Name: Identyfikacja i charakterystyka immunogennych gatunków RNA w alergenach HDM, które modulują eozynofilowe zapalenie płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj metody identyfikacji dwuniciowego RNA w alergenach roztoczy kurzu domowego i jego wpływ na eozynofilowe zapalenie płuc u myszy. Protokół obejmuje izolację RNA, analizę dot blot i cytometrię przepływową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pani Karli Gorena za pomoc techniczną w cytometrii przepływowej. L.S. jest wspierany przez Chińską Radę Stypendialną oraz Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. jest wspierany przez Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, Sakaka, Arabia Saudyjska. X.D.L. jest wspierany przez UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund oraz Max and Minnei Voelcker Fund.

Opisane tutaj procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Medycznego University of Texas Health San Antonio.
1. Dot blot w celu wykazania obecności struktur dsRNA w całkowitym RNA z HDM
<ol>
	<li>Izolacja całkowitego RNA z alergenów, owadów i alergenów niepochodzących od owadów
	<ol>
		<li>Umieścić HDM, owady lub zwierzęta niebędące owadami, zebrane żywcem lub zakupione komercyjnie, w probówkach 50 mL i szybko zamrozić w ciekłym N2. Następnie przechowywać w temperaturze -70 °C do późniejszej izolacji całkowitego RNA. 
		UWAGA: W tym eksperymencie wybrano HDM, owady i zwierzęta niebędące owadami, ponieważ są one znanymi częstymi źródłami alergenów. Ponadto funkcja immunostymulująca ich RNA pozostaje niejasna.</li>
		<li>Przenieść odpowiednią ilość (równoważną objętości 100 μL lub mniej) HDM, owadów lub zwierząt niebędących owadami przechowywanych w -70 °C do probówki 2 mL zawierającej kuleczki (ceramiczne sfery 1,4 mm), a następnie zamrozić probówki w pojemniku z ciekłym N2 przez ok. 10 min.</li>
		<li>W celu izolacji całkowitego RNA dodać do każdej probówki 1 mL odczynnika do izolacji RNA na bazie tiocyjanianu guanidyny24, a następnie rozbić owady i niewielkie zwierzęta niebędące owadami za pomocą wysokenergetycznego homogenizatora komórkowego z maksymalną prędkością przez 45 s i schłodzić na lodzie. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.</li>
		<li>Przenieść roztwór z kroku 1.1.3 do nowej probówki 1,5 mL, dodać do każdej probówki 200 μL chloroformu i wymieszać w wirówce typu vortex. Wirować probówki z prędkością 14 000 x g przez 14 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po zakończeniu wirowania przenieść górną fazę wodną (200 μL) do nowej probówki 1,5 mL zawierającej 500 μL izopropanolu, aby wytrącić osad RNA. Nie naruszać interfazy. Zalecany stosunek objętości fazy górnej do izopropanolu wynosi 1:2,5.</li>
		<li>Wymieszać delikatnie w wirówce typu vortex, a następnie wirować probówki z prędkością 14 000 x g przez 14 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie odessać nadsącz, a następnie przemyć osad RNA 500 μL 75% etanolu i wirować z prędkością 7 500 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć cały płyn, wysuszyć osad na powietrzu i rozpuścić osad RNA w 20-50 μL wody H2O wolnej od RNaz.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru, stosując następujące parametry:
		<ol>
			<li>Otworzyć powiązane oprogramowanie i wybrać rodzaj kwasów nukleinowych do pomiaru. Zmienić typ próbki na RNA.</li>
			<li>Wykonać pomiar tła (blank) za pomocą 1-2 μL wody H2O wolnej od RNaz. Przetrzeć wodę H2O wolną od RNaz. Urządzenie jest teraz gotowe do pomiaru.</li>
			<li>Nanieść 1-2 μL próbki RNA i zmierzyć stężenie RNA (μg/μL). 
			UWAGA: Stosunek absorbancji przy 260 i 280 nm (A260/280) na poziomie ok. 2,0 (1,9-2,2) jest powszechnie uznawany za świadczący o „czystości” RNA. Jeśli próbki nie są przetwarzane natychmiast, przechowywać je w temperaturze -70 ˚C i unikać cykli zamrażania i rozmrażania, aby zachować nienaruszone RNA.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie struktury dsRNA w całkowitym RNA przy użyciu specyficznego przeciwciała J2 przeciwko dsRNA
	<ol>
		<li>Przygotować dwie próbki RNA o objętości 20 μL (200 ng/μL). Jedną z traktowaniem RNazą-III (1 μL na 1 μg RNA, inkubować w 37 °C przez 60 min), a drugą bez traktowania RNazą-III. 
		UWAGA: RNaza III jest tutaj stosowana do specyficznej degradacji dsRNA, ale nie jednoniciowego RNA25.</li>
		<li>Za pomocą ołówka narysować siatkę, w której próbki RNA zostaną naniesione na membranę.</li>
		<li>Nanieść 2 μL próbki RNA o stężeniu 200 ng/μL na dodatnio naładowaną membranę nylonową.</li>
		<li>Sieciować próbki z membraną przy 1 200 mikrodżulach x 100 w urządzeniu do sieciowania UV. Powtórzyć kroki 1.2.3 i 1.2.4 jeszcze dwa razy w miejscu naniesienia próbki. Da to łącznie 0,8&#160;μg na jedną plamkę. 
		UWAGA: Nie nanosić na membranę więcej niż 2 μL próbki RNA za jednym razem.</li>
		<li>Zablokować nieswoiste wiązania, stosując 5% mleko w TBS-T przez 1 h z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór blokujący z kroku 1.2.5 i dodać przeciwciało anty-dsRNA J2 w rozcieńczeniu 1:1 000 w 1% mleku w TBS-T i inkubować przez noc z wytrząsaniem w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyć membranę roztworem TBS-T przez 5 min i powtórzyć ten krok 3 razy. Dodać przeciwciało wtórne (anty-IgG mysie sprzężone z fosfatazą alkaliczną rozcieńczone w 1% mleku 1:5 000) i inkubować przez 1 h na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Przemyć membranę roztworem TBS-T przez 5 min i powtórzyć ten krok 3 razy.</li>
		<li>Dodać substrat (BCIP/NBT) i inkubować przez 5-15 min, aż pojawi się pożądany sygnał.</li>
		<li>Zatrzymać reakcję, płucząc membranę wodą ddH2O.</li>
		<li>Wysuszyć membranę na papierowych ręcznikach i wykonać zdjęcie za pomocą smartfona (reprezentatywny wynik przedstawiono na Rysunku 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RT-qPCR w celu pomiaru zdolności całkowitego RNA HDM do stymulowania ekspresji płucnych ISGs
<ol>
	<li>Izolacja RNA z tkanek płuc myszy 
	UWAGA: Myszy (samice, w wieku 8-12 tygodni, szczep C57BL/6J) utrzymywano w warunkach wolnych od określonych patogenów.
	<ol>
		<li>Krótko znieczulić zwierzę izofluranem, a następnie podać przez instylację wewnątrztrachealną 5 μg (rozpuszczonych w 80 μL PBS) RNA HDM traktowanych lub nietraktowanych RNazą III.</li>
		<li>Po 16-18 h od podania RNA HDM, uśmiercić mysz poprzez inhalację CO2 przez kilka minut. Następnie umieścić mysz na platformie i przymocować kończyny igłami.</li>
		<li>Zdezynfekować mysz 70% etanolem, a następnie naciąć skórę sterylnymi nożyczkami, prowadząc cięcie od brzucha do szyi.</li>
		<li>Utrwalić skórę igłami i przeciąć żebra, aby odsłonić płuca. Wyjąć całe płuca i przemyć je zimnym PBS. Umieścić płuca na papierze do tkanek i wyciąć po jednym małym fragmencie z każdego płata płuc do probówki o pojemności 2 mL zawierającej kuleczki (objętość 200-300 μL, ceramiczne sfery 1,4 mm). 
		UWAGA: Celem zastosowania kuleczek ceramicznych jest rozdrobnienie całych tkanek płucnych</li>
		<li>Zamrozić próbki płuc, umieszczając probówki w pojemniku z ciekłym N2 na ok. 10 min.</li>
		<li>Do każdej probówki dodać 500 μL odczynnika do izolacji RNA na bazie tiocyjanianu guanidyny i homogenizować tkanki płucne za pomocą homogenizatora przez 45 s. Chłodzić na lodzie pomiędzy każdym krokiem. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.</li>
		<li>Postępować zgodnie z krokami 1.1.4- 1.1.7 w celu izolacji RNA z płuc.</li>
		<li>Osuszyć osad na powietrzu i rozpuścić osad RNA w odpowiedniej ilości wody H2O wolnej od RNaz (~20-30 μL).</li>
		<li>Zmierzyć stężenie RNA zgodnie z opisem w kroku 1.1.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RT-qPCR w celu określenia zdolności RNA HDM do stymulowania ekspresji genów w płucach.
	<ol>
		<li>Wykorzystując 100 ng/μL RNA wyekstrahowanego z tkanek płucnych jako matrycę, przeprowadzić syntezę cDNA zgodnie z przywołanym protokołem26.</li>
		<li>Przygotować reakcję RT-qPCR w objętości 10 μL/dołek dla płytki 384-dołkowej, używając wygenerowanego wcześniej cDNA oraz specyficznych dla genów par starterów (Tabela 1 i Tabela 2).</li>
		<li>Szczelnie zamknąć dołki przezroczystą folią adhezyjną i wstrząsnąć płytką na wirówce typu vortex przez 30 s. Wirować płytkę z prędkością 1 000 x g przez 30 s, aby zebrać próbki na dnie dołków.</li>
		<li>Włożyć płytkę do urządzenia do RT-qPCR i rozpocząć reakcję RT-qPCR zgodnie z protokołem cyklera termicznego (Tabela 3).</li>
		<li>Po zakończeniu programu wyeksportować wyniki do arkusza kalkulacyjnego lub przeanalizować dane za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta (reprezentatywny wynik przedstawiono na Rysunku 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza FACS w celu określenia wpływu RNA z HDM na naciek eozynofili w BAL i płucach
<ol>
	<li>Zbiór płynu BAL do analizy FACS
	<ol>
		<li>Eutanazję myszy (samice, 8-12 tygodni, szczep C57BL/6J) leczonych ekstraktami alergenowymi HDM (zgodnie z planem doświadczalnym przedstawionym na Rysunku 3B) przeprowadzić poprzez inhalację CO2.</li>
		<li>Umieścić mysz na platformie i przymocować kończyny za pomocą igieł.</li>
		<li>Zdezynfekować mysz 70% etanolem. Za pomocą nożyczek naciąć skórę od górnej części brzucha aż do szyi.</li>
		<li>Delikatnie rozsunąć pęsetą gruczoły ślinowe i mięsień mostkowo-gnykowy, aby odsłonić tchawicę. Za pomocą pęsety wprowadzić pod tchawicę nitkę nylonową (~10 cm).</li>
		<li>Wykonać nacięcie w tchawicy (~2 mm pod krtanią), wystarczające do wprowadzenia kaniuli. Nie przecinać tchawicy całkowicie. Zawiązać nitkę wokół tchawicy i kaniuli.</li>
		<li>Napełnić strzykawkę 1 mL PBS+EDTA i podłączyć ją do końca kaniuli. Wstrzyknąć 1 mL PBS+EDTA do płuc i całkowicie odessać roztwór. Ostrożnie odłączyć strzykawkę od kaniuli i przenieść&#160;roztwór do probówki 15 mL na lodzie.</li>
		<li>Ponownie napełnić strzykawkę świeżym PBS+EDTA i powtórzyć ten krok 2x.</li>
		<li>Odwirować probówkę zawierającą połączony płyn BAL uzyskany w kroku 3.1.7 w celu osadzenia komórek przy 500 x g przez 7 min w temperaturze 4 °C. Zmierzyć objętość płynu BAL, a następnie przenieść nadsącz do dwóch probówek 1,5 mL, nie naruszając osadu. 
		UWAGA: Nadsącz z BAL można przechowywać w temperaturze -70 °C do późniejszych analiz, np. ELISA.</li>
		<li>W przypadku obecności erytrocytów w osadzie wynikającej z silnego stanu zapalnego płuc, po usunięciu nadsączu dodać 500 μL buforu do lizy erytrocytów i dobrze wymieszać poprzez resuspensję. Przenieść roztwór do nowej probówki 1,5 mL i wirować przez 7 min z prędkością 500 x g w 4 °C.</li>
		<li>Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 150 μL buforu FACS.</li>
		<li>Przenieść 150 μL resuspendowanej próbki do płytki 96-dołkowej i wirować płytkę przez 7 min z prędkością 500 x g w 4 °C.</li>
		<li>Szybko odwrócić płytkę nad ręcznikami papierowymi, aby zebrać komórki znajdujące się na dnie dołków.</li>
		<li>Barwić komórki przeciwciałami w buforze FACS w obecności przeciwciała blokującego 2.4G2 (2,5 μg / 100 μL). Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 min w ciemnym miejscu.</li>
		<li>Po barwieniu wirować płytkę w celu osadzenia komórek przy 500 x g przez 7 min w 4 °C.</li>
		<li>Usunąć roztwór barwiący, odwracając płytkę na ręczniku papierowym, a następnie przemyć poprzez resuspensję w 100 μL buforu FACS. Następnie ponownie wirować płytkę przy 500 x g przez 7 min w 4 °C i usunąć bufor FACS, odwracając płytkę na ręczniku papierowym.</li>
		<li>Resuspendować próbki w 150 μL buforu FACS i przenieść do probówek FACS zawierających 350 μL buforu FACS. Do każdej próbki dodać 25 μL kulek liczących (counting beads). Próbki są teraz gotowe do analizy cytometrii przepływowej. 
		UWAGA: Różne typy komórek w płynie BAL oznakowano przeciwciałami zgodnie z opisem. Kuleczki liczące dodano przed uruchomieniem FACS. Dane z cytometrii przepływowej analizowano za pomocą dostępnego komercyjnie oprogramowania. Strategię bramkowania przedstawiono na Rysunku 3 oraz w Tabeli 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie tkanki płucnej do analizy FACS
	<ol>
		<li>Postępować zgodnie z krokami 3.1.1 - 3.1.3.</li>
		<li>Naciąć skórę od brzucha do szyi za pomocą wysterylizowanych nożyczek. Przymocować skórę igłami i przeciąć żebra, aby odsłonić płuca.</li>
		<li>Wyjąć całe płuca i przemyć je zimnym PBS. Umieścić próbki w probówce 1,5 mL zawierającej 50 μL roztworu do trawienia płuc.</li>
		<li>Posiekać tkankę płucną na małe kawałki za pomocą zakrzywionych nożyczek. Przenieść tkankę płucną do płytki 6-dołkowej, a następnie dodać 8 mL roztworu do trawienia płuc. Umieścić płytkę na wytrząsarce w inkubatorze w 37 °C na 45 min.</li>
		<li>Po inkubacji rozetrzeć tkankę płucną za pomocą końcówki probówki 1,5 mL. Umieścić sitko 70 µm na nowej płytce 6-dołkowej i przepuścić próbkę przez filtr 0,22 µm.</li>
		<li>Przenieść przefiltrowany roztwór do probówki 15 mL, a następnie wirować probówki przy 500 x g przez 7 min w 4 °C. Odessać nadsącz i resuspendować osad w 1 mL buforu do lizy erytrocytów, a następnie pozostawić na lodzie na 3 min.</li>
		<li>Przenieść próbkę do probówki 1,5 mL i wirować przy 500 x g przez 7 min w 4 °C. Powtórzyć 2x.</li>
		<li>Przemyć komórki płuc 2x za pomocą 1 mL buforu FACS. Odessać nadsącz i resuspendować osad w 1 mL buforu FACS, a następnie przenieść 100 μL próbki do płytki 96-dołkowej.</li>
		<li>Wirować płytkę przez 7 min z prędkością 500 x g w 4 °C. Postępować zgodnie z krokami opisanymi w sekcji Zbiór płynu BAL do analizy FACS (od 3.1.13 do 3.1.16), aby zabarwić komórki w próbkach strawionej tkanki płucnej. 
		UWAGA: Eozynofile w płucach oznakowano przeciwciałami zgodnie z opisem, a następnie zmieszano z kuleczkami liczącymi do dalszej analizy FACS. Dane z cytometrii przepływowej analizowano za pomocą odpowiedniego oprogramowania. W celu oceny odpowiedzi immunologicznej indukowanej przez RNA HDM należy odnieść się do Rysunku 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przeprowadź analizę statystyczną przy użyciu dostępnego komercyjnie oprogramowania.</li>
	<li>Wyznacz wartości p za pomocą nieparzystego dwustronnego testu t Studenta dla porównania dwóch grup.</li>
	<li>Oblicz bezwzględną liczbę eozynofilów na podstawie kulek referencyjnych (panel górny), korzystając ze wzoru</li>
</ol>
<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/61183/61183equ01.jpg" />
<ol start="4">
	<li>Wyznacz wartości p za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) oraz testu wielokrotnych porównań Sidaka w przypadku porównywania więcej niż dwóch grup.</li>
	<li>Przyjmij wartość p mniejszą niż 0,05 za istotną statystycznie. Wartości p są zaznaczone na wykresach jako *p &#60;0,05, **p&#60;0,01, ***p&#60;0,001 oraz ****p&#60;0,0001. 
	UWAGA: Wszystkie przepisy na bufory znajdują się w Tabeli 5.</li>
</ol>

<ol><li>Strachan, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hay+fever%2C+hygiene%2C+and+household+size%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Hay fever, hygiene, and household size.</a> BMJ. 299, 1259-1260 (1989).</li>
<li>Schuijs, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farm+dust+and+endotoxin+protect+against+allergy+through+A20+induction+in+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells.</a> Science. 349, 1106-1110 (2015).</li>
<li>Stein, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Immunity+and+Asthma+Risk+in+Amish+and+Hutterite+Farm+Children%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children.</a> New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).</li>
<li>Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Endogenous+Nucleic+Acids+by+the+Innate+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System.</a> Immunity. 44, 739-754 (2016).</li>
<li>Schlee, M., Hartmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discriminating+self+from+non-self+in+nucleic+acid+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing.</a> Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).</li>
<li>Wu, J., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+sensing+and+signaling+of+cytosolic+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids.</a> Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).</li>
<li>O'Hara, A. M., Shanahan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+flora+as+a+forgotten+organ%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">The gut flora as a forgotten organ.</a> EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).</li>
<li>Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces. , Microbiology Society. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html">https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html</a> (2018).</li>
<li>Weber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).</li>
<li>Barral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+the+cytoplasmic+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA-5%3A+Key+regulators+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity.</a> Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).</li>
<li>Netea, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+Th1%2FTh2+paradigm+towards+a+Toll-like+receptor%2FT-helper+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).</li>
<li>McNally, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+administration+of+dsRNA+analog+poly%28I%3AC%29+induces+interferon-alpha+receptor-dependent+accumulation+of+antigen+experienced+T+cells+in+the+airways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways.</a> PLoS One. 7, 51351(2012).</li>
<li>Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vaccines+with+dsRNA+adjuvant+ARNAX+induces+antigen-specific+tumor+shrinkage+without+cytokinemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia.</a> Oncoimmunology. 5, 1043506(2016).</li>
<li>Toussi, D. N., Massari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Adjuvant+Effect+of+molecularly+defined+Toll-Like+Receptor+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands.</a> Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).</li>
<li>She, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Sensing+of+Aeroallergen-Associated+Double-Stranded+RNA+Triggers+an+IFN+Response+and+Modulates+Type+2+Lung+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation.</a> Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).</li>
<li>Fujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+inflammation+and+cytokine+dynamics+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+from+a+mouse+model+of+bronchial+asthma+during+A%28H1N1%29pdm09+influenza+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection.</a> Science Reports. 7, 9128(2017).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Autonomous+Memory+Alveolar+Macrophages+Requires+T+Cell+Help+and+Is+Critical+to+Trained+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity.</a> Cell. 175, 1634-1650 (2018).</li>
<li>Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+techniques+for+bronchoalveolar+lavage+in+translational+respiratory+research%3A+Paving+the+way+to+develop+novel+therapeutic+moieties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties.</a> Journal of Biological Methods. 4, 73(2017).</li>
<li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398(2017).</li>
<li>Salahuddin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+and+Matched+Blood+for+Alveolar+Macrophage+and+CD4%2B+T-cell+Immunophenotyping+and+HIV+Reservoir+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59427(2019).</li>
<li>Hungary (SCICONS). "Antibodies - J2." Antibodies - Monoclonal Anti-DsRNA J2 and Anti-DsRNA K1. English and Scientific Consulting Kft. , Available from: 
 <a target="_blank" href="scicons.eu/en/antibodies/j2/">scicons.eu/en/antibodies/j2/</a> (2020).</li>
<li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-Stranded+RNA+Is+Detected+by+Immunofluorescence+Analysis+in+RNA+and+DNA+Virus+Infections%2C+Including+Those+by+Negative-Stranded+RNA+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li>
<li>Monsion, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Detection+of+Long+dsRNA+in+Vitro+and+in+Vivo+Using+the+dsRNA+Binding+Domain+from+FHV+B2+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein.</a> Front Plant Sci. 9, 70(2018).</li>
<li>TRIzol Reagent Literature. RNA Isolation with TRIzol (Invitrogen) and Qiagen RNAeasy. Invitrogen Life Technologies. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.ocg.cancer.gov/sites/default/files/RNA_Trizol_NBL.pdf">http://www.ocg.cancer.gov/sites/default/files/RNA_Trizol_NBL.pdf</a> (2020).</li>
<li>ShortCut RNase III Digestion Protocol (M0245). New England Biolabs. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.neb.com/protocols/0001/01/01/shortcut-rnase-iii-digestion-protocol-m0245">www.neb.com/protocols/0001/01/01/shortcut-rnase-iii-digestion-protocol-m0245</a> (2020).</li>
<li>IScript cDNA Synthesis Kit Technical Manual. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106228.pdf">www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106228.pdf</a> (2020).</li>
<li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+and+sex+dimorphisms+contribute+to+the+severity+of+bleomycin-induced+lung+injury+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).</li>
<li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).</li>
<li>Gueders, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+asthma%3A+a+comparison+between+C57BL%2F6+and+BALB%2Fc+strains+regarding+bronchial+responsiveness%2C+inflammation%2C+and+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Obecny protokół opisuje, w jaki sposób można ocenić właściwości immunostymulujące mikrobiologicznego RNA związanego z alergenem i ich wpływ na rozwój eozynofilowego zapalenia płuc w mysim modelu astmy alergicznej. Chociaż długie dsRNA są znane jako produkty pośrednie replikacji wielu wirusów, które mogą silnie aktywować odpowiedzi interferonowe w komórkach ssaków, ich obecność w alergenach HDM była nieznana aż do naszej ostatniej pracy15. Połączenie analizy RNA dot blot, RT-qPCR i FACS przedstawio...

Na podstawie hipotezy higieny pierwotnie zaproponowanej przez Strachana1, narażenie we wczesnym dzieciństwie na czynniki mikrobiologiczne środowiska, takie jak endotoksyna, może chronić przed rozwojem zaburzeń alergicznych2,3. Podczas infekcji mikrobiologicznych, np. infekcji wirusowych, wrodzone immunologiczne wykrywanie obcych kwasów nukleinowych (RNA/DNA) wyzwala reakcje obronne gospodarza4,5,6. Jednak istnienie i rozpowszechnienie immunogennych kwasów nukleinowych, takich jak długie dwuniciowe RNA (dsRNA) w roztoczach kurzu domowego (HDM) lub innych alergenach owadów, pozostaje nieznane. Protokół ten został opracowany w celu określenia, czy HDM lub alergeny owadów i innych owadów zawierają długie gatunki dsRNA, które mogą aktywować ochronną odpowiedź immunologiczną, aby przeciwdziałać rozwojowi ciężkiego eozynofilowego zapalenia płuc w mysim modelu astmy alergicznej. W tym miejscu przedstawiamy trzy proste i szybkie metody oceny strukturalnych determinantów całkowitego RNA HDM, które są wymagane do regulacji eozynofilowego zapalenia płuc wywołanego alergenami.
Układ odpornościowy błony śluzowej jest największym organem odpornościowym w organizmie i służy jako pierwsza linia obrony gospodarza zarówno przed infekcjami mikrobiologicznymi, jak i alergicznymi urazami7,8. Wiadomo, że długie dsRNA, półprodukt replikacyjny wielu wirusów, działa jako wzorzec molekularny związany z patogenem (PAMP), który silnie stymuluje wrodzone odpowiedzi za pośrednictwem receptora Toll podobnego 3 (TLR3) w celu indukowania ekspresji genów stymulowanych interferonem (ISG)9,10,11,12,13,14. Niedawno wykazaliśmy, że całkowite RNA HDM zawierało struktury dsRNA, które zwiększały ekspresję ISG i zmniejszały ciężkie eozynofilowe zapalenie płuc, gdy były podawane przez wkraplanie dotchawicze w mysim modelu astmy alergicznej indukowanej przez ekstrakty HDM15. Nasilenie stanów zapalnych płuc określa się poprzez analizę typów komórek odpornościowych w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL) i tkance płucnej za pomocą cytometrii przepływowej16,17,18,19,20.
Ten protokół obejmuje trzy testy: 1) szybkie wykrywanie struktur dsRNA za pomocą plamy RNA za pomocą mysiego przeciwciała monoklonalnego J2, które specyficznie wiąże się z dsRNA (≥40bp) w sposób niezależny od sekwencji; 2) szybka ocena efektów in vivo immunostymulującego RNA w płucach myszy poprzez pomiar indukcji ISG za pomocą RT-qPCR; 3) dokładna kwantyfikacja eozynofili w BAL i płucach w kontekście zapalenia płuc wywołanego przez HDM za pomocą analizy cytometrii przepływowej.
Powyższe testy mogą być używane nie tylko do badania alergicznych chorób płuc, ale także infekcji bakteryjnych i wirusowych dróg oddechowych. Na przykład przeciwciało J2 specyficzne dla dsRNA może być również wykorzystywane w innych zastosowaniach, takich jak chromatografia immunopowinowactwa, immunohistochemia, test immunoenzymatyczny (ELISA) i barwienie immunologiczne21,22,23. Ponadto kilka zastosowań po zbieraniu płynu BAL można wykorzystać do ilościowego oznaczania rozpuszczalnych zawartości, takich jak cytokiny i chemokiny, za pomocą testu ELISA oraz profilowania transkrypcyjnego komórek w drogach oddechowych (np. makrofagów pęcherzykowych). Chociaż w literaturze dostępnych jest wiele protokołów oceny stanu płuc, większość z tych protokołów często koncentruje się na walidacji celu. Opisane tutaj procedury można zastosować do identyfikacji składników alergenów środowiskowych, które są ważne dla regulacji rozwoju chorób alergicznych.

<table><tbody><tr><td>0,40 &mikro; m Filtr siatkowy Falcon Cell</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubka</td><td>TH. Geyer</td><td>7696702</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka</td><td>TH. Geyer</td><td>7696705</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Absolutne koraliki do liczenia</td><td>Life Technologies Europe B.V.</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizujący ACK-RBC</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Membrana Amersham Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Ant</td><td>San Antonio</td><td>Uwaga: Lokalnie zebrany</td><td></td></tr><tr><td>bufor</td><td></td> rozcieńczający przeciwciała <td>(patrz tabela 5 dla przepisu)</td><td></td></tr> <tr><td>Anti-Mouse CD11b V450 Rat (klon M1 / 70)</td> <td>BD Bioscience</td><td>560456</td><td>1 do Roztwór</td></tr><tr><td>przeciw myszom CD11c w rozcieńczeniu 200 PE-Cy7 (klon N418)</td> <td>BioLegend</td><td>117317</td><td>w rozcieńczeniu od 1 do 200</td></tr><tr><td>Mąka Anti-Mouse CD19 Alexa 647 (klon 1D3)</td> <td>eBioscience</td><td>15-0193-81</td><td>Rozcieńczenie od 1 do 200</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3e APC (klon 145-2C11)</td> <td>Invitrogen</td><td>15-0031-81</td><td>Rozcieńczenie od 1 do 200</td></tr><tr><td>APC-Cy7 (klon: 30-F11) BioLegend</td><td></td> <td>103130</td><td>od 1 do 200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506</td><td>Invitrogen</td><td>65-0866-14</td><td>1 do 200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate</td><td>Promega</td><td>S3721</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly-6G FITC (klon RB6-8C5)</td><td>Invitrogen</td><td>11-5931-82</td><td>1 do 200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (klon M5/114.15.2)</td><td>eBioscience</td><td>47-5321-80</td><td>1 do 200 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Siglec-F PE (klon E50-2440)</td> <td>BD Pharmingen</td><td>552126</td><td>1 do 200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Podłoże BCIP/NBT</td><td>Bufor</td><td></td> blokujący Thermo Fisher Scientific PI34042 <td></td></tr><tr><td>(</td><td>patrz tabela 5 dla przepisu)</td><td></td> Cannual, 20G X 1,5 "<td></td></tr><tr><td></td><td>CADENCE SCIENCE</td><td>9920</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>CFX384 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1855485</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Karaluch</td><td>Greer Laboratories</td><td>B26</td><td></td></tr><tr><td>Liczenie koralików</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>D. farinae</td><td>Greer Laboratories</td><td>B81</td><td></td></tr><tr><td>D. pteronyssinus</td><td>Greer Laboratories</td><td>B82</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych Denville z pokrywką, 96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Thomas Scientific</td><td>1156F03</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa sucha kąpiel - cztery bloki</td><td>Universal Medical, Inc.</td><td></td><td></td>BSH1004</tr><tr><td>Dżdżownica</td><td>San Antonio</td><td>Uwaga: Lokalnie zbierany</td><td></td></tr><tr><td>kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Géngá-Aldrich</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td> FACS <td>(patrz przepis w tabeli 5)</td><td></td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe Falcon Round-Bottom, 5 mL</td><td>STEMCELLTM TECHNOLOGIES</td><td>38056</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy (BD FACS Celesta)</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly</td><td>Greer Laboratories</td><td>B8</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>HT-DNA</td><td>Sigma</td><td>D6898</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo MAb anty-mysie CD16 / CD32 (klon: 2.4G2)</td><td>Bio X Cell</td><td>BE0307</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Zestaw do syntezy</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Labs</td><td>sc-363629Rx</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2618500</td><td></td></tr><tr><td>J2 przeciwciało monoklonalne anty-dsRNA</td><td>SCICONS</td><td>10010200</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td> do trawienia płuc <td>(patrz przepis w tabeli 5)</td><td></td></tr> <tr><td>Lysing Matrix D</td><td>MP Biomedicals</td><td>116913050-CF</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix D, probówka 2 ml</td><td>MP Biomedicals</td><td>SKU:116913100</td><td></td></tr><tr><td>Myszy (samica, 8-12 tygodni, C57BL/6J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30120.094</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Olympus</td><td>CK30</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizatory Mini-BeadBeater</td><td></td><td>SKU:BS:607</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito</td><td>Greer Laboratories</td><td>B55</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>Thermo Scientific Specttofotometr Medex Dostawa</td><td>TSCND2000C</td><td></td></tr><tr><td>igły, 21 g x 1 1/2 cala</td><td>BD Biosciences</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Mleko beztłuszczowe</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1706404</td><td></td></tr><tr><td>Sznurek nylonowy</td><td>Dynarex</td><td>3243</td><td></td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>RNase III</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2290</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2283</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka lub mały mikser laboratoryjny</td><td>Boekel Scientific</td><td>201100</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO AccuCount Fluorescencyjny</td><td>Spherotech</td><td>ACFP-70-5</td><td>1 do 10 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Spider</td><td>San Antonio</td><td>Uwaga: Lokalnie zbierany</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td> <td>(patrz przepis w Tabeli 5)</td><td></td></tr> <tr><td>TBS-T</td><td></td> <td>(patrz przepis w Tabeli 5)</td><td></td></tr> <tr><td>Całkowita pożywka</td><td></td> komórkowa <td>(patrz przepis w Tabeli 5)</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Odczynnik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400 UV</td><td>LabX</td><td>20447</td><td></td></tr><tr><td>Wasp</td><td>San Antonio</td><td>Uwaga: Zbierane</td><td></td> lokalnie</tr></tbody></table>

identyfikacja i charakterystyka immunogennych gatunków rna w alergenach hdm, które modulują eozynofilowe zapalenie płuc

Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

Alergeny środowiskowe, takie jak roztocza kurzu domowego (HDM), często występują w złożonych formach, zawierających zarówno białka alergiczne, które wywołują nieprawidłowe reakcje typu 2, jak i substancje mikrobiologiczne, które wywołują wrodzoną odpowiedź immunologiczną. Te związane z alergenami składniki mikrobiologiczne odgrywają ważną rolę w regulacji rozwoju stanów zapalnych typu 2, takich jak astma alergiczna. Jednak mechanizmy leżące u podstaw tej choroby pozostają w dużej mierze niezdefiniowane. Przedstawiony tutaj protokół określa charakterystykę strukturalną i aktywność in vivo immunostymulującego RNA związanego z alergenem. W szczególności powszechne alergeny są badane pod kątem obecności dwuniciowych gatunków RNA (dsRNA), które mogą stymulować odpowiedzi IFN w płucach i powstrzymywać rozwój ciężkiej eozynofilii płuc w mysim modelu astmy alergicznej wywołanej HDM. W tym miejscu uwzględniliśmy następujące trzy testy: Dot blot w celu pokazania struktur dsRNA w całkowitym RNA wyizolowanym z alergenów, w tym gatunków HDM, RT-qPCR do pomiaru aktywności HDM RNA w ekspresji genów stymulujących interferon (ISG) w płucach myszy oraz analiza FACS w celu określenia wpływu HDM RNA na liczbę eozynofili w BAL i płucach, odpowiednio.

Obecność długich struktur dsRNA w HDM, owadach i niewielkich zwierzętach niebędących owadami badano metodą dot blot przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego J2 swoistego dla dsRNA (≥ 40bp). Do trawienia dsRNA do fragmentów dsRNA o długości 12–15 bp wykorzystano RNazę III, których nie można było wykryć za pomocą J2 (Rysunek 1).
Zdolność całkowitego RNA HDM do stymulowania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w płucach myszy w sposób zależny od dawki&#160;zos...

Alergeny środowiskowe, takie jak roztocza kurzu domowego (HDM), często zawierają substancje mikrobiologiczne, które aktywują wrodzoną odpowiedź immunologiczną w celu regulacji alergicznego stanu zapalnego. Przedstawiony protokół przedstawia identyfikację gatunków dsRNA w alergenach HDM oraz charakterystykę ich aktywności immunogennej w modulowaniu eozynofilowego zapalenia płuc.

Identyfikacja i charakterystyka immunogennych gatunków RNA w alergenach HDM, które modulują eozynofilowe zapalenie płuc

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

Protokół ten został opracowany w celu rozwiązania bardzo ważnej i nierozwiązanej kwestii, w jaki sposób obecne substancje mikrobiologiczne i alergeny środowiskowe mogą regulować rozwój alergicznego stanu zapalnego. W szczególności przedstawione tutaj metody mogą pomóc odpowiedzieć na pytanie, czy dwuniciowe gatunki RNA w roztoczach kurzu domowego są immunogenne in vivo i są w stanie modulować eozynofilowe zapalenie płuc. Głównymi zaletami tych technik jest to, że są proste, wydajne, wysoce powtarzalne i mogą być wykonywane przy użyciu powszechnie używanych narzędzi i sprzętu.Metody te można również wykorzystać do oceny chorób płuc spowodowanych infekcjami wirusowymi dróg oddechowych. Li She, doktorantka w moim laboratorium, pomoże zademonstrować tę procedurę. Zacznij od wyizolowania całkowitego RNA z alergenów, owadów i alergenów innych niż owady.Przenieś odpowiednią ilość próbki do dwumililitrowej probówki zawierającej 1,4 milimetra kulek ceramicznych i zamroź probówki w pojemniku z ciekłym azotem na około 10 minut. Dodaj jeden mililitr odczynnika do izolacji RNA na bazie tiocyjanianu guanidyny do każdej probówki. Następnie rozbij małe zwierzęta owadzie i inne za pomocą wysokoenergetycznego zakłócacza ogniw z maksymalną prędkością przez 45 sekund.Schłodzić próbkę na lodzie i powtórzyć ten proces dwukrotnie. Przenieś roztwór do nowej 1,5-mililitrowej probówki. Dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do każdej probówki i zwiruj próbkę.Odwirować probówki z prędkością 14 000 g przez 14 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieś górną fazę wodną do nowej probówki zawierającej 500 mikrolitrów izopropanolu. Wymieszać próbkę.Następnie odwiruj go w temperaturze 14 000 g przez 14 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie zassać supernatant. Następnie przemyj osad RNA 500 mikrolitrami 75% etanolu i odwiruj go z prędkością 7 500 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ostrożnie usuń cały płyn. Wysuszyć osad na powietrzu i rozpuścić RNA w 20 do 50 mikrolitrach wody wolnej od RNaz. Aby wykryć dwuniciowe struktury RNA w całkowitym RNA, umieść dwa mikrolitry próbki RNA o natężeniu 200 nanogramów na mikrolitr na dodatnio naładowanej membranie nylonowej.Sieciować próbki z membraną w proporcji 1 200 mikrodżuli na 100 w sieciowniku UV. Powtórz plamienie i sieciowanie jeszcze dwa razy, co da w sumie 1,2 mikrograma RNA na plamę. Zablokuj niespecyficzne wiązanie z 5% mlekiem w TBS-T przez godzinę, wstrząsając w temperaturze pokojowej.Następnie usuń roztwór blokujący i dodaj przeciwciało anty-dwuniciowe RNA J2 w rozcieńczeniu jeden do 1 000 w 1% mleku w TBS-T. Inkubować błonę przez noc, wstrząsając w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj membranę trzykrotnie TBS-T przez pięć minut na pranie.Dodać przeciwciało drugorzędowe i inkubować błonę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz pranie za pomocą TBS-T. Dodaj substrat i inkubuj membranę przez pięć do 15 minut, aż pojawi się pożądany sygnał.Zatrzymaj reakcję, przepłukując membranę wodą podwójnie destylowaną. Aby pobrać próbki płuc, umieść płuca na bibułkach i wytnij jeden mały kawałek każdego płata płuca. Umieść każdy kawałek w dwumililitrowej tubie zawierającej koraliki.Aby zebrać płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, zdezynfekuj uśpioną mysz 70% etanolem i użyj nożyczek, aby przeciąć skórę od górnej części brzucha do szyi. Delikatnie rozsuń gruczoły ślinowe i mięsień mostkowo-gnykowy kleszczami, aby odsłonić tchawicę. Następnie umieść pod nim nylonowy sznurek.Wykonaj nacięcie w tchawicy około dwóch mililitrów pod krtanią, na tyle, aby wprowadzić kaniulę i zawiązać sznurek wokół tchawicy i kaniuli. Podłącz strzykawkę do końca kaniuli i załaduj ją świeżym PBS-EDTA. Następnie wstrzyknąć i odessać jeden mililitr roztworu do płuc.Odłącz strzykawkę od kaniuli i wyrzuć roztwór do 15-mililitrowej probówki. Powtórz ten proces, aby zamrozić świeżym PBS-EDTA i zebrać płuczkę. Odwirować probówkę o ciśnieniu 500 g przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie zapisz objętość i przenieś supernatant do dwóch 1,5-mililitrowych probówek bez naruszania osadu. Po ponownym zawieszeniu osadu przenieś 150 mikrolitrów do płytki 96-dołkowej i odwiruj płytkę przez siedem minut w temperaturze 500 razy g i czterech stopniach Celsjusza. Następnie szybko odwróć płytkę na bibułce, aby usunąć supernatant.Wybarwić komórki przeciwciałami w buforze FACS w obecności przeciwciała blokującego 2,4G2 i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Po zabarwieniu odwirować płytkę, aby granulować komórki w temperaturze 500 razy g przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń roztwór barwiący, odwracając płytkę na bibułce.Dodaj 100 mikrolitrów buforu FACS, aby umyć komórki, a następnie powtórzyć wirowanie. Ponownie zawiesić próbki w 150 mikrolitrach buforu FACS, a następnie przenieść je do probówek FACS zawierających dodatkowe 350 mikrolitrów buforu. Dodaj 25 mikrolitrów kulek liczących do każdej próbki i przystąp do analizy cytometrii przepływowej.Obecność długich, dwuniciowych struktur RNA w roztoczach kurzu domowego, owadach i małych zwierzętach niebędących owadami zbadano za pomocą dot blot przy użyciu dwuniciowego, specyficznego dla RNA mysiego przeciwciała monoklonalnego. RNaza III została użyta do trawienia dwuniciowego RNA na 12 do 15 fragmentów par zasad, które były niewykrywalne przez J2. Zdolność całkowitego RNA roztoczy kurzu domowego do stymulowania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w płucach myszy wykazano za pomocą RT-qPCR. Leczenie RNazą III zniosło immunostymulującą aktywność całkowitego RNA roztoczy kurzu domowego, co wskazuje, że dwuniciowe struktury RNA są niezbędne dla wrodzonej aktywności immunologicznej w płucach.Hamujący wpływ całkowitego RNA roztoczy kurzu domowego na rozwój ciężkiego zapalenia płuc typu drugiego oceniano za pomocą analizy FACS. Eozynofilowe zapalenie płuc zostało wywołane przez ekstrakty z roztoczy kurzu domowego, które leczono RNazą III lub bez niej. Degradacja długich, dwuniciowych gatunków RNA spowodowała ciężkie zapalenie płuc typu drugiego, odzwierciedlone zwiększoną liczbą eozynofili w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych i płucach.Warto zauważyć, że liczba eozynofili w grupie traktowanej całkowitym RNA roztoczy kurzu domowego jest porównywalna z grupą traktowaną oryginalnym ekstraktem z roztoczy kurzu domowego, który endogennie zawierał długie dwuniciowe gatunki RNA. Podczas próby zastosowania tego protokołu należy zachować szczególną ostrożność podczas wstrzykiwania i pobierania płynu BAL, ponieważ jakiekolwiek uszkodzenie płuc na tym etapie może zmienić końcowe wyniki. Oprócz tej procedury można wykonać inne metody, takie jak ELISA, w celu analizy niekomórkowych rozpuszczalnych treści obecnych w płynie BAL.Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania innych substancji mikrobiologicznych obecnych w alergenach środowiskowych, takich jak niedwuniciowe czynniki RNA, które mogą regulować rozwój alergicznego zapalenia płuc.

identification-characterization-immunogenic-rna-species-hdm-allergens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wielokrotne pomiary fizjologii układu oddechowego gryzoni oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych są pożądane, lecz zazwyczaj niewykonalne. W niniejszym materiale opisujemy powtarzalną metodę intubacji doustnej myszy, która umożliwia wielokrotne pomiary nadreaktywności dróg oddechowych oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych.

Odwracalna, nieinwazyjna metoda pomiaru oporu dróg oddechowych i pobierania płynu z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego u myszy

Eksperymentalne modele mysie astmy alergicznej oferują nowe możliwości badania patogenezy choroby oraz opracowywania nowych terapii. Modele te są odpowiednie do pomiaru czynników kontrolujących alergiczną odpowiedź immunologiczną, zapalenie dróg oddechowych i patofizjologię płuc.

Mysi model astmy indukowanej alergenem

Opisujemy strategię monitorowania dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc w odpowiedzi na owalbuminę w warunkach wywołanego owalbuminą alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych. Strategię tę można zmodyfikować w celu oceny migracji komórek dendrytycznych płuc w warunkach infekcji.

Analiza dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych w płucach podczas alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych

Ten film demonstruje protokół wykrywania specyficznej dla surowicy immunoglobuliny E za pomocą systemu chemiluminescencji opartego na kartridżu mikroprzepływowym. IgE w surowicy oddziałują z odrębnymi alergenami unieruchomionymi w strefie reakcji wkładu, które są następnie wykrywane za pomocą przeciwciał anty-IgE sprzężonych z peroksydazą i substratu chemiluminescencyjnego, co pozwala na jednoczesne wykrywanie wielu IgE specyficznych dla alergenu.

Oparty na kartridżu mikroprzepływowym system wykrywania swoistej dla alergenu E immunoglobuliny E

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Czynniki epigenetyczne mogą wchodzić w interakcje z programami genetycznymi, aby modulować ekspresję genów i regulować funkcję komórek B. Łącząc stymulację komórek B in vitro, qRT-PCR oraz wysokoprzepustowe sekwencje mikroRNA i sekwencje mRNA, możemy analizować epigenetyczną modulację miRNA i ekspresję genów w komórkach B.

Analiza całego genomu modulacji mikroRNA i mRNA za pośrednictwem inhibitora HDAC w komórkach B indukowanych do rekombinacji DNA ze zmianą klasy i różnicowania komórek plazmatycznych

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Tutaj prezentujemy test uwalniania mediatora, wykorzystujący linię komórkową białaczki bazofilowej szczura transfekowaną ludzkim receptorem IgE, aby symulować degranulację komórek efektorowych zwykle obserwowaną w reakcjach alergicznych typu 1. Metoda ta bada aktywność biologiczną alergenów w sposób wysoce czuły, powtarzalny i dostosowany do potrzeb.

Humanizowany test uwalniania mediatora jako odczyt siły działania alergenów

W tym badaniu prezentujemy skuteczny i powtarzalny protokół izolowania populacji immunologicznych mysiego układu oddechowego. Zapewniamy również metodę identyfikacji wszystkich wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które znajdują się w płucach zdrowych myszy, przy użyciu 9-kolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej w celu identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych płuc myszy

Przedstawiono protokół przeprowadzania wyzwania w komorze do ekspozycji na alergeny (AEC). Udowodniono, że AEC są bezpiecznymi i skutecznymi narzędziami do wywoływania objawów alergicznych lub jako punkt końcowy w testowaniu skuteczności immunoterapii alergenowej ze względu na ich zdolność do utrzymywania stabilnych stężeń cząstek i warunków środowiskowych.

Ocena objawów u pacjentów z alergicznym nieżytem nosa przy użyciu komory do ekspozycji na alergeny

Ten protokół opisuje wielobarwną technikę immunofluorescencji do oceny szczurzego modelu alergicznego nieżytu nosa.

Znakowanie immunofluorescencyjne w skrawkach tkanki błony śluzowej nosa alergicznych szczurów z nieżytem nosa za pomocą wielokolorowego testu immunologicznego

Poznaj metody identyfikacji dwuniciowego RNA w alergenach roztoczy kurzu domowego i jego wpływ na eozynofilowe zapalenie płuc u myszy. Protokół obejmuje izolację RNA, analizę dot blot i cytometrię przepływową.

Identyfikacja i charakterystyka immunogennych gatunków RNA w alergenach HDM, które modulują eozynofilowe zapalenie płuc

Przeglądaj więcej filmów