Identyfikacja i charakterystyka immunogennych gatunków RNA w alergenach HDM, które modulują eozynofilowe zapalenie płuc

Protokół ten został opracowany w celu rozwiązania bardzo ważnej i nierozwiązanej kwestii, w jaki sposób obecne substancje mikrobiologiczne i alergeny środowiskowe mogą regulować rozwój alergicznego stanu zapalnego. W szczególności przedstawione tutaj metody mogą pomóc odpowiedzieć na pytanie, czy dwuniciowe gatunki RNA w roztoczach kurzu domowego są immunogenne in vivo i są w stanie modulować eozynofilowe zapalenie płuc. Głównymi zaletami tych technik jest to, że są proste, wydajne, wysoce powtarzalne i mogą być wykonywane przy użyciu powszechnie używanych narzędzi i sprzętu.

Metody te można również wykorzystać do oceny chorób płuc spowodowanych infekcjami wirusowymi dróg oddechowych. Li She, doktorantka w moim laboratorium, pomoże zademonstrować tę procedurę. Zacznij od wyizolowania całkowitego RNA z alergenów, owadów i alergenów innych niż owady.

Przenieś odpowiednią ilość próbki do dwumililitrowej probówki zawierającej 1,4 milimetra kulek ceramicznych i zamroź probówki w pojemniku z ciekłym azotem na około 10 minut. Dodaj jeden mililitr odczynnika do izolacji RNA na bazie tiocyjanianu guanidyny do każdej probówki. Następnie rozbij małe zwierzęta owadzie i inne za pomocą wysokoenergetycznego zakłócacza ogniw z maksymalną prędkością przez 45 sekund.

Schłodzić próbkę na lodzie i powtórzyć ten proces dwukrotnie. Przenieś roztwór do nowej 1,5-mililitrowej probówki. Dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do każdej probówki i zwiruj próbkę.

Odwirować probówki z prędkością 14 000 g przez 14 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieś górną fazę wodną do nowej probówki zawierającej 500 mikrolitrów izopropanolu. Wymieszać próbkę.

Następnie odwiruj go w temperaturze 14 000 g przez 14 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie zassać supernatant. Następnie przemyj osad RNA 500 mikrolitrami 75% etanolu i odwiruj go z prędkością 7 500 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ostrożnie usuń cały płyn. Wysuszyć osad na powietrzu i rozpuścić RNA w 20 do 50 mikrolitrach wody wolnej od RNaz. Aby wykryć dwuniciowe struktury RNA w całkowitym RNA, umieść dwa mikrolitry próbki RNA o natężeniu 200 nanogramów na mikrolitr na dodatnio naładowanej membranie nylonowej.

Sieciować próbki z membraną w proporcji 1 200 mikrodżuli na 100 w sieciowniku UV. Powtórz plamienie i sieciowanie jeszcze dwa razy, co da w sumie 1,2 mikrograma RNA na plamę. Zablokuj niespecyficzne wiązanie z 5% mlekiem w TBS-T przez godzinę, wstrząsając w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń roztwór blokujący i dodaj przeciwciało anty-dwuniciowe RNA J2 w rozcieńczeniu jeden do 1 000 w 1% mleku w TBS-T. Inkubować błonę przez noc, wstrząsając w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj membranę trzykrotnie TBS-T przez pięć minut na pranie.

Dodać przeciwciało drugorzędowe i inkubować błonę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz pranie za pomocą TBS-T. Dodaj substrat i inkubuj membranę przez pięć do 15 minut, aż pojawi się pożądany sygnał.

Zatrzymaj reakcję, przepłukując membranę wodą podwójnie destylowaną. Aby pobrać próbki płuc, umieść płuca na bibułkach i wytnij jeden mały kawałek każdego płata płuca. Umieść każdy kawałek w dwumililitrowej tubie zawierającej koraliki.

Aby zebrać płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, zdezynfekuj uśpioną mysz 70% etanolem i użyj nożyczek, aby przeciąć skórę od górnej części brzucha do szyi. Delikatnie rozsuń gruczoły ślinowe i mięsień mostkowo-gnykowy kleszczami, aby odsłonić tchawicę. Następnie umieść pod nim nylonowy sznurek.

Wykonaj nacięcie w tchawicy około dwóch mililitrów pod krtanią, na tyle, aby wprowadzić kaniulę i zawiązać sznurek wokół tchawicy i kaniuli. Podłącz strzykawkę do końca kaniuli i załaduj ją świeżym PBS-EDTA. Następnie wstrzyknąć i odessać jeden mililitr roztworu do płuc.

Odłącz strzykawkę od kaniuli i wyrzuć roztwór do 15-mililitrowej probówki. Powtórz ten proces, aby zamrozić świeżym PBS-EDTA i zebrać płuczkę. Odwirować probówkę o ciśnieniu 500 g przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie zapisz objętość i przenieś supernatant do dwóch 1,5-mililitrowych probówek bez naruszania osadu. Po ponownym zawieszeniu osadu przenieś 150 mikrolitrów do płytki 96-dołkowej i odwiruj płytkę przez siedem minut w temperaturze 500 razy g i czterech stopniach Celsjusza. Następnie szybko odwróć płytkę na bibułce, aby usunąć supernatant.

Wybarwić komórki przeciwciałami w buforze FACS w obecności przeciwciała blokującego 2,4G2 i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Po zabarwieniu odwirować płytkę, aby granulować komórki w temperaturze 500 razy g przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń roztwór barwiący, odwracając płytkę na bibułce.

Dodaj 100 mikrolitrów buforu FACS, aby umyć komórki, a następnie powtórzyć wirowanie. Ponownie zawiesić próbki w 150 mikrolitrach buforu FACS, a następnie przenieść je do probówek FACS zawierających dodatkowe 350 mikrolitrów buforu. Dodaj 25 mikrolitrów kulek liczących do każdej próbki i przystąp do analizy cytometrii przepływowej.

Obecność długich, dwuniciowych struktur RNA w roztoczach kurzu domowego, owadach i małych zwierzętach niebędących owadami zbadano za pomocą dot blot przy użyciu dwuniciowego, specyficznego dla RNA mysiego przeciwciała monoklonalnego. RNaza III została użyta do trawienia dwuniciowego RNA na 12 do 15 fragmentów par zasad, które były niewykrywalne przez J2. Zdolność całkowitego RNA roztoczy kurzu domowego do stymulowania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w płucach myszy wykazano za pomocą RT-qPCR. Leczenie RNazą III zniosło immunostymulującą aktywność całkowitego RNA roztoczy kurzu domowego, co wskazuje, że dwuniciowe struktury RNA są niezbędne dla wrodzonej aktywności immunologicznej w płucach.

Hamujący wpływ całkowitego RNA roztoczy kurzu domowego na rozwój ciężkiego zapalenia płuc typu drugiego oceniano za pomocą analizy FACS. Eozynofilowe zapalenie płuc zostało wywołane przez ekstrakty z roztoczy kurzu domowego, które leczono RNazą III lub bez niej. Degradacja długich, dwuniciowych gatunków RNA spowodowała ciężkie zapalenie płuc typu drugiego, odzwierciedlone zwiększoną liczbą eozynofili w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych i płucach.

Warto zauważyć, że liczba eozynofili w grupie traktowanej całkowitym RNA roztoczy kurzu domowego jest porównywalna z grupą traktowaną oryginalnym ekstraktem z roztoczy kurzu domowego, który endogennie zawierał długie dwuniciowe gatunki RNA. Podczas próby zastosowania tego protokołu należy zachować szczególną ostrożność podczas wstrzykiwania i pobierania płynu BAL, ponieważ jakiekolwiek uszkodzenie płuc na tym etapie może zmienić końcowe wyniki. Oprócz tej procedury można wykonać inne metody, takie jak ELISA, w celu analizy niekomórkowych rozpuszczalnych treści obecnych w płynie BAL.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania innych substancji mikrobiologicznych obecnych w alergenach środowiskowych, takich jak niedwuniciowe czynniki RNA, które mogą regulować rozwój alergicznego zapalenia płuc.