Name: Wysokoprzepustowe testy krytycznych limitów termicznych u owadów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowe metody oceny krytycznych limitów termicznych u owadów z wykorzystaniem Drosophila. Techniki pomiaru minimalnej temperatury krytycznej i czasu upadku cieplnego pozwalają na szybką analizę tolerancji termicznej w kontekście zmian klimatu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Ellie McCabe za pomoc w hodowli much. Praca ta jest wspierana przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych Narodowy Instytut Żywności i Rolnictwa Hatch Project grant 1010996 oraz grant National Science Foundation OIA-1826689 dla NMT.

1. Wysokoprzepustowy test CTmin
<ol>
	<li>Montaż kolumny z płaszczem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A, <silna klasa="xfig">Rysunek 2)
	<ol>
		<li>Najszerszą (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) i najwęższą (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) rurki akrylowe przytnij na równe długości (31,5 cm) za pomocą piły do metalu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Te dwie rurki będą zewnętrznymi i najbardziej wewnętrznymi ścianami kolumny z płaszczem.</li>
		<li>Wytnij dwa pierścienie (o szerokości 2 cm) ze średniej wielkości (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) akrylowej rurki za pomocą piły do metalu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Te dwa pierścienie będą przekładkami między wewnętrzną i zewnętrzną rurką, tworząc przestrzeń między dwiema długimi rurkami akrylowymi, aby mógł przepływać płyn.</li>
		<li>Ostrożnie wywierć dwa otwory w zewnętrznej (najszerszej) rurce akrylowej, jeden otwór u góry i jeden na dole. Upewnij się, że każdy otwór znajduje się 3.5 cm od końca rurki. Wywierć otwory po przeciwnych stronach rury (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
		<li>Aby zmniejszyć pękanie, umieść taśmę na rurze nad miejscem przyszłego otworu i wierc bardzo powoli przy najniższym ustawieniu momentu obrotowego wiertła.</li>
		<li>Za pomocą gwintownika nagwintuj oba otwory, tak aby adaptery węża można było wkręcić w dwa otwory rury zewnętrznej. Aby zmniejszyć pękanie, użyj smaru i powoli nawlekaj ręcznie.</li>
		<li>Wsuń dwie przekładki na płaszcz wewnętrzny, po jednej na każdym końcu (na dole i na górze). Pozostaw niewielką przestrzeń (0,5 cm) między przekładką a końcem wewnętrznej kurtki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>Przyspawaj przekładki na miejsce za pomocą cementu akrylowego.</li>
		<li>Po ustawieniu cementu na rurze wewnętrznej i przekładkach, wsuń tę konstrukcję do większej rury zewnętrznej z otworami. Upewnij się, że rurki zewnętrzne i wewnętrzne są wyrównane na obu końcach. Przekładki będą znajdować się 0,5 cm od końca, tworząc małe rowy na obu końcach kolumny (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Przyspawaj rurkę zewnętrzną do przekładek za pomocą cementu akrylowego, używając regulowanych stalowych zacisków do trzymania aparatu razem. Poczekaj, aż cement stwardnieje.</li>
		<li>Wkręć adaptery węża w otwory rury zewnętrznej, teraz przymocowane do przekładek i rurki wewnętrznej. 
		UWAGA: Adaptery powinny być wkręcane tylko w rurkę zewnętrzną, a nie w otwartą przestrzeń między rurkami wewnętrznymi i zewnętrznymi. Jeśli adaptery węży wkręcają się zbyt głęboko, skróć je do odpowiedniej długości za pomocą piły do metalu.</li>
		<li>Uszczelnij adaptery węży w ich gwintach na rurze zewnętrznej za pomocą uszczelniacza silikonowego.</li>
		<li>Wypełnij dwa rowy między wewnętrzną i zewnętrzną rurą na obu końcach kolumny z płaszczem szczeliwem silikonowym.</li>
		<li>Aby przetestować kolumnę, przymocuj rurkę o średnicy 0,6 cm do adapterów węży. Podłącz adapter na dole kolumny do źródła wody z rurką, a adapter na górze kolumny do odpływu z innym kawałkiem rurki.</li>
		<li>Przepuść wodę przez urządzenie od dołu do góry i sprawdź, czy nie ma wycieków. Jeśli są nieszczelności, określ, skąd pochodzą i uszczelnij silikonem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja kolumny z płaszczem i monitora lejka Drosophila (DFM)
	<ol>
		<li>Przymocuj kolumnę z płaszczem do stojaka retortowego za pomocą zacisku retortowego z trzema bolcami. Ustaw kolumnę pionowo tak, aby jeden koniec był otwarty do sufitu, a drugi otwarty na stół laboratoryjny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Podłącz wejście i wyjście płynu z kąpieli chłodniczej o kontrolowanej temperaturze do dysz adaptera kolumny za pomocą plastikowej rurki o średnicy 0.6 cm (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B). Podłącz dopływ płynu do dyszy na dole kolumny, a wylot płynu do dyszy na górze kolumny.</li>
		<li>Wytnij dwie okrągłe zaślepki izolacyjne z pianki o grubości 3 cm (taki sam obwód jak otwór najbardziej wewnętrznej komory kolumny). Upewnij się, że zaślepki są dobrze dopasowane i uszczelnij najbardziej wewnętrzną kolumnę po włożeniu na obu końcach (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
		<li>Przebij otwór przez środek jednej z zatyczek i przeciągnij goły koniec termopary przez otwór na około 5 cm i zabezpiecz taśmą. Podłącz drugi koniec termopary do rejestratora danych termopary.</li>
		<li>Podłącz rejestrator danych termopary do komputera.</li>
		<li>Wciśnij dwa kawałki plastikowej osłony rynny (5 cm x 7 cm, z otworami o średnicy ~0,5 cm) wewnątrz kolumny, aby służyły jako materiał do żerowania. Umieść jeden kawałek osłony w odległości 2/3 od góry kolumny, a drugi w 1/3 od szczytu kolumny (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 B).</li>
		<li>Zabezpiecz dolną zaślepkę (bez termopary) i górną zatyczkę (z termoparą). Gdy wtyczka jest włożona w górnej części kolumny, upewnij się, że termopara nie dotyka boków kolumny.</li>
		<li>Wyreguluj wysokość kolumny na stojaku retortowym tak, aby odległość między dolną częścią kolumny a blatem wynosiła 25 cm.</li>
		<li>Przymocuj pierścień retorty (o średnicy 5 cm) do stojaka retorty 5 cm poniżej dna kolumny i obróć pierścień na bok kolumny.</li>
		<li>Ustaw DFM bezpośrednio na pierścieniu retorty (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Podłącz wszystkie elementy elektroniczne: zasilacz, interfejs zasilacza i komputer zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Po podłączeniu komponentów postępuj zgodnie z protokołem producenta, aby zakończyć konfigurację DFM i oprogramowania DFM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TestCT min
	<ol>
		<li>Przekręć zawory wejściowe i wyjściowe kąpieli płynowej do pozycji otwartej.</li>
		<li>Naciśnij przycisk zasilania, aby włączyć kąpiel płynową z kontrolowaną temperaturą, a następnie naciśnij przycisk odtwarzania, aby uruchomić program podnoszący i utrzymujący temperaturę kąpieli do 25 °C. Daj kąpieli płynowej i kolumnie 5-10 minut, aby osiągnęły i utrzymały 25 °C.</li>
		<li>Wyjmij korek z górnej części kolumny i zastąp go lejkiem (średnica 5,08 cm; patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>Wklepuj muchy z fiolki z jedzeniem do kolumny.</li>
		<li>Wyjmij lejek i szybko zastąp go górną zatyczką, uważając, aby muchy nie uciekły. Daj muchom 5 minut na uspokojenie się, od czasu do czasu stukając w dolną zatyczkę, aby zachęcić muchy do wspinania się.</li>
		<li>Nacisnąć przycisk start na kąpieli płynowej i rozpocząć program obniżania prędkości CT min (25 °C przez 5 min; 25 °C do 10 °C przy 0,5 °C/min; 10 °C przez 2 min; następnie 10 °C do -10 °C przy 0,25 °C/min). 
		UWAGA: Inne warianty tego protokołu minimalnego narastania CT mogą być używane w zależności od pytania badawczego (np. porównania wpływu różnych szybkości narastania na CTmin28).</li>
		<li>Kliknij otwórz oprogramowanie do nagrywania termopar na komputerze, a następnie kliknij ikonę Nagrywaj, aby rozpocząć rejestrowanie temperatury wewnątrz kolumny co sekundę przez czas trwania testu. Upewnij się, że każdy zapis temperatury zawiera znacznik czasu specyficzny dla sekundy, tak aby dane dotyczące temperatury mogły być później połączone z danymi z DFM.</li>
		<li>Dodaj 5 ml 90% etanolu do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i umieść ją w stojaku pod kolumną.</li>
		<li>Od czasu do czasu dotknij dolnej wtyczki kolumny, aby zwabić muchy na dnie do wspinaczki. Większość much będzie znajdować się na grzędzie lub w pobliżu szczytu kolumny w temperaturze 15 °C.</li>
		<li>W temperaturze 15 °C wyjąć dolną zatyczkę i zebrać w etanolu wszelkie muchy znajdujące się jeszcze na dolnym korku. Policz i zwróć uwagę, że te muchy zostały zebrane w temperaturze 15 °C, ale ichmin CT jest nieznany. 
		UWAGA: Temperatura, w której usuwa się dolną zatyczkę, powinna zostać ustalona przed badaniem i na podstawie przewidywanejmin. CT badanego gatunku lub zabiegu. Do tego testu wybrano 15 °C na podstawiemin CT tych konkretnych linii DGRP znalezionych w testach wstępnych.</li>
		<li>Umieść szklany lejek o średnicy zewnętrznej 75 mm w DFM. Wyreguluj pierścień retorty, DFM i lejek tak, aby znajdowały się pod kolumną. Upewnij się, że krawędź lejka całkowicie uszczelnia dno kolumny (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
		<li>Włóż dolną część lejka do probówki zbiorczej o pojemności 15 ml (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie DFM na komputerze, klikając ikonę Oprogramowanie. Oprogramowanie natychmiast rozpocznie rejestrowanie godziny/daty, w której muchy osiągająmin. Muchy, które osiągnąmin. CT, tracą funkcję nerwowo-mięśniową i spadają z grzęd, a następnie przez DFM.</li>
		<li>Monitoruj, czy wszystkie muchy osiągnęłymin. CT min, gdy temperatura spada, sprawdzając górną zatyczkę i grzędy, aby zobaczyć, czy jakieś muchy nadal siedzą (tj. nadal zachowują funkcję nerwowo-mięśniową). Próba kończy się, gdy wszystkie muchy osiągnąmin.</li>
		<li>Pod koniec próby wyreguluj DFM i odsuń lejek od otworu kolumny. Niektóre muchy mogą osiągnąćswój CT min, ale pozostają utknięte w kolumnie (tj. zaklinowane w grzędzie lub zwisające z pojedynczym hakiem stępu). Otwórz górną wtyczkę i usuń te muchy. Minuta tomografii komputerowej tych much nie jest znana.</li>
		<li>Połącz .txt pliki wyjściowe z oprogramowania do rejestrowania termopar (tj. temperatura, data i godzina) oraz oprogramowanie DFM (tj. liczba much przez lejek, data i godzina) za pomocą polecenia Scal w programie RStudio. Scal te dwa pliki na podstawie udostępnionej zmiennej daty/godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wysokoprzepustowy test cieplny KD
<ol>
	<li>Montaż i przygotowanie aparatury
	<ol>
		<li>Za pomocą kleju przymocuj stalową plecioną siatkę drucianą (otwór ~ 1,5 mm) do dna 96-dołkowej płyty bez dna.</li>
		<li>Przymocuj magnesy do przeciwległych stron dna 96-dołkowej płytki bez dna za pomocą pistoletu do klejenia na gorąco i kleju na gorąco (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3).</li>
		<li>Aby stworzyć niestandardową pokrywę przegrody nosowej z folią samoprzylepną przeznaczoną do płytek 96-dołkowych, sklej ze sobą dwie lepkie strony folii, aby utworzyć prążkowany arkusz z tworzywa sztucznego.</li>
		<li>Umieść plastikowe arkusze na płytce 96-dołkowej i użyj taśmy, aby przykleić ją ze wszystkich czterech stron płytki. Nad otworem do każdego dołka na talerzu wytnij "x" w plastikowym arkuszu za pomocą noża do pudełek (tj. łącznie 96 x).</li>
		<li>Znieczulij muchy CO2 i załaduj je pojedynczo do każdej studzienki zmodyfikowanej 96-dołkowej płytki bez dna z aspiratorem i pokrywą przegrody. Zdejmij pokrywę przegrody z płytki 96-dołkowej, podczas gdy muchy są znieczulane CO2 i zastąp ją ciasno dopasowaną przezroczystą pokrywką.</li>
		<li>Umieść 96-dołkową płytkę bez dna załadowaną muchami i przezroczystą, szczelnie przylegającą pokrywką na żywności. Upewnij się, że muchy mają co najmniej 48 godzin między znieczuleniem CO2 a rozpoczęciem testu (kroki 2.2.1-2.2.5). 
		UWAGA: Dno zmodyfikowanych 96-dołkowych płytek bez dna jest wykonane z siatki, więc muchy znieczulone CO2 można załadować i pozostawić na pokarmie na co najmniej 48 godzin przed rozpoczęciem próby. Można użyć dowolnego plastikowego pojemnika >8,5 cm szerokości x 13 cm długości, który ma co najmniej 2 cm głębokości, aby pomieścić warstwę żywności o głębokości 1 cm.</li>
		<li>Przymocuj kamerę internetową do dolnej części wnętrza inkubatora z kontrolowaną temperaturą za pomocą taśmy. Skieruj kamerę bezpośrednio do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Zamocuj półkę inkubatora około 10 cm nad kamerą. 
		UWAGA: Kamera internetowa jest skierowana w górę i rejestruje płytkę 96 dołków od dołu, aby upewnić się, że jak największa część powierzchni studni jest widoczna (np. nie jest zasłonięta przed widokiem przez ścianki studni płyty). Kiedy muchy docierają do swojego KDT, spadają na dno studni; W tym przypadku strona najbliżej kamery internetowej, a zatem są w polu widzenia, niezależnie od tego, jak daleko od środka widzenia znajduje się ich studnia.</li>
		<li>Podłącz kamerę internetową do komputera.</li>
		<li>Za pomocą taśmy przymocuj białą kartkę papieru (8,5 cm x 13 cm; dokładna powierzchnia dna płytki 96-dołkowej) do dolnej części półki (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Upewnij się, że papier wypełnia całą ramkę, gdy jest viewed przez kamerę internetową.</li>
		<li>Umieść źródło światła w inkubatorze. Użyj papieru lub innych materiałów, aby wytłumić oświetlenie i zminimalizować odblaski. 
		UWAGA: Krok 2.1.10 jest specyficzny dla każdego inkubatora, ponieważ oświetlenie i odbicia różnią się w zależności od inkubatora. Celem jest zapewnienie wystarczającego oświetlenia w inkubatorze, aby zapewnić dobry kontrast między muchami w każdej studzience a białą kartką papieru za płytą podczas oglądania przez kamerę internetową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie testu ciepła KD
	<ol>
		<li>Ustaw inkubator na 37,5 °C i odczekaj około 30 minut, aby dać inkubatorowi czas na osiągnięcie i utrzymanie żądanej temperatury. Dokładna temperatura będzie zależeć od ocenianego owada i wszelkich innych czynników czasowych.</li>
		<li>Umieść odwróconą do góry nogami 96-dołkową płytkę w inkubatorze tak, aby spód płytki (strona siatki) przylegał do białego papieru na dnie tacy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4). Zwróć uwagę na orientację studzienek (nazwy kolumn i wierszy) na tacy i w ramce kamery internetowej. Kolorowa taśma wzdłuż boków płytki 96-dołkowej i krawędzi białej kartki papieru może zweryfikować orientację (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4). 
		UWAGA: Upewnij się, że temperatura inkubatora jest zgodna z temperaturą wewnątrz płytki 96-dołkowej, rejestrując temperaturę wewnątrz płytki za pomocą termopary podczas próby testowej testu ciepła KD. Rozsądne jest również sprawdzenie, czy istnieje znikoma różnica temperatury między studzienkami płytki 96-dołkowej z wieloma termoparami przed przeprowadzeniem testu ciepła KD.</li>
		<li>Zamknij drzwi inkubatora.</li>
		<li>Kliknij Nagrywaj w oprogramowaniu do nagrywania wideo.</li>
		<li>Po 2 godzinach sprawdź nagranie, aby zobaczyć, czy wszystkie muchy osiągnęły swoje ostateczne miejsce spoczynku i przestały się poruszać. Gdy wszystkie muchy przestaną się poruszać, kliknij Stop w oprogramowaniu do nagrywania wideo. W przypadku badanych tutaj genotypów, hodowanych w temperaturze 25 °C, większość much osiąga KDT w ciągu 60 minut w temperaturze 37,5 °C (patrz również Jørgensen et al.9).</li>
		<li>Pozbądź się much.</li>
		<li>Użyj niestandardowych skryptów Pythona (Supplementary Coding Files 1-3), aby przybliżyć czas w filmie, kiedy muchy osiągają ruję KDT. 
		UWAGA: Krok 2.2.7 jest opcjonalny. Aby przyspieszyć analizę wideo, opracowano zestaw niestandardowych skryptów Pythona do pomiaru zmian gęstości pikseli w czasie w każdym dołku (patrz Dodatkowy plik kodowania). Kiedy muchy przestają się poruszać, gęstość pikseli jest stała, a wykres tych danych można wykorzystać do zlokalizowania przybliżonego czasu w filmie, w którym muchy są powalające. Chociaż możliwe jest użycie tego skryptu do zautomatyzowania analizy danych, obecnie niewielkie niedoskonałości w filmie prowadzą do drobnych rozbieżności między zmianami gęstości pikseli a prawdziwym czasem KD.</li>
		<li>Kliknij otwórz plik wideo i nagraj KDT każdej muchy w każdym dołku. Najbardziej spójną miarą ciepła KDT między próbami a obserwatorami jest rejestrowanie czasu, w którym mucha osiąga swoje ostateczne miejsce spoczynku.</li>
		<li>Śledź wideo w odwrotnej kolejności, skupiając się na pojedynczym dołku i notując czas, w którym mucha po raz pierwszy oddala się od swojego ostatniego miejsca spoczynku. Powtórz ten proces dla każdej studzienki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+variation%2C+thermal+extremes+and+the+physiological+performance+of+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals.</a> Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).</li>
<li>Angilletta, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAngilletta%2C+MJ+%22Thermal+Adaptation%3A+A+Theoretical+and+Empirical+Synthesis%22">Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis</a>. , New York, NY. (2009).</li>
<li>Coumou, D., Rahms Torf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+weather+extremes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Climate+Change%22%5BJournal%5D)">A decade of weather extremes.</a> Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).</li>
<li>Wang, G., Dillon, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+geographic+convergence+in+diurnal+and+annual+temperature+cycling+flattens+global+thermal+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Climate+Change%22%5BJournal%5D)">Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles.</a> Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).</li>
<li>MacMillan, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+cause+from+consequence%3A+A+systematic+approach+to+thermal+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits.</a> Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593(2019).</li>
<li>Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+invitation+to+measure+insect+cold+tolerance%3A+Methods%2C+approaches%2C+and+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow.</a> Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).</li>
<li>Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+thermal+maximum%3A+History+and+critique%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">The critical thermal maximum: History and critique.</a> Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).</li>
<li>Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unifying+indices+of+heat+tolerance+in+ectotherms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Unifying indices of heat tolerance in ectotherms.</a> Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).</li>
<li>Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+assess+Drosophila+heat+tolerance%3A+Unifying+static+and+dynamic+tolerance+assays+to+predict+heat+distribution+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Ecology%22%5BJournal%5D)">How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits.</a> Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).</li>
<li>Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+rapid+measurement+of+thermal+tolerance+traits+in+studies+of+small+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Entomology%22%5BJournal%5D)">A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects.</a> Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).</li>
<li>Andersen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+assess+Drosophila+cold+tolerance%3A+Chill+coma+temperature+and+lower+lethal+temperature+are+the+best+predictors+of+cold+distribution+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Ecology%22%5BJournal%5D)">How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits.</a> Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).</li>
<li>Hu, X. P., Appel, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+variation+of+critical+thermal+limits+and+temperature+tolerance+in+Formosan+and+eastern+subterranean+termites+%28Isoptera%3A+Rhinotermitidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae).</a> Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).</li>
<li>Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+for+tolerance+to+high+temperatures+in+a+population+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster.</a> Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).</li>
<li>Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+thermal+ramping+assays+used+to+assess+thermal+tolerance+in+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods.</a> PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).</li>
<li>Klok, C. J., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+thermal+limits%2C+temperature+tolerance+and+water+balance+of+a+sub-Antarctic+kelp+fly%2C+Paractora+dreuxi+%28Lepidoptera%3A+Tineidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae).</a> Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).</li>
<li>Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+thermal+limits%3A+Non-linear+reaction+norms+drive+disparate+thermal+acclimation+responses+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946(2019).</li>
<li>Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+acclimation+temperature+on+thermal+activity+thresholds+in+polar+terrestrial+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).</li>
<li>MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+gut+in+insect+chilling+injury%3A+Cold-Induced+disruption+of+osmoregulation+in+the+fall+field+cricket%2C+Gryllus+pennsylvanicus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).</li>
<li>Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+measurement+of+heat+or+cold+resistance+of+small+insects%5BTitle%5D)+AND+%22British+Ecological+Society%22%5BJournal%5D)">A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects.</a> British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).</li>
<li>Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+maternal+variation+for+heat+resistance+in+drosophila+from+the+field%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field.</a> Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).</li>
<li>Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+chill-coma+onset+and+recovery+at+the+extremes+of+the+thermal+window+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Biochemical+Zoology%22%5BJournal%5D)">The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).</li>
<li>Sørensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+of+the+heat+hardening+response+in+an+Arctic+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect.</a> Biology Letters. 15 (10), (2019).</li>
<li>Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-based+electronic+fall-through+probe+insect+counter+for+monitoring+infestation+in+stored+products%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Society+of+Agricultural+Engineers%22%5BJournal%5D)">A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products.</a> Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).</li>
<li>MacKay, T. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel.</a> Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+laboratory+handbook%22">Drosophila: A laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).</li>
<li>Garcia, M. J., Teets, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+stress+results+in+sustained+locomotor+and+behavioral+deficits+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology+Part+A%3A+Ecological+and+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).</li>
<li>Teets, N. M., Hahn, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+the+shape+of+cold-survival+curves+in+a+single+fly+population+suggests+potential+for+selection+from+climate+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability.</a> Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).</li>
<li>Kelty, J. D., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+rapid+cold+hardening+by+cooling+at+ecologically+relevant+rates+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).</li>
<li>MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+insect+chill-coma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying insect chill-coma.</a> Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).</li>
<li>Salachan, P. V., Sørensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+thermal+limits+affected+differently+by+developmental+and+adult+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).</li>
<li>Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+robust+sex-specific+trade-off+between+cold+resistance+and+starvation+resistance+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).</li>
<li>Kelty, J. D., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cold-hardening+of+Drosophila+melanogaster+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29+during+ecologically+based+thermoperiodic+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles.</a> Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).</li>
<li>Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insects+at+low+temperatures%3A+An+ecological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Insects at low temperatures: An ecological perspective.</a> Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dwie opisane powyżej metody generują dane o wysokiej przepustowości z ekologicznie istotnymi wskaźnikami dla górnych i dolnych limitów termicznych. Protokoły te opierają się na wcześniej ustalonych metodologiach wspólnych dla badań nad limitami termicznymi owadów (podsumowanych w Sinclair i wsp.)6. Oba protokoły można ukończyć w krótkim czasie (~ 2 godziny każdy), tworzyć zestawy danych o dużych rozmiarach próbek, nie poświęcać powtarzalności ani dokładności oraz minimalizować błąd eksperyme...

Limity termiczne owadów 
Zmienność warunków środowiskowych, w tym temperatury, jest głównym czynnikiem wpływającym na wydajność, przydatność, przetrwanie i rozmieszczenie geograficzne organizmów1,2. Górne i dolne limity termiczne określają teoretyczny zakres środowisk, które organizm może tolerować, a zatem limity te są ważnymi predyktorami rozmieszczenia roślin i zwierząt, zwłaszcza w obliczu zmian klimatycznych3,4. Dlatego protokoły do dokładnego pomiaru limitów termicznych są ważnymi narzędziami między innymi dla ekologów, fizjologów, biologów ewolucyjnych i biologów zajmujących się ochroną przyrody.
Jako najliczniejsze i najbardziej różnorodne zwierzęta lądowe, owady są często używane do pomiarów limitów termicznych. Krytyczne maksima termiczne (CTmax) i krytyczne minima termiczne (CTmin) są powszechnie używane do oceny wewnątrz- i międzygatunkowej zmienności tolerancji termicznej5,6,7. Podczas gdy CTmax i CTmin mogą być mierzone dla wielu fenotypów, w tym wzrostu, wydajności reprodukcyjnej i zachowania, najczęściej stosuje się je do funkcji lokomotorycznych5,6,7. Tak więcCT max (zwana również temperaturą powalenia cieplnego) i CTmin są często definiowane jako wysokie i niskie temperatury, w których owady tracą funkcje motoryczne i nie są w stanie utrzymać się w pozycji pionowej5,6,7,8,9,10,11. CT min zbiega się z początkiem śpiączki chłodnej, odwracalnego paraliżu spowodowanego niskimi temperaturami6. Podczas gdy paraliż na granicach termicznych jest często odwracalny, ciągłe narażenie na te temperatury prowadzi do śmierci ekologicznej5.
Popularne metody pomiaru granic termicznych 
Do pomiaru granic termicznych użyto różnych aparatów (podsumowanych w Sinclair i wsp.)6. Krótko mówiąc, owady są ogrzewane lub chłodzone w inkubatorach12,13, pojemniki zanurzone w kąpielach płynnych11,14,15,16, aluminiowe bloki10,17, lub kontenery z płaszczem18i monitorowane do momentu ustania lokomocji. Najpopularniejszą metodą monitorowania owadów podczas testu jest obserwacja bezpośrednia, w której poszczególne osoby są stale monitorowane w czasie rzeczywistym lub retrospektywnie za pomocą nagranego wideo6,9,10,11,15,17. Chociaż metody obserwacji bezpośredniej mają minimalne wymagania sprzętowe, są pracochłonne i ograniczają przepustowość. Alternatywnie, owady można obserwować pośrednio, zbierając osobniki w dyskretnych momentach, gdy spadają z grzęd6,19,20,21 lub za pomocą monitorów aktywności13.
Pośrednie metody pomiaru limitów termicznych są zazwyczaj bardziej wydajne i potencjalnie mniej podatne na błędy niż metody bezpośredniej obserwacji. Najpopularniejsza metoda monitorowania pośredniego wykorzystuje kolumnę z płaszczem kontrolowanym temperaturą6,8,19,20,21. Owady umieszcza się wewnątrz kolumny z grzędami, a temperatura wewnętrznej komory jest kontrolowana przez pompowanie płynu z kąpieli płynowej o kontrolowanej temperaturze przez osłonę kolumny. Osobniki, które osiągną limit termiczny, spadają z grzędy i są zbierane w dyskretnych temperaturach lub odstępach czasu. Chociaż ta metoda działa dobrze w przypadku CTmin, stwierdzono, że nie jest odpowiednia dla CTmax, ponieważ muchy dobrowolnie wychodzą z dna kolumny, gdy temperatura wzrasta. Opisana tutaj nowa metoda pozwala obejść ten problem poprzez indywidualne uwzględnianie much podczas pomiarów automatycznych.
Oprócz metody obserwacji, dwa rodzaje reżimów temperaturowych są powszechnie używane do oceny górnych granic termicznych. Testy dynamiczne polegają na stopniowym zwiększaniu temperatury, aż do utraty funkcji motorycznej; ta temperatura to dynamiczny CTmax7,8,9,13. W przeciwieństwie do tego, testy statyczne polegają na stałej stresującej temperaturze, aż do utraty funkcji motorycznej; ten punkt czasowy to czas knockdown heat (heat KDT), zwany również statycznym CTmax (sCTmax) w niedawnym artykule Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Chociaż testy CTmax i knockdown heat (testy ciepła KD) dają metryki o różnych jednostkach, modelowanie matematyczne tych dwóch cech wskazuje, że dostarczają one porównywalnych informacji na temat tolerancji ciepła i są oba są istotne ekologicznie8,9. Testy dynamiczne dają temperaturę, którą można porównać z warunkami środowiskowymi i są preferowane, gdy występują duże różnice w tolerancji ciepła, takie jak porównania między gatunkami o bardzo różnych niszach termicznych. Jednak ze względu na wysoki poziom koenzymu Q10 dla akumulacji obrażeń cieplnych, test statyczny może być preferowany do wykrywania małych rozmiarów efektów, takich jak wewnątrzgatunkowa zmienność tolerancji ciepła9. Ponadto, praktycznie rzecz biorąc, test statyczny wymaga mniej wyrafinowanego sprzętu niż test dynamiczny.
Obiektywny 
Celem niniejszej pracy jest sformalizowanie metod oznaczaniamin CT i ciepła KD, które mogą być wykorzystane w przyszłych badaniach do oceny granic termicznych ruchliwych owadów. Protokoły są dostosowane do wcześniej ustalonych metodologii i są zaprojektowane tak, aby były wysokowydajne, zautomatyzowane i opłacalne. Oba testy można wykonać w krótkim czasie (~2 h), co oznacza, że w ciągu jednego dnia można przeprowadzić wiele eksperymentów, uzyskując duże ilości danych bez poświęcania powtarzalności i dokładności. Dzięki tej konfiguracji tolerancja cieplna 96 much może być mierzona jednocześnie, podczas gdy kolumna dla CTmin może pomieścić ponad 100 much, pod warunkiem, że jest odpowiednia powierzchnia do siedzenia.
Wysokoprzepustowa metoda obserwacjiCT min modyfikuje powszechną metodologię kolumn z płaszczem poprzez dodanie czujnika podczerwieni do automatycznego liczenia much. Zastosowanie czujnika podczerwieni do liczenia zostało po raz pierwszy zaproponowane przez Shumana i in. w 1996 roku23, ale nie zostało powszechnie przyjęte. Dodanie czujnika podczerwieni pozwala na generowanie danych w sposób ciągły, a nie gromadzenie danych w dyskretnych odstępach czasu. Protokół ten minimalizuje również błąd eksperymentatora, eliminując ręczne wprowadzanie danych i konieczność ręcznego przełączania probówek zbiorczych poniżej podnośnika kolumny w dyskretnych punktach czasowych.
Wysokoprzepustowa metoda rejestracji ciepła KDT jest zmodyfikowana w stosunku do dwóch poprzednich badań nad tolerancją ciepła u owadów10,12. Pojedyncze muchy są przechowywane na 96-dołkowej płytce w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze, a wideo jest nagrywane. Protokół ten minimalizuje stronniczość eksperymentatora w określaniu ciepła KDT, ponieważ eksperymenty mogą być przeglądane i weryfikowane poprzez odtwarzanie nagrania. Protokół ten zapewnia również zestaw niestandardowych skryptów języka Python, których można użyć do przyspieszenia analizy wideo. Użycie indywidualnych studni eliminuje zakłócenia, które mogą wystąpić, gdy inne osoby poruszają się lub przewracają, co może stanowić problem, gdy grupy osób są obserwowane na tej samej arenie10,17. Co więcej, inkubator z kontrolowaną temperaturą zapewnia stabilną temperaturę we wszystkich 96 dołkach, w przeciwieństwie do gradientu temperatury obserwowanego czasami w bloku aluminiowym o kontrolowanej temperaturze10. Należy również pamiętać, że metoda nagrywania 96 dołków może być dostosowana do pomiaru dynamicznegomaksimum CT i potencjalnieCT min (patrz Dyskusja).
Aby zademonstrować każdy protokół, porównano limity termiczne dorosłych samic Drosophila melanogaster z wybranych linii Genetycznego Panelu Referencyjnego Drosophila melanogaster (DGRP)24. Linie te zostały wybrane, ponieważ wstępne eksperymenty wykazały znaczące różnice w tolerancji termicznej. Testy te okazały się solidnymi metodami rozróżniania różnic w tolerancji termicznej. Poniższe dwa protokoły, wysokoprzepustowy test CTmin (sekcja 1) i wysokoprzepustowy test ciepła KD (sekcja 2), opisują niezbędne działania w celu uzyskaniadanych CT min i ciepła KDT dla dowolnego stadium życia ruchliwych owadów, które mogą zmieścić się w aparatach, takich jak dorosły Drosophila. W przypadku tomografii komputerowejważne jest również, aby owad mógł przysiąść. Tutaj każdy test jest demonstrowany na dorosłych Drosophila melanogaster. Jednak modyfikacje mogą być wymagane dla innych taksonów lub etapów życia6. Drobne zmiany mogą obejmować użycie materiału do siedzenia z większymi otworami, aby pomieścić większe próbki w teście CTmin lub użycie kamery wyższej jakości do rozpoznania subtelnego KDT wolno poruszającego się owada lub etapu życia w teście ciepła KD. Protokół ten nie opisuje metod przygotowania much, ale ważne jest ujednolicenie protokołów hodowlanych, aby zapewnić powtarzalność25 (zobacz Garcia and Teets26 oraz Teets and Hahn27). Dostarczone protokoły zawierają informacje o tym, jak zbudować i ustawić aparaty, jak rejestrować pomiary oraz krótki opis analizy danych.

<table><tbody><tr><td>ARCTIC A40 Cyrkulator płynów chłodniczych (programowalne rampy temperaturowe)</td><td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td><td>153-5401</td><td></td></tr><tr><td>C922 Pro Stream Kamera internetowa</td><td>Logitech; Newark, CA</td><td>960-001087</td><td></td></tr><tr><td>Okrągły regulowany stalowy zacisk &ndash; 5.08 cm do 7.62 cm</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przezroczysta rurka akrylowa &ndash; 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>44036</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta rurka akrylowa &ndash; 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>440515</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste rurki akrylowe &ndash; 7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>44041</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysty uszczelniacz silikonowy</td><td>Dowolna</td><td>dowolna</td><td></td></tr><tr><td>tubka zbiorcza (15 ml)</td><td>Dowolna</td><td>dowolna</td><td></td></tr><tr><td>wiertarka akumulatorowa</td><td>Dowolna</td><td>dowolna</td><td></td></tr><tr><td>Monitor lejka Drosophila (DFM)</td><td>TriKinetics; Waltham, MA</td><td>DFM</td><td>Służy do liczenia liczby much, które wpadają przez lejek w danym punkcie czasowym</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do zbierania danych DAM</td><td>TriKinetics; Waltham, MA</td><td></td><td>Rejestruje dane wejściowe z DFM</td></tr><tr><td>Fly Storage Lid</td><td>FlySorter; Seatle, WA</td><td>FS-96LID-5PK</td><td>Służy do ładowania much do płyty magazynowej do testu sCTmax</td></tr><tr><td>Płytka do przechowywania much</td><td>FlySorter; Seatle, WA</td><td>FS-96PLATE-5PK</td><td>Służy do trzymania much podczas testu sCTmax</td></tr><tr><td>Tacka na żywność dla much</td><td>FlySorter; Seatle, WA</td><td>FS-TRAY-5PK</td><td>Służy do trzymania much na żywności po załadowaniu do 96-dołkowej płytki do momentu testu sCTmax</td></tr><tr><td>Lejek szklany</td><td>Kimax</td><td>28950-75</td><td>Osłona rynny 75 mm</td></tr><tr><td></td><td>Dowolna</td><td>Dowolna</td> <td>średnica otworów ~ 0,5 cm</td></tr><tr><td>Piła do metalu</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>inkubator Heratherm Thermo Scientific</td><td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td><td>OMS100</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowe adaptery do węży (2) &ndash; &frac14; MNPT x 3/8</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>61135</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet do klejenia na gorąco i klej</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>źródło światła</td>, <td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnesy</td>, <td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nagrywarka OMEGA TC-08 i oprogramowanie odtwarzacza TC-08</td><td>OMEGA; Norwalk, CT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMEGA termopara (Typ T)</td><td>OMEGA; Norwalk, CT</td><td>5LRTC-TT-K-20-36</td><td></td></tr><tr><td>Lejek plastikowy</td><td>Dowolna Dowolna</td><td></td><td>średnica 2"</td></tr><tr><td>Rurka plastikowa - średnica 0,6 cm</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>62852</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień retortowy</td><td>Dowolna</td><td>Dowolna średnica</td><td>2</td></tr>" <tr><td>Stojak na retortę</td><td>Dowolna Dowolna</td><td>Retorta</td><td></td></tr> Zacisk <tr><td>trójbolcowy</td><td>Dowolna Dowolna</td><td>Dowolna</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Złącze portu szeregowego (PSIU9)</td><td>TriKinetics; Waltham, MA</td><td>PSIU9</td><td>Pośrednie połączenie między DFM a komputerem, pozwala na wiele połączeń DFM</td></tr><tr><td>Styropian (o grubości 2 cali)</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>taśma</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nieprzerwana dostawa zasilania (PS9-1)</td><td>TriKinetics; Waltham, MA</td><td>PS9-1</td><td>Zasilacz do DFM i PSIU9</td></tr><tr><td>Weld-on #4 Cement akrylowy</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>45737</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe testy krytycznych limitów termicznych u owadów

High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

Górne i dolne limity termiczne roślin i zwierząt są ważnymi predyktorami ich wydajności, przetrwania i rozmieszczenia geograficznego, a także są niezbędne do przewidywania reakcji na zmiany klimatu. W niniejszej pracy opisano dwa wysokoprzepustowe protokoły pomiaru limitów termicznych owadów: jeden do oceny krytycznych minimów termicznych (CTmin), a drugi do oceny czasu wyłączenia cieplnego (KDT) w odpowiedzi na statyczny stresor cieplny. W teście CTmin osoby są umieszczane w kolumnie z płaszczem akrylowym, poddawane zmniejszającej się rampie temperatury i liczone, gdy spadają z żerdzi za pomocą czujnika podczerwieni. W teście cieplnym KDT osoby są umieszczane w 96-dołkowej płytce, umieszczane w inkubatorze ustawionym na stresującą, wysoką temperaturę i nagrywane wideo w celu określenia czasu, w którym nie mogą już pozostać w pozycji pionowej i się poruszać. Protokoły te mają przewagę nad powszechnie stosowanymi technikami. Oba testy są tanie i można je wykonać stosunkowo szybko (~2 h). TestCT min zmniejsza błąd eksperymentatora i może mierzyć dużą liczbę osób jednocześnie. Protokół ciepła KDT generuje zapis wideo każdego testu, eliminując w ten sposób stronniczość eksperymentatora i potrzebę ciągłego monitorowania osób w czasie rzeczywistym.

Granice termiczne (tj. CTmin oraz heat KDT) samic z Panelu Referencyjnego Genetycznego (DGRP) Drosophila melanogaster zostały zmierzone, aby zaprezentować dane wysokoprzepustowe generowane za pomocą dwóch opisanych protokołów. CTmin badano z wykorzystaniem linii DGRP 714 (n = 37) i 913 (n = 45). Heat KDT badano i porównywano dla linii DGRP 189 (n = 42) i 461 (n = 42), a pliki wideo analizowano ręcznie. Całkowity czas trwania eksperymentów, wliczając w to ogl...

Limity termiczne mogą przewidywać środowisko, które organizmy tolerują, co jest cenną informacją w obliczu gwałtownych zmian klimatycznych. Opisano tutaj wysokoprzepustowe protokoły do oceny krytycznych minimów termicznych i czasu wykańczania ciepła u owadów. Oba protokoły maksymalizują przepustowość i minimalizują koszt testów.

Wysokoprzepustowe testy krytycznych limitów termicznych u owadów

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are ...

Tolerancja termiczna jest kluczowym elementem rozmieszczenia gatunków i reakcji na zmianę klimatu. W tym miejscu przedstawiamy metody szybkiej oceny tolerancji na ciepło i zimno u małych owadów. Te metody pomiaru tolerancji na zimno, poprzez krytyczne minimum termiczne i tolerancję termiczną, na podstawie czasu powalenia na gorąco, są wysokowydajne, półautomatyczne i wymagają minimalnego zużycia sprzętu.Procedurę zademonstruje David Awde, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Aby skonfigurować krytyczny test minimum termicznego, włącz kąpiel płynową o kontrolowanej temperaturze i naciśnij przycisk odtwarzania, aby uruchomić program, podnosząc i utrzymując temperaturę kąpieli do 25 stopni Celsjusza. Odczekaj od pięciu do 10 minut, aby kolumna łazienkowa z płynem osiągnęła 25 stopni Celsjusza, zanim wymienisz korek w górnej części kolumny na filtr o średnicy 5.08 centymetra.Wklep około 40 much z fiolki z jedzeniem do kolumny przez lejek i szybko zastąp lejek zatyczką, uważając, aby nie dopuścić do ucieczki much. Następnie pozwól muchom się uspokoić. Od czasu do czasu stukaj w dolną wtyczkę, aby zachęcić muchy do wspinania się.Po pięciu minutach naciśnij przycisk start na wzmocni

high-throughput-assays-of-critical-thermal-limits-in-insects

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule przedstawiamy testy służące do badania nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Jeden z testów polega na stymulacji ograniczonej przestrzennie (lokalnej) nocyceptorów termicznych1,2, natomiast drugi obejmuje całkowitą (globalną) aktywację większości lub wszystkich takich neuronów3. Wspólnie techniki te umożliwiają wizualizację i kwantyfikację funkcji behawioralnych neuronów sensorycznych nocyceptywnych Drosophila.

Lokalne i globalne metody oceny nocycepcji termicznej u larw Drosophila

Larwy Drosophila mają dedykowane neurony czuciowe - nocyceptory - których reakcja na potencjalnie szkodliwe bodźce termiczne wyzwala u zwierzęcia zachowania awersyjne - lub tak zwane "nocyfensywne". Ten film opisuje metodę oceny nocycepcji termicznej poprzez rejestrowanie zachowania larw w odpowiedzi na miejscowe przyłożenie sondy ciepła do naskórka. Metoda ta jest zatem nazywana testem lokalnej sondy ciepła.

Test lokalnej sondy ciepła: metoda oceny nocyceptycji wysokich temperatur u larw Drosophila

Źródło: Ali, I., i in. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów mikroorganizmów o wpływie na zdrowie Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2022)Ten film prezentuje wysokowydajny test fluorescencyjny, mający na celu ocenę, jak bakterie jelitowe wpływają na odporność na stres u Caenorhabditis elegans. Śledząc niebieską fluorescencję z pękniętych granulek jelit, test ujawnia wcześniejsze sygnały śmierci u robaków narażonych na testowe bakterie.

Wysokowydajny test fluorescencjonujący do badania interakcji mikroorganizmów z robakami

Tutaj prezentujemy protokół do określenia preferowanej temperatury środowiskowej larw Drosophila za pomocą ciągłego gradientu termicznego.

Test gradientu temperatury w celu określenia preferencji termicznych larw Drosophila

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Tutaj opisany jest tani, dostępny protokół do oceny regeneracji motyli po szoku zimna w warunkach otoczenia.

Test fizjologii termicznej w terenie: odzyskiwanie po szoku zimna w warunkach otoczenia

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Owady mają optymalny zakres temperatur otoczenia, w którym starają się pozostać, a wiele czynników zewnętrznych i wewnętrznych może zmienić tę preferencję. W tym miejscu opisujemy opłacalną i prostą metodę badania wyboru temperatury, która pozwala owadom swobodnie wykazywać swoje naturalne zachowania.

Określanie preferencji temperaturowych komarów i innych ektotermów

Obecny protokół ilustruje użycie dostępnych na rynku komponentów do generowania stabilnego i liniowego gradientu termicznego. Taki gradient można następnie wykorzystać do wyznaczenia górnej granicy termicznej organizmów planktonowych, w szczególności larw bezkręgowców.

Wyznaczanie limitów termicznych dla zooplanktonu za pomocą bloku cieplnego

Ten raport opisuje metodę pomiaru czasu do powalenia dorosłej Drosophila melanogaster za pomocą Monitora Aktywności Drosophila (DAM2) w odpowiedzi na stresor cieplny przewodnictwa powietrza w komorze inkubatora. DAM2 mierzy aktywność, rejestrując ruchy poszczególnych much, gdy przecinają one wiązkę podczerwieni. Analizę danych ułatwia stworzony przez autorów nowatorski plik wykonywalny.

Testy tolerancji ciepła przy użyciu systemu monitorowania aktywności Drosophila: przewodnik po wykonywalnej aplikacji do analizy danych

Poznaj wysokoprzepustowe metody oceny krytycznych limitów termicznych u owadów z wykorzystaniem Drosophila. Techniki pomiaru minimalnej temperatury krytycznej i czasu upadku cieplnego pozwalają na szybką analizę tolerancji termicznej w kontekście zmian klimatu.

Wysokoprzepustowe testy krytycznych limitów termicznych u owadów

Przeglądaj więcej filmów