Model nabłonka oskrzeli na granicy faz powietrze-ciecz do realistycznego, powtarzającego się narażenia inhalacyjnego na cząstki unoszące się w powietrzu do testów toksyczności
13 maja 2020
Opisana jest metoda hodowli komórkowej i ekspozycji modelu oskrzelowego in vitro dla realistycznej, powtarzającej się ekspozycji inhalacyjnej na cząstki do testów toksyczności.
Protokół ten opisuje, w jaki sposób hodować i wystawiać ludzkie komórki nabłonka oskrzeli za pośrednictwem powietrza. Jest to bardziej realistyczny model do badania narażenia płuc na wdychane cząstki. Komórki płuc przygotowane tymi metodami, aby przypominały rzeczywiste środowisko w płucach. Komórki będą wytwarzać śluz, tworzyć szczelną barierę, pozostając żywotne przez kilka tygodni. Metoda ta może być stosowana do badania toksycznego wpływu cząstek unoszących się w powietrzu. Może być również stosowany do badania chorób zakaźnych dróg oddechowych i leków przyjmowanych drogą wziewną. Próbując tego protokołu po raz pierwszy, należy pamiętać, że wygenerowanie metodyki agile wymaga wiedzy specjalisty. Wymaga również dedykowanego sprzętu do pomiarów. Rozpocznij od rozcieńczenia komórek we wstępnie podgrzanej pożywce do hodowli komórkowej lub CCM do stężenia 500 000 komórek na mililitr dla wkładek 6-dołkowych. I 250 000 komórek na mililitr dla wkładek 12-dołkowych. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej z wkładkami w warunkach aseptycznych i wypełnić podstawową boczną stronę wstępnie podgrzanym CCM. Po wymieszaniu zawiesiny komórkowej należy ją pipetować na wierzchu membrany we wkładce do hodowli komórkowej. Przykryj płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Hoduj komórki w warunkach zanurzonych przez siedem dni, aby umożliwić im osiągnięcie zbieżności, zmieniając CCM co dwa do trzech dni. Do pomiaru przeznabłonkowego oporu elektrycznego należy użyć naładowanego woltoomomierza nabłonkowego, uzupełnionego zestawem elektrod pałeczkowych. Oczyść elektrody 70% etanolem. Umieść dłuższą elektrodę w zewnętrznej pożywce hodowlanej, aż dotknie dna naczynia. I krótsza elektroda w mediach, bez dotykania membrany. Rozpocznij zbieranie pomiarów na pustej wkładce bez komórek. Poczekaj, aż pomiar się ustabilizuje i zapisz rezystancję w omach. Miara ta to rezystancja membrany wkładki bez żadnych komórek lub rezystancji ślepej próby. Powtórz pomiar dla każdej płytki i odejmij rezystancję ślepej próby, aby uzyskać rzeczywistą rezystancję, i pomnóż przez pole powierzchni wkładki. Usuń pożywkę z wierzchołkowej strony wkładek i dodaj wstępnie podgrzany CCM do podstawno-bocznej strony studzienki. Medium powinno dotykać membrany od dołu, ale nie przeciekać na wierzch wkładu. Hoduj komórki na granicy faz powietrze-ciecz w inkubatorze, w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez siedem dni. Zmiana podłoża podstawno-bocznego co dwa do trzech dni. Na krótko przed ekspozycją na cząstki należy przygotować 1% zawiesinę nanocząstek. Wstępnie zwilż NP 96% etanolem. Dodać czystą wodę do końcowego stężenia 1% NPs. Umieścić fiolkę w zlewce na lodzie. Sonikować zawiesinę przez 16 minut, dodać mieszanie do butelki z dyspersją, a następnie podłączyć butelkę do pompy perystaltycznej za pomocą małej rurki i dostosować przepływ do 25 mililitrów na godzinę. Na dzień przed ekspozycją włącz automatyczną stację naświetlania lub AES i pozwól szafie osiągnąć temperaturę 37
Przegląd
Niniejsza praca koncentruje się na opracowaniu modelu oskrzeli in vitro do symulacji powtarzającej się ekspozycji inhalacyjnej na cząstki przenoszone powietrzem w celu badania toksyczności. Hodowane ludzkie komórki nabłonka oskrzeli wykazują długotrwałą żywotność oraz realistyczną produkcję śluzu, co sprawia, że model ten jest odpowiedni do badań toksykologicznych oraz analiz nad chorobami zakaźnymi.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Toksykologia
- Biologia układu oddechowego
- Modele in vitro
Wprowadzenie
- Konieczność opracowania realistycznych modeli ekspozycji płuc
- Znaczenie badania cząstek wdychanych
- Zastosowania w badaniach nad dostarczaniem leków i chorobami zakaźnymi
Zastosowane metody
- Techniki hodowli komórkowych dla ludzkich komórek nabłonka oskrzeli
- Warunki hodowli na granicy faz powietrze-ciecz
- Pomiar transepithelial electrical resistance
Główne wyniki
- Komórki tworzą szczelną barierę i produkują śluz
- Żywotność utrzymywana przez kilka tygodni w kontrolowanych warunkach
- Metoda zwalidowana do zastosowania w ocenach toksykologicznych
Wnioski
- Opracowany model skutecznie naśladuje ekspozycję płuc na wdychane cząsteczki
- Istotne znaczenie dla testów toksyczności i badań nad układem oddechowym
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Realistyczne modele nabłonka oskrzelowego in vitro są kluczowe dla predykcyjnych testów toksyczności inhalacyjnej oraz badań nad dostarczaniem leków do dróg oddechowych. System interfejsu powietrze-ciecz (ALI) z wykorzystaniem komórek Calu-3 umożliwia prowadzenie badań nad wielokrotną ekspozycją na niskie dawki, które ściśle naśladują warunki panujące w ludzkich drogach oddechowych, co zwiększa pewność translacyjną wczesnej oceny związków. Podejście to odpowiada na zapotrzebowanie na fizjologicznie istotne i powtarzalne modele w procesach rozwoju produktów biofarmaceutycznych dla układu oddechowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmacji
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczne ograniczenie ryzyka związanego z wpływem substancji wdychanych na nabłonek dróg oddechowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez utrzymywanie połączeń ciasnych oraz produkcji śluzu przez dłuższe okresy.
- Zwiększa pewność predykcyjną w ocenie toksyczności oddechowej i bezpieczeństwa.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany, powtarzalny system do ilościowego pomiaru integralności bariery nabłonkowej.
- Wspiera standaryzację testu dla powtarzalnych ekspozycji na cząstki o niskim stężeniu.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków przenoszonych drogą powietrzną w warunkach ciągłego przepływu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami dróg oddechowych istotnymi dla danej choroby w badaniach nad biomarkerami translacyjnymi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć in vitro po przedkliniczne procedury toksykologiczne dla inhalacji.
- Zmniejsza ryzyko niepowodzeń w późnych fazach badań dzięki modelowaniu realistycznych scenariuszy ekspozycji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model oskrzeli ALI integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych w zakresie terapeutyki układu oddechowego i toksykologii inhalacyjnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji bariery dróg oddechowych i toksyczności cząsteczek.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe odczyty oporu transepitelialnego oraz żywotności.
- Analityka: Umożliwia ciągłe monitorowanie stężenia ekspozycji i dostarczonej dawki.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z przedklinicznymi badaniami inhalacyjnymi z punktami końcowymi istotnymi dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia ustandaryzowaną platformę, którą można dostosować do różnorodnych badań nad cząsteczkami przenoszonymi przez powietrze oraz lekami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach toksyczności układu oddechowego.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność protokołów wielokrotnej ekspozycji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub zaprzestaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową w rozwoju portfolio produktów dla układu oddechowego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków i formulacji do podania drogą wziewną w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej w warunkach ALI oraz w pomiarze bariery nabłonkowej.
- Wymaga specjalistycznej aparatury do ciągłej ekspozycji w przepływie i monitorowania rezystancji.
- Wymaga standaryzacji protokołów ekspozycji i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych typów i stężeń cząstek przenoszonych drogą powietrzną w ramach ograniczeń modelu.
- Zależna od utrzymania żywotności komórek i integralności połączeń ścisłych podczas przedłużonych okresów hodowli.
