Name: Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę oceny płodności i płodności komarów Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowej. Protokół ten znacząco skraca czas, przestrzeń i nakład pracy w porównaniu do konwencjonalnych metod.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program za dofinansowanie. Dziękujemy również członkom laboratorium Adelmana za pomoc w opracowaniu tej metody i sugestiom podczas redagowania manuskryptu, a także członkom laboratorium Kevina Mylesa. Dziękujemy również recenzentom i redaktorom za pomoc w ulepszaniu tego manuskryptu.

1. Przygotowanie talerza
<ol>
	<li>Wywierć otwory w 24-dołkowych pokrywach płytek do hodowli tkankowych (4−6 otworów na studzienkę) za pomocą wiertarki domowej z wiertłem ~1,6 mm (1/16 cala) (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Otwory te zapobiegają gromadzeniu się kondensacji wody z agarozy na pokrywie, gdzie komary mogą składać jaja. Standardowy rozmiar samicy Ae. aegypti (szczep "Liverpool") wynosi ~3,11 mm rozpiętości skrzydeł. Zmniejszenie rozmiaru otworów jest zalecane w przypadku stosowania mniejszych komarów, aby uniknąć ucieczki z płytki.</li>
	<li>W dniu poprzedzającym eksperyment z składaniem jaj umyj i dokładnie opłucz płytki, a następnie namocz je w 1−5% wybielaczu przez 30−60 min w temperaturze pokojowej. Dokładnie spłucz je pod bieżącą wodą dejonizowaną i wysusz. 
	UWAGA: Proces ten zmniejsza ryzyko rozwoju grzybów i bakterii na agarozie.</li>
	<li>Rozpuść agarozę w stężeniu 2% w wodzie dejonizowanej i natychmiast dodaj 500 μl stopionej agarozy do każdej studzienki z 24 dołków za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 3A,B). Gdy agaroza zacznie się ochładzać i zatykać końcówkę pipety, podgrzej ją ponownie i użyj nowej końcówki do pipety. 
	UWAGA: Unikaj dotykania ścianek studzienki końcówką pipety, ponieważ może to pozostawić kawałek agarozy na ścianie, w której samica może złożyć jaja, komplikując proces obrazowania i liczenia.</li>
	<li>Przed użyciem należy wysuszyć kondensację pary wodnej na ściankach studzienki przez noc na stole laboratoryjnym (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 3C, D). 
	UWAGA: Oś czasu testu EAgaL od podania krwi do obrazowania larw jest przedstawiona na <silna klasa = "xfig" >Rycina 4, która dotyczy komarów kolonijnych (Ae. aegypti "Liverpool" hodowanych w świetle 14 godzin: 10 godzin ciemnego cyklu światła, 27 °C, 80% wilgotności względnej, 500 larw w tacy o wymiarach 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm z 2 litrami wody), w warunkach owadobójczych. Zaleca się, aby każde laboratorium przeprowadziło test na płytce EAgaL z używanymi komarami, zwłaszcza w przypadku stosowania różnych szczepów, różnych gatunków komarów, a także różnych protokołów hodowli.</li>
</ol>
2. Karmienie komarów
UWAGA: Niezwykle ważne jest używanie komarów hodowanych w jednolitych warunkach dla wszystkich grup badanych i kontrolnych, ponieważ odżywianie larw ma wpływ na parametry kondycjonalizacji komarów10,11. Larwy z tyłu w warunkach niezatłoczonych z wystarczającą ilością pokarmu. Pozwól samicom komarów zbliżyć się w obecności samców, aby zapewnić krycie i dojrzewać przez co najmniej 3 dni.
<ol>
	<li>Usuń wszelkie źródło wody i/lub cukru z samic komarów co najmniej 16 godzin przed karmieniem krwią, aby zwiększyć odżywianie krwią.</li>
	<li>Podgrzej cyrkulator wody do sztucznego karmienia w temperaturze 37 °C i karm samice komarów krwią kręgowców umieszczoną w sztucznych karmnikach przez 15−30 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A).</li>
	<li>Znieczulij komary CO2 lub na lodzie, przenieś je do szklanego naczynia na lodzie i wybierz te, które są nabrzmiałe krwią (<silna klasa="xfig">Ryc. 5B) do pojemnika zaopatrzonego w 30% sacharozę na ponad 72 godziny, kiedy samice zakończą wydalanie i rozwój jaj. 
	UWAGA: Jeśli samice są zaopatrzone w wodę z sacharozą o niższym stężeniu, po 48 godzinach usuń wodę z sacharozy i wszelkie mokre powierzchnie, aby zapobiec składaniu jaj przez samice.</li>
</ol>
3. Składanie jaj
<ol>
	<li>Około 1 godzinę przed przeniesieniem komarów na płytki dodaj 2-3 krople (~80-120 μL) wody do każdej płytki za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Co najmniej 72 godziny po karmieniu krwią powal komary CO2 lub na lodzie, przenieś je do szklanego naczynia na lodzie i indywidualnie umieść każdego komara na odwróconej pokrywie 24-dołkowej płytki na lodzie (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A). 
	UWAGA: Ta procedura została zastosowana przez Ioshino et al.9.</li>
	<li>Po umieszczeniu wszystkich 24 komarów przykryj pokrywę odwróconym dnem płytki (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B), zabezpiecz pokrywę i płytkę nową, nową gumką i umieść w komorze środowiskowej (lub pomieszczeniu hodowlanym) (<silna klasa="xfig">Rysunek 6C), aż komary wyzdrowieją (~10−15 min) i obróć płytkę prawą stroną do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 6D).</li>
	<li>Pozwól samicom komarów złożyć jaja przez 24−48 godzin i usuń samice, uwalniając je z płytek do dużej klatki. 
	UWAGA: Jeśli ważne jest, aby śledzić poszczególne samice, znieczul je, schładzając płytki i usuwaj je pojedynczo na lodzie. Opóźnione składanie jaj i ciemne wydzieliny, które zakłócają liczenie jaj, zaobserwowano, gdy samice zostały przeniesione na płytki przed 72 godzinami po posiłku z krwi (PBM) (<silna klasa = "xfig">Ryc. 7D).</li>
</ol>
4. Liczenie jaj
<ol>
	<li>Należy sprawdzić każdą studzienkę na płytce 24-dołkowej, ponieważ czasami komary składają jaja na ścianach studzienek i na brzegu powierzchni agarozy/tworzywa sztucznego, gdzie są trudne do rozpoznania na zdjęciach. Za pomocą mokrego pędzla przesuń jaja ułożone na ścianie i krawędzi agarozy na płaską powierzchnię agarozy tak, aby wszystkie jaja znajdowały się w jednolitej płaszczyźnie i nie zachodziły na siebie. 
	UWAGA: Krawędź agarozy zwykle znajduje się poza płaszczyzną ogniskowej aparatu ze względu na napięcie powierzchniowe roztworu agarozy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy usuń wszelkie złamane nogi, skrzydła i inne cząstki w studzienkach, które mogą zakłócać obrazowanie jaj (<silna klasa = "xfig">Rysunek 7C).</li>
	<li>Włóż biały papier pod płytkę, aby zwiększyć kontrast z ciemnymi jajami komarów przed obrazowaniem za pomocą oświetlacza stereomikroskopowego (<silna klasa="xfig">Ryc. 7A).</li>
	<li>Wykonaj zdjęcie każdej studzienki za pomocą kompaktowej kamery cyfrowej w trybie mikroskopu, który pozwala użytkownikowi ustawić ostrość na obiektach znajdujących się w odległości do 1 cm. Ta funkcja pozwala na umieszczenie kamery bezpośrednio na płycie w celu obrazowania jaj bez statywu lub stojaka (<silna klasa="xfig">Rysunek 7A). Aby rozróżnić pojedyncze jaja złożone w kępach, użyj trybu drobnego lub bardzo drobnego, aby uchwycić obrazy w wysokiej rozdzielczości, aby można było zobaczyć szczegóły z bliska. 
	UWAGA: Przed użyciem wyczyść kartę pamięci aparatu, aby zapobiec pomyleniu nowych i starych obrazów.</li>
	<li>Po sfotografowaniu każdego dołka płytki, zrób zdjęcie całej płytki z etykietą kolejności obrazowania, aby później odróżnić każdą płytkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 7E).</li>
	<li>Dodaj cienką warstwę ~5 kropli wody (~200 μL) za pomocą pipety transferowej do każdej studzienki, aby zapobiec wysuszeniu czopu agarozowego i jaj oraz wywołać rozwój i wykluwanie się zarodka. Zwracaj uwagę na poziom wody przez pierwsze kilka godzin i sprawdzaj codziennie, ponieważ może dojść do utraty wody w wyniku wchłaniania przez agarozę lub parowania. Dodać wodę, gdy jej poziom jest zbyt niski, aby larwy mogły się wykluć. 
	UWAGA: Parowanie wody zachodzi nierównomiernie zarówno w obrębie płytki, jak i w stosie płytek. Zaobserwowano, że suszenie odbywa się w następującej kolejności: 1) studnie narożne (A1, A6, D1, D6) schną najszybciej; po którym następują 2) studzienki na zewnętrznej krawędzi płytki (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); i ostatnie 3) studnie w środku. Gdy talerze są układane w stosy, górna płyta wysycha najszybciej.</li>
	<li>Przenieś obrazy do komputera za pomocą ImageJ (Fidżi) i zmień nazwy plików w celu łatwiejszej organizacji, na przykład "[identyfikator płyty]_[identyfikator studni].jpg" (<silna klasa="xfig">Rysunek 8A,B).</li>
	<li>Utwórz plik arkusza kalkulacyjnego, aby zapisać liczbę jaj (tj. płodność) i liczbę larw oraz obliczyć wskaźnik wylęgu (tj. płodność) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 9E).</li>
	<li>Otwórz obrazy za pomocą ImageJ (Fiji)12 i użyj narzędzia "multi-point", aby oznaczyć każde jajko (Rysunek 9A−C); powiększ lub pomniejsz za pomocą "+" lub "–", aby policzyć jaja w kępy. Po zaznaczeniu wszystkich jaj kliknij dwukrotnie ikonę wielopunktową, aby wyświetlić liczbę znaków (Rysunek 9D). Zapisz wyniki w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
</ol>
5. Ocena płodności
UWAGA: Za 2 dni, pierwsze larwy w stadium rozwojowym mogą zacząć zamykać się w studzienkach. Odczekaj jeszcze 3-5 dni przed obrazowaniem/liczeniem, aby upewnić się, że wykluwają się wszystkie zdolne do życia jaja.
<ol>
	<li>Przygotuj pokarm dla larw, mieszając 1/16 łyżki stołowej (~168 mg) zmielonego pokarmu dla ryb (tj. normalnej diety larw komarów) w 20 ml wody i czekając, aż duże cząstki stałe osiądą (<silna klasa = "xfig">Rysunek 10A−D). Zacznij dodawać pokarm (supernatant) do studzienek, w których wykluły się larwy, gdy tylko się pojawią, ponieważ nie przetrwają one długo bez jedzenia. 
	UWAGA: Nadmierne dodanie cząstek pokarmu może zakłócać obrazowanie i liczenie wyklutych larw.</li>
	<li>Około 5–8 dni po dodaniu wody do studzienek schłodzić płytkę, przykrywając pokruszonym lodem przez 15-20 minut w celu znieczulenia larw.</li>
	<li>Zrób zdjęcia każdej studzienki, trzymając talerze na lodzie, tak jak to miało miejsce w przypadku jaj. W przypadku obrazów larwalnych należy zapewnić ciemne tło, umieszczając materiał pod płytką, aby zwiększyć kontrast. Po sfotografowaniu każdej studzienki na płytce zrób zdjęcie całej płytki z etykietą kolejności obrazowania, aby później odróżnić każdą płytkę. 
	UWAGA: Obrazy są wykonywane, gdy płytki znajdują się na lodzie, ponieważ ruch larw może zagrozić liczeniu. Talerze są wielokrotnego użytku; Zamroź i usuń komary i agarozę, aby oczyścić je do następnego użycia. Płytka EAgaL nie nadaje się do hodowli larw do zaawansowanych stadiów.</li>
	<li>Otwórz obrazy za pomocą ImageJ (Fidżi) i użyj narzędzia "wielopunktowego", aby policzyć, klikając każdą larwę. W okresie 3-5 dni niektóre larwy mogły się wylinić, zwłaszcza w studniach o małej liczbie larw. Dlatego przy liczeniu należy wykluczyć zrzucone skórki (tj. wysięki), które wyglądają jak larwy tylko na głowie z odrobiną ciała, lub skurczone larwy (<silna klasa="xfig">Ryc. 10E). Zapisz wyniki w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
</ol>
6. Wykonaj analizę
<ol>
	<li>Po zebraniu wszystkich niezbędnych danych do analizy płodności i płodności wykonaj odpowiednią analizę statystyczną i stwórz wykresy za pomocą preferowanego oprogramowania.</li>
</ol>

<ol><li>Bond, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+irradiation+dose+to+Aedes+aegypti+and+Ae.+albopictus+in+a+sterile+insect+technique+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program.</a> PLoS One. 14 (2), 0212520(2019).</li>
<li>Fernandes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+larvae+treated+with+spinosad+produce+adults+with+damaged+midgut+and+reduced+fecundity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity.</a> Chemosphere. 221, 464-470 (2019).</li>
<li>Inocente, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticidal+and+Antifeedant+Activities+of+Malagasy+Medicinal+Plant+%28Cinnamosma+sp.%29+Extracts+and+Drimane-Type+Sesquiterpenes+against+Aedes+aegypti+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Insects. 10 (11), 373(2019).</li>
<li>Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+transgenesis%3A+what+is+the+fitness+cost%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Mosquito transgenesis: what is the fitness cost.</a> Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).</li>
<li>da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+blood-free+diet+for+Anopheles+darlingi+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. , 217(2019).</li>
<li>Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+serum+and+BSA%2C+but+neither+red+blood+cells+nor+hemoglobin+can+support+vitellogenesis+and+egg+production+in+the+dengue+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti.</a> PeerJ. 3, 938(2015).</li>
<li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+SkitoSnack%2C+an+Artificial+Blood+Meal+Replacement%2C+on+Aedes+aegypti+Life+History+Traits+and+Gut+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11023(2018).</li>
<li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Candidate+Iron+Transporters+From+the+ZIP%2FZnT+Gene+Families+in+the+Mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380(2018).</li>
<li>Ioshino, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviplate%3A+A+Convenient+and+Space-Saving+Method+to+Perform+Individual+Oviposition+Assays+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti.</a> Insects. 9 (3), 103(2018).</li>
<li>Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+mosquitoes%2C+large+implications%3A+crowding+and+starvation+affects+gene+expression+and+nutrient+accumulation+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti.</a> Parasites & Vectors. 8, 252(2015).</li>
<li>Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+vector+arthropod+culture%3A+an+example+using+the+African+malaria+mosquito%2C+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae).</a> Malaria Journal. 15 (1), 262(2016).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w tym badaniu.

Płytka EAgaL drastycznie zmniejsza nakład pracy, czas i miejsce do przeprowadzania indywidualnych testów płodności i płodności w Aedes aegypti w porównaniu z metodą FT. Wstępne porównanie metody FT z płytką EAgaL zaowocowało skróceniem czasu dla wszystkich etapów (do metody FT zastosowano technikę obrazowania) (tab. 1). Jako odniesienie, szacunkowe koszty uruchomienia i testu (jedna 24-dołkowa płytka EAgaL w porównaniu z 24 FT) przedstawiono w tabeli 2.
<p class="jo...

Kontrola komarów w celu ochrony ludzi przed patogenami przenoszonymi przez wektory jest ważnym celem zdrowia publicznego, głównie ze względu na brak skutecznych szczepionek dla większości patogenów przenoszonych przez komary. Wiele badań ma na celu zmniejszenie sprawności komarów w połączeniu ze strategią redukcji populacji stosowaną w terenie1,2,3. Obejmuje to szeroko zakrojone badania mające na celu stworzenie transgenicznych komarów i/lub linii nokautujących CRISPR/Cas9. Takie podejścia do modyfikacji populacji wymagają szczegółowej oceny indywidualnych parametrów sprawności4. Konwencjonalne techniki laboratoryjne do oceny przydatności samic komarów obejmują indywidualne przechowywanie pokrytych, karmionych krwią samic komarów w pojemnikach o pojemności 100 ml5, zmodyfikowane probówki stożkowe o pojemności 50 ml lub probówki do hodowli Drosophila zmodyfikowane przez zapewnienie wilgotnych powierzchni przy użyciu wilgotnej bawełny i krążków z bibuły filtracyjnej do składania jaj (tj. bibułki jaj)1,2,6,7. Takie metody wymagają stosunkowo dużej przestrzeni (np. 30 cm x 30 cm x 10 cm: szer. x dł. x wys. dla maksymalnie 100 probówek Drosophila) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), oraz manipulowania pojedynczymi bibułkami jaj do liczenia jaj i larw wylęgowych, co może być pracochłonne. W tym manuskrypcie przedstawiono metodę liczenia jaj komarów i określania szybkości wylęgu przy użyciu 24-dołkowych płytek i agarozy jako powierzchni do składania jaj w celu obejścia tych problemów8.
Równocześnie, Ioshino et al.9 opisali szczegółową metodę wykorzystującą płytki 12- i 24-dołkowe do liczenia jaj uzyskanych od poszczególnych samic. Ich protokół stanowił znaczną poprawę w stosunku do konwencjonalnych metod w zakresie oszczędności czasu i miejsca9. Jednak opisany przez nich protokół nadal wykorzystuje mokrą bibułę filtracyjną jako powierzchnię do składania jaj, co wymaga rozłożenia każdego pojedynczego papieru w celu uzyskania liczby, ponieważ jaja często znajdują się pod spodem lub w fałdach. Ich protokół nie obejmował również wykorzystania technologii obrazowania ani metody liczenia larw.
Prezentowana jest ulepszona metoda przeprowadzania testów dopasowania do liczby jaj (tj. płodności) i szybkości wylęgu (tj. płodności) przy użyciu agarozy jako powierzchni do składania jaj w formacie 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej dla Ae. aegypti, które składają jaja na wilgotnych powierzchniach. Tabliczki te nazywano płytkami "EAgaL", od Egg, Agarose, oraz Larva. Te 24-dołkowe płytki zapewniają poszczególnym komarom minimalną powierzchnię do składania jaj, upraszczając w ten sposób i drastycznie skracając czas i wysiłek potrzebny do liczenia i utrzymywania jaj i wyklutych larw przez kilka dni. Płytka EAgaL wykorzystuje półprzezroczystą agarozę do powierzchni składania jaj, co eliminuje potrzebę obchodzenia się z papierami jajowymi oraz znajdowania jaj i larw po wykluciu; Fotografowanie każdego dołka pozwala na długoterminową archiwizację wyników i oddziela proces liczenia zarówno pod względem czasu, jak i przestrzeni od procesu hodowli/obróbki, w którym czas jest często ograniczony.

<table><tbody><tr>Wiertło <td></td><td></td><td>1,6 mm &Phi;</td><td>alternatywnie można stosować podgrzewane gwoździe</td></tr><tr><td>1000 &mu; L końcówki do pipet (długie)</td><td>Olympus plastics</td><td>24-165RL</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkanek</td><td>Thermo Scientific</td><td>930186</td><td>przezroczysta, płaska z płytkimi z pierścieniem</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>VWR</td><td>0710-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowy aparat cyfrowy</td><td>Olympus</td><td>TG-5/TG-6</td><td></td></tr><tr><td>Komputer (Windows, Mac lub Linux)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pobieranie oprogramowania</td><td></td><td></td> Fidżi (imageJ) <td>z: https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>Kleszcze</td> Ostre kleszcze <td>Dumont</td><td></td><td>mogą złamać ciało komara</td></tr><tr><td>Szklane szalki Petriego</td><td></td> Wybielacz domowy VWR <td></td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz do wiertarek</td><td></td><td></td><td></td>elektrycznych do użytku domowego</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> mikroskop stereoskopowy (gęsia szyja)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P-1000</td> Pędzle <td>malarskie</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Gilson <tr><td>Gumki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karta</td><td></td><td></td> SD <td>do nagrywania obrazów z aparatu cyfrowego (DSHC, SDXC powinny być lepsze)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych (Microsoft Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Każde oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych działa</td></tr><tr><td>TetraMin pokarm dla ryb</td><td>Tetra</td><td></td><td>mielony z młynkiem do kawy, blenderem lub tłuczkiem</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>VWR</td><td>16011-188</td><td></td></tr></tbody></table>

ulepszony test płodności i płodności dla aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki eagal)

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Komary stanowią poważny problem zdrowia publicznego jako wektory różnych patogenów. W przypadku tych badań, które wymagają oceny parametrów przystosowania komarów, w szczególności produkcji jaj i wskaźników wylęgu na poziomie indywidualnym, konwencjonalne metody stanowią znaczne obciążenie dla badaczy ze względu na wysoką pracochłonność i wymagania dotyczące przestrzeni laboratoryjnej. Opisana jest prosta metoda wykorzystująca 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z agarozą w każdym dołku i cyfrowym obrazowaniem każdej studzienki w celu określenia liczby jaj i wskaźników wylęgu na indywidualnym poziomie przy znacznie zmniejszonych wymaganiach czasowych i przestrzennych.

Komary wstrzyknięto dsRNA ukierunkowanym na kandydata na transporter żelaza (FeT) lub gen kontrolny (EGFP), podano im krew, a następnie zmierzono płodność i liczbę potomstwa z wykorzystaniem metody płytek EAgaL, zgodnie z opisaną powyżej procedurą.
Komary, u których wyciszono ekspresję FeT po wstrzyknięciu dsRNA, wykazały znaczną redukcję zarówno liczby jaj, jak i wskaźnika wylęgu (Rycina 11A−C). Wszystkie komary z grupy kontrolnej i badawczej umi...

Opisana to oszczędzająca czas i miejsce metoda liczenia jaj i określania szybkości wylęgu poszczególnych komarów za pomocą 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, co może znacznie zwiększyć skalę i szybkość testów płodności i płodności.

Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Ta procedura pozwala badaczom komarów łatwo zająć się sprawnością reprodukcyjną komarów na poziomie indywidualnym. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami, protokół ten znacznie skraca czas, przestrzeń i pracę wymaganą do zbadania płodności i płodności komarów na poziomie indywidualnym. Zacznij od przygotowania płytek do eksperymentu z składaniem jaj.Wywierć od czterech do sześciu otworów na studzienkę w pokrywie 24-dołkowej płytki hodowlanej za pomocą wiertarki domowej z wiertłem o średnicy 1,6 milimetra. Dzień przed eksperymentem umyj i opłucz płytki i namocz je w wybielaczu od 1% do 5% przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dokładnie opłucz płytki pod bieżącą wodą dejonizowaną i wysusz je.Rozpuść 2% agarozę w wodzie dejonizowanej i natychmiast dodaj 500 mikrolitrów stopionej agarozy do każdej studzienki 24-dołkowej płytki. Pozostaw płytki na stole laboratoryjnym na noc, aby wysuszyć kondensację. Co najmniej 16 godzin przed karmieniem krwią usuń wszelkie źródło wody lub cukru z samic komarów.W dniu karmienia podgrzej cyrkulator wody do 37 stopni Celsjusza i nakarm komary krwią kręgowców umieszczoną w sztucznych karmnikach przez 15 do 30 minut. Następnie przenie

improved-fecundity-fertility-assay-for-aedes-aegypti-using-24-well

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie opornego na wirusa dengue, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom wirusowym u komarów. Niniejszy protokół ilustruje sposób badania stopnia zakażenia komarów wirusem dengue. Przedstawiono techniki namnażania wirusa w kulturze, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania miana wirusa w jelicie środkowym komara.

Protokół infekcji denga w komarach (A. aegypti) i określanie fenotypu infekcji

Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące selekcji klonalnych linii komórkowych oraz testu bioluminescencji wapniowej w celu analizy relacji struktura-aktywność syntetycznych neuropeptydów stawonogów względem ich pokrewnych receptorów GPCR. Test ten może być wykorzystany do deorfanizacji receptorów oraz badań relacji struktura-aktywność na potrzeby projektowania analogów syntetycznych oraz odkrywania peptydów i potencjalnych leków.

Analiza funkcjonalna receptorów sprzężonych z białkiem G u komarów (Aedes aegypti) i kleszczy (Rhipicephalus microplus) z wykorzystaniem testu bioluminescencji wapniowej

Aby osiągnąć supresję populacji Aedes aegypti przy użyciu systemu RIDL® (Release of Insects carrying a Dominant Lethal), konieczne jest uwolnienie dużych liczb samców komarów. Wymaga to zastosowania technik i technologii masowej hodowli w celu zapewnienia niezawodnych systemów pozwalających na uzyskanie maksymalnej liczby wysokiej jakości samców komarów.

Masowa produkcja genetycznie zmodyfikowanych Aedes aegypti do wypuszczeń w terenie w Brazylii

Test EIW (egg-in-worm) jest użyteczną metodą do ilościowego określenia zachowania podczas składania jaj. Zmiany w składaniu jaj mogą być reakcją behawioralną organizmu modelowego Caenorhabditis elegans na potencjalnie szkodliwe substancje środowiskowe, takie jak te wytwarzane przez bakterie chorobotwórcze.

Pomiar wpływu bakterii na zachowanie C. elegans za pomocą testu retencji jaj

Komary Aedes aegypti zakażone Wolbachią są uwalniane do naturalnych populacji w celu zahamowania transmisji arbowirusów. Opisujemy metody hodowli Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia w laboratorium do eksperymentów i uwolnienia w terenie, podejmując środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji i selekcji laboratoryjnej.

Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia

Protokół hodowli pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis. Pasożyt przechodzi z jednego pokolenia komarów Aedes aegypti do następnego poprzez przenoszenie poziome w stadium larwalnym, a następnie przenoszenie pionowe w stadium dorosłym. Żywe sporoplazmy przeżywają długotrwale w zakażonych jajach.

Rozmnażanie pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis w komarach Aedes aegypti

Technika sterylnych owadów (SIT) jest używana do kontrolowania określonych, ważnych z medycznego punktu widzenia populacji komarów, które mogą być odporne na chemiczne kontrole. W tym miejscu opisujemy metodę masowego chowu i przygotowania bezpłodnych samców komarów do wypuszczenia na wolność w operacyjnym programie SIT ukierunkowanym na komara Aedes aegypti.

Przygotowanie napromieniowanych i oznakowanych samców komarów Aedes aegypti do uwolnienia w operacyjnym programie techniki sterylnych owadów

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy ogólną metodę określania żywotności embrionalnej i całkowitej liczby wyprodukowanych zarodków (czerwiu) za pomocą organizmu modelowego C. elegans.

Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans

Obecny protokół opisuje, jak mierzyć dane dotyczące typowych parametrów życia komarów Aedes aegypti, w tym płodności, rozmiaru skrzydeł, płodności, stosunku płci, żywotności, czasu rozwoju, wkładu samców i długowieczności dorosłych. Pomiary te można wykorzystać do oceny przydatności komarów transgenicznych.

Ilościowe określanie kosztów przystosowania u transgenicznych komarów Aedes aegypti

Niniejsze badanie przedstawia elastyczną i standaryzowaną platformę do badania wylęgu jaj u Caenorhabditis elegans, która integruje wiele formatów eksperymentów. Podejście to poprawia reproduktywalność, skalowalność i dostępność, umożliwiając solidną ocenę działania leków i procesów rozwojowych, przy zachowaniu niskich kosztów i łatwej adaptacji zarówno do zastosowań badawczych, jak i edukacyjnych.

Proste i dostępne testy wylęgania jaj w Caenorhabditis elegans: elastyczne formaty do przesiewowych badań nad lekami

Poznaj ulepszoną metodę oceny płodności i płodności komarów Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowej. Protokół ten znacząco skraca czas, przestrzeń i nakład pracy w porównaniu do konwencjonalnych metod.

Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL)

Przeglądaj więcej filmów