Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Cześć, nazywam się Chris Glembotski. Jestem profesorem medycyny na University of Arizona College of Medicine w Phoenix. Jestem dyrektorem Translational Cardiovascular Center, które również znajduje się w Phoenix.

Chciałbym przedstawić Wam dzisiaj dwie osoby, które zademonstrują naszą nową technikę, dr Erika Blackwooda, mojego starszego doktora habilitowanego i wykładowcę w trakcie szkolenia, oraz starszego pracownika naukowego, panią Alinę Bilal. Obecne protokoły izolacji miocytów serca ograniczają ilość i żywotność komórek w hodowli, tworząc eksperymentalny impas w pogłębianiu naszego zrozumienia fizjologii i patofizjologii serca. Protokół ten ma na celu nie tylko przyspieszenie procesu izolacji dorosłych mysich komórek serca, ale także zwiększenie wydajności i żywotności komórek serca przedsionkowego i komorowego jednocześnie z jednego serca myszy.

Technika ta ma głębokie implikacje dla odkryć terapeutycznych i pozwala na lepsze scharakteryzowanie chorób takich jak migotanie przedsionków na poziomie specyficznym dla danego typu komórki, co pozwala na identyfikację celów terapeutycznych. Zalecamy, aby osoby bez wcześniejszego doświadczenia mikrochirurgicznego dokładnie przećwiczyły etapy eksplantacji i kaniulacji aorty wstępującej przed przystąpieniem do pełnego protokołu izolacji. Zacznij od użycia nożyczek, aby wykonać nacięcie skóry w linii środkowej, aby szybko otworzyć klatkę piersiową znieczulonej 10-tygodniowej czarnej myszy C57 6J od połowy brzucha do szczęki.

Wejdź do otrzewnej i oczyść przeponę przez rozwarstwienie. Odetnij klatkę piersiową z nacięciami wzdłuż ściany klatki piersiowej po bocznej stronie obu stron i odetnij włókniste połączenia między sercem a ścianą klatki piersiowej. Po całkowitym usunięciu klatki piersiowej użyj małych kleszczyków i nożyczek, aby delikatnie podnieść serce za wierzchołek, odsłaniając tylną część serca.

Aby wyciąć serce, należy natychmiast wyciąć tętnicę poniżej imiennej na aorcie wstępującej i natychmiast umieścić serce w lodowato zimnym podłożu perfuzyjnym serca. Szybko wypreparuj pozostałą tkankę, aby odsłonić wstępującą aortę i użyj kleszczy i nożyczek do mikropreparacji, aby oczyścić obszar otaczający aortę z nadmiaru tkanki. Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby umieścić oczyszczoną aortę dwa milimetry na kaniuli perfuzyjnej i zabezpiecz kaniulę jedwabnym szwem 5-0.

Przepłukiwać kaniulowane serce pożywką perfuzyjną serca z szybkością przepływu trzech mililitrów na minutę przez cztery minuty, a następnie przejść do buforu wytrawiającego na 15 do 17,5 minuty. W ostatnich minutach perfuzji zbierz osiem mililitrów przepływu buforu trawienia i przenieś serce z kaniuli do plastikowego naczynia hodowlanego o średnicy 60 milimetrów, a następnie usuń nadmiar tkanki i zanurz serce w 2,5 mililitra buforu do wytrawiania. W celu izolacji komórek przedsionkowych należy wyciąć przedsionki z dala od serca i umieścić przedsionki w plastikowym 30-milimetrowym naczyniu hodowlanym zawierającym 750 mikrolitrów buforu do wytrawiania.

Używając nożyczek chirurgicznych z cienką końcówką, zmiel i rozsuń przedsionki, a następnie kontynuuj cięcie tkanki cienkimi kleszczami bez mieszania lub rozrywania włókien mięśniowych. Używając sterylnej końcówki pipety do przenoszenia, kontynuuj delikatne mieszanie i dysocjację tkanki przez 15 minut. Co pięć minut obserwuj dysocjację miocytów przedsionków pod 10-krotnym obiektywem mikroskopu Brightfield.

W miarę dalszego trawienia tkanki kontynuuj delikatne mieszanie i dysocjację tkanki za pomocą sterylnej końcówki pipety transferowej o mniejszym rozmiarze porów przed przeniesieniem zawiesiny komórkowej do sterylnej dwumililitrowej probówki do mikrowirówki. Przepłukać 30-milimetrową płytkę 750 mikrolitrami miocytów o temperaturze 37 stopni Celsjusza zatrzymując bufor pierwszy i połączyć bufor z zawiesiną komórkową. Pozwól miocytom przedsionkowym ustabilizować się grawitacyjnie i delikatnie mieszając przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Gdy utworzy się widoczna osadka, odwirować zawiesinę komórek i przenieść supernatant niezawierający miocytów do 15-mililitrowej stożkowej probówki polipropylenowej, nie naruszając osadu miocytów przedsionkowych. Odwirować frakcję nie-miocytową i ponownie zawiesić osad nie-miocytowy w 10 mililitrach DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą cielęcą. Po zliczeniu umieścić komórki niebędące miocytami w odpowiedniej gęstości doświadczalnej do dalszej analizy, a następnie ponownie zawiesić izolowany osad miocytów przedsionkowych w odpowiednim stężeniu doświadczalnym do wysiewu na płytki hodowlane pokryte lamininą.

W celu izolacji komórek komorowych należy zmielić tkankę serca komory, jak właśnie pokazano dla próbki tkanki przedsionkowej, i przenieść powstałą zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej rurki polipropylenowej zawierającej 2,5 mililitra miocytów o temperaturze 37 stopni Celsjusza, zatrzymując bufor jeden. Przepłucz płytkę preparacyjną 2,5 mililitra miocytów o temperaturze 37 stopni Celsjusza, zatrzymując bufor jeden i połącz płukanie z zawiesiną komórek. Używając sterylnej pipety do przenoszenia, kontynuuj delikatne mieszanie i dysocjację tkanki przez cztery minuty.

Pod koniec inkubacji użyj 10 mikrolitrowej podwielokrotności komórek, aby sprawdzić obecność miocytów w kształcie pręcików. Przepuść zawiesinę komórkową przez sterylny filtr nylonowy o pojemności 100 mikrolitrów do stożkowej rurki polipropylenowej o pojemności 50 mililitrów i użyj dwóch mililitrów wcześniej zebranego buforu wytrawiającego do wypłukania pozostałych komórek ze sterylnego filtra nylonowego. Pozwól miocytom komorowym na osadzanie się grawitacyjnie przez sześć minut, delikatnie mieszając, aż na dnie probówki utworzy się widoczna osadka.

Za pomocą sterylnej końcówki pipety przenieś supernatant niezawierający miocytów do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 mililitrów, nie naruszając osadu miocytów komorowych i odwiruj frakcję niemiocytową. Ponownie zawiesić osad nie-miocytów w 10 mililitrach DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą cielęcą do liczenia i umieścić komórki w odpowiednim stężeniu do ich dalszej analizy, a następnie ponownie zawiesić izolowane miocyty komorowe w dwóch mililitrach miocytów, zatrzymując bufor drugi do liczenia. Aby ustanowić stopniowy paradygmat reintrodukcji wapnia, dodaj 50 mikrolitrów 10-milimolowego chlorku wapnia do zawiesiny komórek miocytów komorowych z dokładnym wymieszaniem przez cztery minuty inkubacji w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji dodać do komórek dodatkowe 50 mikrolitrów 10-milimolowego chlorku wapnia z mieszaniem przez kolejne cztery minuty inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie potraktuj komórki jedną czterominutową inkubacją ze 100 mikrolitrami 10-milimolowego chlorku wapnia i jedną czterominutową inkubacją z 80 mikrolitrami 10-milimolowego chlorku wapnia. Po ostatniej inkubacji ponownie zawiesić miocyty komorowe poddane działaniu wapnia w odpowiedniej objętości pożywki do posiewu miocytów komorowych zgodnie z ich planowaną dalszą analizą i wysiać komórki na płytkach hodowlanych pokrytych lamininą.

Po godzinie zastąpić supernatant pożywką utrzymującą miocyty komorowe uzupełnioną 25 mikromolową Blebbistatyną. Troponina T mięśnia sercowego jest markerem miocytów serca i ulega silnej ekspresji zarówno w przedsionkowych, jak i komorowych hodowlach miocytów serca. W przeciwieństwie do tego, przedsionkowy peptyd natriuretyczny i łańcuch lekki miozyny dwa ulegają silnej i specyficznej ekspresji odpowiednio w przedsionkowych i komorowych hodowlach miocytów serca.

Markery fibroblastów ulegają ekspresji wyłącznie w kulturach innych niż miocyty izolowanych zarówno z komór przedsionkowych, jak i komorowych. Barwienie immunologiczne dorosłych myszy, przedsionków i dorosłych myszy, miocytów komorowych pod kątem markera kanalików T, dihydropirydyny i receptora ryanodine, wykazuje nienaruszone kanaliki T podczas izolacji i długotrwałej hodowli. Sarkomeryczny wzór prążkowania może być wykorzystany do oceny czystości i żywotności izolowanych miocytów serca w połączeniu z morfologią w kształcie pręcika i barwieniem jądrowym za pomocą TO-PRO-3.

Zgodnie z oczekiwaniami miocyty serca komorowego są duże, wykazując średnią długość około 150 mikrometrów, podczas gdy miocyty serca przedsionkowego mają średnio około 75 mikrometrów. Ponadto, po analizie immunostainingu, miocyty serca przedsionkowego wykazują silną ekspresję przedsionkowego peptydu natriuretycznego we wzorze barwienia, który jest charakterystyczny dla lokalizacji retikulum endoplazmatycznego i ziarnistości wydzielniczej. Podczas gdy miocyty przedsionkowe wydzielają przedsionkowy peptyd natriuretyczny w warunkach podstawowych, wydzielanie wzrasta w odpowiedzi na wydzielanie.

Co więcej, miocyty serca przedsionkowego wydzielają przedsionkowy peptyd natriuretyczny i współwydzielają tylko część hormonu ze stanu prekursorowego do peptydu produktu. Najczęstsze błędy, których można uniknąć, to nieutrzymywanie zwierzęcia w spokoju przed ustrzeleniem, nieusuwanie pęcherzyków powietrza z systemu perfuzyjnego oraz niezachowanie spokoju przez samego chirurga. Po tej procedurze można przeprowadzić dowolną powszechną procedurę eksperymentalną, w tym oznaczanie parametrów elektrofizjologicznych i obchodzenia się z wapniem, immunocytochemię, odpowiedź przerostową i badania sygnalizacji oraz symulowane badania reperfuzji niedokrwiennej.