Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby
8 marca 2024
Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.
Metoda ta zawiera instrukcje krok po kroku, jak wygenerować indukowane przez człowieka pluripotencjalne organoidy jelitowe pochodzące z komórek macierzystych poprzez różnicowanie w ostateczną endodermę, następnie nabłonek jelita tylnego, a na końcu transfer do warunków hodowli 3D. Wyniki uzyskane z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych organoidów jelitowych pochodzących z komórek macierzystych wykazują większą translatowalność niż dane z kultur jednokomórkowych, a jednocześnie są bardziej praktyczne niż organoidy pochodzące z tkanek pierwotnych, które mogą być trudne do utrzymania w hodowli przez długi czas. Po wytworzeniu ludzkich komórek jelitowych ze zróżnicowanych iPSC należy użyć pipety serologicznej o pojemności 5 mililitrów, aby odłączyć monowarstwę komórek od każdej studzienki płytki 6-dołkowej.
I połącz komórki w jednej 15-mililitrowej probówce do odwirowania. Ponownie zawiesić osad w podłożu jelitowym uzupełnionym czynnikami wzrostu. I dodaj odpowiednią objętość macierzy zewnątrzkomórkowej w zależności od liczby platerowanych studzienek.
Dodać 30 mikrolitrów zawiesiny komórek do środka odpowiedniej liczby dołków płytki 48-dołkowej. Zapewnienie, że ECM jest umieszczony w środku studni, jest bardzo ważne dla długoterminowej stabilności tej próbki. Jeśli ECM dotknie ściany studni, może się ona zawalić, a próbki mogą zostać utracone.
Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na co najmniej 5 minut. Gdy macierz zewnątrzkomórkowa stwardnieje, dodaj 300 mikrolitrów świeżej pożywki wzrostowej jelita uzupełnionej czynnikami wzrostu do każdej studzienki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Po 48 godzinach użyj mikroskopu świetlnego, aby sprawdzić studzienki pod kątem tworzenia się organoidów.
Po 7 dniach hodowli odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją lodowatym DPBS. Użyj pipety serologicznej o pojemności 5 mililitrów, aby mechanicznie odłączyć organoidy i kulę macierzy zewnątrzkomórkowej od płytki. Następnie połącz organoidy w jednej 15-mililitrowej probówce wirówkowej.
Zebrać organoidy przez odwirowanie i odessać supernatant do górnej części widocznej warstwy ECM. Ponownie zawiesić osad w 15 mililitrach lodowatego DPBS i ponownie odwirować komórki. Po zassaniu supernatantu, jak pokazano, ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze lodowatego PBS i użyć pipety P200, aby ręcznie rozbić nienaruszone organoidy.
Potwierdzić całkowitą dysocjację organoidów. Odwirować zdysocjowane organoidy i ponownie zawiesić w wymaganej objętości macierzy zewnątrzkomórkowej przed posiewem na świeżej 48-dołkowej płytce, jak pokazano. Następnie należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na 5 minut.
Po 5 minutach wyjąć płytkę z inkubatora i dodać pożywkę jelitową z czynnikami wzrostu i inhibitorem ROCK. Zmieniaj nośniki co 2-4 dni. Aby wywołać reakcję zapalną w organoidach jelitowych, zastąp supernatant w każdym dołku kultury organoidowej 300 mikrolitrami świeżo przygotowanego podłoża podstawowego uzupełnionego 40 nanogramami na mililitr TNF alfa.
Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowej na 48 godzin, aby odtworzyć środowisko prozapalne. Ekspresję genów można monitorować w trakcie różnicowania ludzkiego IPSC za pomocą markerów pluripotencji, które są silnie eksprymowane w dniu 0 i są szybko regulowane w dół podczas procesu ostatecznego różnicowania endodermy. W 2 dniu różnicowania ostateczne geny endodermy powinny rozpocząć ekspresję, a ekspresja powinna osiągnąć szczyt w 3 dniu.
Podczas specyfikacji jelita tylnego ekspresja CDX2 i HNF4alpha powinna być indukowana i wzrastać w czasie. 48 godzin po przeniesieniu arkusza komórkowego 2D, arkusze komórek powinny zacząć się automatycznie organizować w bardziej zagęszczone struktury sferoidalne 3D, które początkowo są małe, ale stopniowo zwiększają rozmiar i złożoność w ciągu następnych 7-10 dni hodowli. Organoidy nie powinny być pasażowane, dopóki nie osiągną wyraźnej morfologii sferoidów organoidowych z widocznym nabłonkiem i światłem skierowanym w stronę środka struktury.
Gdy struktury osiągną ten etap, można przeprowadzić immunocytochemię, aby potwierdzić ekspresję markerów jelitowych, takich jak villin i CDX2. Aby modelować stan zapalny, TNF alfa można dodawać do pożywki tkankowej przez 24-48 godzin, co zwykle powoduje ekspresję markerów prozapalnych w połączeniu z regulacją w dół markerów nabłonka jelitowego. Indukowane przez człowieka pluripotencjalne organoidy jelitowe pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do odkrywania leków, modelowania chorób, edycji genów, badania mikrośrodowiska guza oraz profilu transkryptomicznego i proteomicznego oraz epigenetycznego dowolnej choroby będącej przedmiotem zainteresowania.
Ta metoda może pomóc wielu laboratoriom w ustaleniu organoidów jelitowych jako systemu modelowego, zapewniając im dodatkową metodę badań.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w organoidy jelita, naśladujący prawidłowy rozwój człowieka. Metoda ta pozwala na skuteczne uzyskanie definitywnej endodermy, nabłonka jelita tylnego, a ostatecznie funkcjonalnych struktur jelitowych, które nadają się do badania rozwoju jelit oraz modeli chorobowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
- Modelowanie chorób
Wprowadzenie
- Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste mogą być różnicowane w różne typy komórek.
- Organoidy jelitowe stanowią model o większej wartości translacyjnej w porównaniu z kulturami monokomórkowymi.
- Istnieją trudności związane z utrzymaniem organoidów pochodzących z tkanki pierwotnej.
Zastosowane metody
- Różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) w organoidy.
- Warunki hodowli 3D dla zapewnienia długoterminowej stabilności i wzrostu.
- Monitorowanie ekspresji genów oraz immunocytochemia w kierunku markerów jelitowych.
Główne wyniki
- Generowanie organoidów jelitowych z iPSC z wyraźnymi strukturami nabłonkowymi.
- Skuteczne modelowanie odpowiedzi zapalnych z użyciem TNF alpha.
- Silna ekspresja markerów jelitowych potwierdzona za pomocą różnych testów.
Wnioski
- Badanie przedstawia praktyczną metodę tworzenia ludzkich organoidów jelita.
- Technika ta zwiększa możliwości badawcze w zakresie odkrywania leków i modelowania chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Organoidy jelitowe pochodzące z hiPSC stanowią skalowalny, powtarzalny i istotny dla człowieka system modelowy do wczesnego etapu odkrywania leków oraz badania mechanizmów chorób. Ich zdolność do odtwarzania złożonej architektury nabłonka jelitowego zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w portfelach leków na choroby układu pokarmowego. Platforma ta wspiera ciągłość translacyjną od fazy odkrywania po badania przedkliniczne, ułatwiając podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w fizjologicznie istotnym, trójwymiarowym (3D) kontekście ludzkiego jelita.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez modelowanie różnicowania i polaryzacji komórek nabłonkowych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego w odniesieniu do szlaków zapalnych i włóknistych istotnych dla IBD oraz schorzeń pokrewnych.
- Zapewnia platformę do badań porównawczych z wykorzystaniem zdrowych hiPSC oraz hiPSC pochodzących od pacjentów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane, rozszerzalne hodowle organoidów odpowiednie do opracowywania testów ilościowych.
- Umożliwia powtarzalny pomiar ekspresji genów i markerów białkowych za pomocą qPCR oraz immunocytochemii.
- Wspiera przesiewowe badanie odpowiedzi zapalnych na cytokiny i mediatorzy bakteryjne w kontrolowanym systemie.
- Pozwala na skalowalne pasażowanie i utrzymywanie hodowli, co wspiera procesy wysokoprzepustowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Modeluje fenotypy istotne dla przebiegu choroby, w tym odpowiedzi zapalne i włókniste, w celu odkrywania translacyjnych biomarkerów.
- Umożliwia dopasowanie wyników in vitro do tła genetycznego pochodzącego od pacjentów w celu walidacji przedklinicznej.
- Wspiera dostosowany do ryzyka postęp rozwoju kandydackich terapii celowanych w patologie jelitowe.
- Ułatwia integrację analiz transkrypcyjnych, proteomicznych i epigenetycznych w celu kompleksowego modelowania chorób.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta platforma organoidowa łączy wczesny etap odkryć, identyfikację związków wiodących oraz walidację przedkliniczną, zapewniając odzwierciedlający fizjologię człowieka, powtarzalny system do testowania hipotez i badań mechanistycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych oraz wyjaśnianie szlaków w rozwoju i chorobach jelit.
- Przesiewanie: Dostarcza standaryzowanych organoidów gotowych do analizy w celu ilościowej oceny odpowiedzi zapalnych i włóknistych.
- Analityka: Umożliwia rzetelny pomiar ekspresji genów i białek w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Pozwala na dopasowanie modelowania chorób in vitro do tła genetycznego pacjentów w celu odkrywania biomarkerów i celów terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, wielokrotnego użytku platformę, którą można dostosować do zróżnicowanych potrzeb badań nad układem pokarmowym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy i umożliwia reprodukowalną, skalowalną produkcję organoidów.
- Wartość strategiczna: Poprawia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez redukcję biologicznego ryzyka na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących chorób przewodu pokarmowego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli hiPSC, różnicowania oraz pracy z organoidami 3D.
- Konieczny jest dostęp do specjalistycznej infrastruktury hodowli komórkowych oraz platform analitycznych do qPCR i immunocytochemii.
- W celu zapewnienia powtarzalności wymagana jest standaryzacja protokołów różnicowania i pasażowania pomiędzy zespołami.
- Możliwna może być konieczność adaptacji metod dla różnych linii hiPSC lub specyficznych dla danej choroby podłoży genetycznych.
- Stabilność długoterminowej hodowli i skalowalność zależą od precyzyjnego obchodzenia się z ECM oraz suplementacji czynnikami wzrostu.
