wraz z tykaniem zegara biologicznego.Dzięki możliwości porywania organizmu modelowego możesz zapytać, czy Twoja ulubiona ścieżka zmienia się w czasie i czy efekty w Twojej ulubionej ścieżce mogą prowadzić do zakłócenia biologicznego. Wiele chorób pogarsza się, gdy zegar biologiczny jest zakłócony. Zidentyfikowanie mechanizmów leżących u podstaw choroby pomoże nam stworzyć skuteczniejsze leki dla osób cierpiących na choroby, takie jak choroba Alzheimera i Parkinsona.

circadian-entrainment-of-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy procedury rejestracji dobowych rytmów aktywności lokomocyjnej Drosophila oraz późniejszej analizy danych. Rytmy aktywności lokomocyjnej są wiarygodnym behawioralnym wskaźnikiem zegarów okołodobowych zwierząt i są wykorzystywane jako standardowy odczyt funkcji zegara podczas badania mutantów okołodobowych lub analizowania wpływu środowiska na regulację systemu okołodobowego.

Oznaczanie aktywności lokomotorycznej w celu badania rytmów okołodobowych i parametrów snu u Drosophila

Ten film opisuje system monitorowania aktywności Drosophila (DAM) używany do śledzenia aktywności lokomotorycznej. Naukowcy wykorzystują dane dotyczące aktywności zebrane z DAM do badania rytmów okołodobowych u muszek owocowych. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak ładować muchy do urządzenia i rejestrować dane dotyczące aktywności do eksperymentów okołodobowych.

Drosophila Monitor aktywności (DAM): metoda pomiaru aktywności lokomotorycznej u much

Tutaj opisujemy test preferencji jasno-ciemnej dla larw Drosophila. Test ten dostarcza informacji na temat wrodzonej i okołodobowej regulacji wykrywania światła i przetwarzania fotozachowania.

Test preferencji świetlnej w celu zbadania wrodzonego i okołodobowego regulowanego fotozachowania u larw Drosophila

Drosophila stała się znaczącym modelowym systemem do analizowania komórkowych i molekularnych podstaw behawioralnych reakcji na alkohol. W tym miejscu przedstawiamy protokół zbierania danych dotyczących wrażliwości na alkohol w kontekście okołodobowym, który można łatwo zastosować w innych eksperymentach i dobrze nadaje się do badań licencjackich.

FlyBar: podawanie muchom alkoholu

Niedawno zidentyfikowaliśmy nową metodę rytmu preferencji temperatury (TPR) u Drosophila, w której preferowana temperatura u muszek wzrasta w ciągu dnia i spada w nocy. TPR jest regulowany niezależnie od innego okołodobowego wyjścia, aktywności lokomotorycznej. Tutaj opisujemy budowę i analizę TPR u Drosophila.

Projektowanie i analiza zachowania preferencji temperaturowych i ich rytmu okołodobowego u Drosophila

Ten raport opisuje metodę pomiaru aktywności larw Drosophila za pomocą TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Urządzenie wykorzystuje wiązki podczerwieni do wykrywania ruchów do 16 pojedynczych zwierząt. Dane mogą być analizowane w celu przedstawienia parametrów ruchu, w tym szybkości i pozycji zwierząt w komorach testowych.

Pomiar aktywności larw w monitorze aktywności Drosophila

Wpływ genów i środowiska na przestrzeń społeczną Drosophila melanogaster można określić ilościowo za pomocą potężnego, ale prostego paradygmatu analitycznego. Pokazujemy tutaj różne czynniki, które mogą wpływać na tę przestrzeń społeczną, a zatem muszą być brane pod uwagę przy projektowaniu eksperymentów w tym paradygmacie.

Warunki wpływające na przestrzeń społeczną u Drosophila melanogaster

Przedstawiono metodę ilościowego określania głównych cech czasowych obserwowanych w rytmach okołomotorycznych much. Kwantyfikacja jest osiągana poprzez dopasowanie aktywności muchy do wieloparametrycznego kształtu fali modelowej. Parametry modelu opisują kształt i wielkość porannych i wieczornych szczytów dziennej aktywności.

Metoda obliczeniowa do ilościowego określania aktywności okołodobowej much

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

W tym artykule pokazujemy, jak wnikliwie ośrodkowego układu nerwowego z państw larw Drosophila stadium.

Dissection z larw CNS na Drosophila melanogaster

Poznaj metodę synchronizacji Drosophila melanogaster do rytmów okołodobowych w badaniach chronobiologicznych. Technika ta umożliwia analizę białek okresu i zachowań cyrkadianalnych.

Okołodobowe porywanie Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów