Name: Odlew naczyniowy płuc myszy dorosłych i wczesnych po urodzeniu do obrazowania mikro-CT (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj technikę odlewu naczyniowego płuc myszy dorosłych i wczesnych po urodzeniu do obrazowania mikro-CT. Ta metoda umożliwia wizualizację sieci naczyniowej przy zachowaniu integralności tkanek miękkich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez NHLBI Intramural Research Program (DIR HL-006247). Chcielibyśmy podziękować NIH Mouse Imaging Facility za wskazówki w zakresie pozyskiwania i analizy obrazów.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (ACUC) Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Wstrzyknąć myszy dootrzewnowo heparynę (1 jednostka/g masy ciała myszy) i pozwolić jej poruszać się przez 2 minuty.</li>
	<li>Poddać zwierzę eutanazji w komorze CO2 .</li>
	<li>Ułóż mysz w pozycji leżącej na desce chirurgicznej i przymocuj wszystkie cztery kończyny do deski za pomocą taśmy. Użyj powiększenia, aby uzyskać dokładne rozeznanie.</li>
</ol>
2. Odsłanianie płuc i tchawicy
<ol>
	<li>Spryskaj brzuszną stronę myszy 70% etanolem, aby zminimalizować ingerencję włosów.</li>
	<li>Chwyć skórę brzucha kleszczami i wykonaj małe nacięcie nożyczkami w okolicy pępka. Wsuń końcówki nożyczek w warstwę powięziową między mięśniami brzucha a skórą i zacznij rozdzielać dwie warstwy. Pracuj rostralnie, usuwając skórę z brzucha, klatki piersiowej i szyi.</li>
	<li>Otwórz mięśnie brzucha nożyczkami i tnij bocznie po obu stronach, aż przepona zostanie odsłonięta.</li>
	<li>Delikatnie chwyć wyrostek mieczykowaty i lekko unieś klatkę piersiową, maksymalizując widok płuc ogonowych przez cienką, półprzezroczystą przeponę. Ostrożnie wykonaj małe nacięcie w przeponie tuż pod wyrostkiem mieczykowatym. Płuca zapadną się i wycofają z przepony. Wypreparuj przeponę z dala od klatki piersiowej, uważając, aby nie naciąć miąższu płuca.</li>
	<li>Zlokalizuj i odetnij żyłę główną dolną (IVC) i przełyk w miejscu, w którym przechodzą przez przeponę. Użyj gazy, aby oczyścić gromadzącą się krew w klatce piersiowej, unikając kontaktu z płucami.</li>
	<li>Chwyć mieczykowatą część mieczykowatą jeszcze raz i delikatnie unieś. Przeciąć klatkę piersiową obustronnie (mniej więcej na linii środkowej pachy), unikając kontaktu z płucami. Całkowicie usuń przednią klatkę piersiową, wykonując ostatnie cięcie wzdłuż kąta mostka tuż przed rękojmią.</li>
	<li>Za pomocą ampułkostrzykawki obficie zwilż płuca solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH 7,4), aby zapobiec wysuszeniu. Kontynuuj tę rutynę przez cały zabieg.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy chwyć rękojeść i delikatnie unieś się od ciała. Za pomocą nożyczek przetnij 1-2 mm bocznie do manubrium, odcinając obojczyki i usuń. Spowoduje to odsłonięcie grasicy pod spodem.</li>
	<li>Chwyć każdy płat grasicy, rozsuń i usuń. Powtórz tę procedurę z gruczołem podżuchwowym. Na koniec usuń tkankę mięśniową pokrywającą tchawicę. 
	UWAGA: Po sekcji powinno być widoczne serce, aorta wstępująca (AA), tętniczy pień płucny (PAT) i tchawica. Upewnij się, że główne gałęzie tętnic od pnia nie są podzielone ani uszkodzone.</li>
</ol>
3. Cewnikowanie PA i perfuzja krwi
<ol>
	<li>Aby zmontować jednostkę 1, nakręć 15 cm rurki PE-10 na piastę igły 30 G i podłącz do strzykawki o pojemności 1 ml wstępnie napełnionej 10-4 M nitroprusydkiem sodu (SNP) w PBS. Zalać rurkę, przesuwając tłok, aż całe powietrze zostanie usunięte z tego urządzenia ( <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1). 
	UWAGA: SNP jest toksyczny w przypadku połknięcia. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Po użyciu dokładnie umyć skórę. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
	<ol>
		<li>Alternatywnie zmontuj jednostkę 2. W przypadku myszy po urodzeniu w 7 dniu (P7) i młodszych, użyj hemostatu, aby odłączyć dodatkową igłę 30 G od piasty i nawlecz igłę na otwarty koniec rurki jednostki 1 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamiast igły użyj zakrzywionych ostrych kleszczy, aby chwycić jeden koniec jedwabiu 7-0 o długości 10 cm. Przeniknij do wierzchołka serca, wchodząc z jednej strony i przechodząc końcówkami kleszczy przez mięsień i wychodząc z drugiej strony. Chwyć jedwab innym zestawem kleszczy i przeciągnij przez niego o długości około 2 cm i zwiąż. Weź pozostały 8 cm koniec szwu, szarpiąc doogonowo serce, i przyklej koniec do deski chirurgicznej. 
	UWAGA: Spowoduje to powstanie napięcia, dodatkowo odsłaniając wielkie naczynia i wiążąc serce na miejscu, co pozwoli na łatwiejsze umieszczenie cewnika w tętnicy płucnej.</li>
	<li>Zaczep końcówki zakrzywionych kleszczy zarówno pod AA, jak i PAT. Przeciągnij 3 cm jedwabiu 7-0 z powrotem przez otwór i utwórz luźny szew jednorzutowy.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wykonaj 1-2 mm nacięcie w kierunku wierzchołka serca, penetrując cienkościenną prawą komorę (RV), aby umożliwić wprowadzenie cewnika (Jednostka 1). Przed włożeniem upewnij się, że w systemie nie ma powietrza. Wprowadzić zagruntowany przewód do prawej komory i delikatnie wsunąć się w półprzezroczysty cienkościenny PAT.
	<ol>
		<li>Wizualnie sprawdź, czy cewnik nie przesunął się ani do lewej, ani do prawej gałęzi płucnej i nie przylega do punktu rozgałęzienia tętnicy płucnej. Za pomocą taśmy przymocuj dystalną część rurki do deski chirurgicznej. 
		UWAGA: Aby zidentyfikować kampera, użyj kleszczy, aby uszczypnąć prawą stronę serca. W przeciwieństwie do lewej komory, stosunkowo cienka wolna ściana RV powinna być łatwa do uchwycenia.</li>
		<li>W przypadku myszy młodszych niż P7 podłącz jednostkę 2 do mikromanipulatora i wprowadź końcówkę igły urządzenia do PAT, jak opisano powyżej, za pomocą manipulatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie zaciśnij luźny szew wokół obu wielkich naczyń krwionośnych i odetnij szew o długości 8 cm utworzony w kroku 3.2, aby przywrócić serce do naturalnej pozycji spoczynkowej. Cewnik jest teraz mocno zamocowany w PAT.</li>
	<li>Przytnij lewą małżowinę uszną serca, aby umożliwić perfuzatorowi opuszczenie systemu.</li>
	<li>Zabezpiecz strzykawkę zawierającą SNP (jednostka 1 lub jednostka 2, w zależności od rozmiaru) w pompie strzykawkowej i ukrwić roztwór z szybkością 0,05 ml/min, aby przepłukać krew i maksymalnie rozszerzyć naczynia krwionośne. Krew/perfuzat wydostanie się przez przyciętą małżowinę uszną. Kontynuuj perfuzję, aż perfuzat stanie się czysty (~200 μl u dorosłej myszy, mniej u młodszych zwierząt). 
	UWAGA: Podczas perfuzji PBS/SNP o niskiej lepkości zastosowano stosunkowo wyższą szybkość infuzji w celu zaoszczędzenia czasu. Bardziej lepki związek polimerowy jest podawany w wolniejszym tempie, aby zapobiec przepełnieniu, pęknięciu i zmaksymalizować kontrolę nad dystalnymi punktami końcowymi.</li>
</ol>
4. Tracheostomia i nadmuchiwanie płuc
<ol>
	<li>Skonstruuj jednostkę do pompowania płuc (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
	<ol>
		<li>Podłączyć elastyczny plastikowy cewnik dożylny (IV) 24 G (bez igły)/zestaw do infuzji motylkowej do kranu odcinającego, podłączony do otwartej strzykawki 50 ml (bez tłoka). Zawiesić strzykawkę na stojaku na pierścienie.</li>
		<li>Dodać 10% buforowanej formaliny do strzykawki. Otwórz zawór odcinający, pozwalając formalinie dostać się do rurki i usunąć całe powietrze z systemu. Zamknąć kran i podnieść strzykawkę, aż łąkotka znajdzie się 20 cm nad tchawicą8. 
		UWAGA: Formalina jest łatwopalna, rakotwórcza, ostro toksyczna po spożyciu i powoduje podrażnienie skóry, poważne uszkodzenie oczu, uczulenie skóry i mutagenność komórek rozrodczych. Unikać spożycia i kontaktu ze skórą i oczami. Unikać wdychania oparów lub mgły. Przechowywać z dala od źródeł zapłonu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść dwa luźne szwy poniżej chrząstki sercowej w odległości 2-4 mm od siebie.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wykonaj małe nacięcie w więzadle pierściennym tarczycy lepszym niż szwy.</li>
	<li>Włóż cewnik dożylny do otworu i przesuń końcówkę poza dwa luźne szwy.</li>
	<li>Zaciśnij szwy wokół tchawicy i otwórz kurek. Pozwól, aby formalina dostała się do płuc grawitacyjnie i poczekaj 5 minut, aż płuca całkowicie się napełnią. Jeśli płuca przylegają do klatki piersiowej podczas pompowania, chwyć zewnętrzną część klatki piersiowej szczypcami i poruszaj się we wszystkich kierunkach, aby pomóc w uwolnieniu płatów. Nie dopuszczać do bezpośredniego kontaktu z płucami.</li>
	<li>Po 5 minutach cofnij cewnik dożylny poza pierwszy szew i podwiązaj. Powtórz dla drugiego szwu. Płuca są teraz napompowane w stanie zamkniętym, pod ciśnieniem.</li>
</ol>
5. Odlewanie układu naczyniowego
<ol>
	<li> W probówce o pojemności 1,5 ml przygotuj 1 ml roztworu 8:1:18 polimeru:rozcieńczalnik:utwardzacz i delikatnie odwróć kilka razy, aby zapewnić dobre wymieszanie.</li>
	<li>Wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 1 cm3, przykryć przeciwległy koniec palcem w rękawiczce i wlać związek polimerowy do strzykawki. Ostrożnie włożyć tłok z powrotem, odwrócić i przesunąć tłok, aby usunąć całe powietrze i utworzyć menisk na końcu strzykawki.</li>
	<li>Wyjąć strzykawkę SNP/PBS z węzła igły i wlać do niej dodatkowy PBS, aby utworzyć menisk. Dokładnie sprawdź piastę pod kątem uwięzionego powietrza, w razie potrzeby usuń i zreformuj łąkotkę. Połączyć piastę ze strzykawką wypełnioną związkiem polimerowym. 
	UWAGA: Utworzenie menisku na obu końcach znacznie zmniejsza szansę na przedostanie się powietrza do systemu.</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę wypełnioną związkiem polimerowym do pompy strzykawkowej i zainparować w ilości 0,02 ml/min. 
	UWAGA: W przypadku mniejszych płuc wolniejsze tempo może być pomocne, aby zapobiec przepełnieniu, ale nie jest konieczne.</li>
	<li>Monitoruj związek, gdy swobodnie przesuwa się w dół rurki PE i zwróć uwagę na objętość strzykawki, gdy wchodzi do PAT. Kontynuuj napełnianie, aż wszystkie płatki zostaną całkowicie wypełnione do poziomu kapilar i zatrzymaj pompę strzykawkową. Ponownie sprawdzić objętość strzykawki. 
	UWAGA: Po kilku seriach można użyć szacowanej objętości do zmierzenia przybliżonego punktu końcowego (~35 μL dla dorosłej myszy i ~5 μL dla szczeniaka P1). Po zatrzymaniu pompy ciśnienie resztkowe w układzie będzie nadal wpychać związek polimerowy do tętnic płucnych. Wszystkie płaty płuc powinny wypełniać się w podobnym tempie.</li>
	<li>Przykryj płuca chusteczką do czyszczenia światłowodów, obficie nałóż PBS i pozostaw tuszę w spokoju przez 30-40 minut w temperaturze pokojowej. W tym okresie związek polimerowy utwardza się i twardnieje.</li>
	<li>Wyjmij cewnik, odetnij ramiona/dolną połowę myszy i umieść głowę/klatkę piersiową w stożku o pojemności 50 ml wypełnionym 10% buforowaną formaliną na noc.</li>
	<li>Po unieruchomieniu chwyć tchawicę i delikatnie oddziel część płuco-serce od pozostałej klatki piersiowej i klatki piersiowej. Umieścić blok serca/płuc w fiolce scyntylacyjnej wypełnionej formaliną. Wyrzuć resztę.</li>
</ol>
6. Alternatywne łóżka naczyniowe do odlewania (Tabela 1)
UWAGA: Każde docelowe łóżko naczyniowe może wymagać innego umieszczenia cewnika, szybkości infuzji i optymalnego czasu napełniania. W związku z tym do odlewania wielu narządów potrzebnych będzie wiele zwierząt.
<ol>
	<li>W przypadku ogólnoustrojowych łożysk naczyniowych górnych lub dolnych do przepony wykonaj kroki 1.1-2.5 jak powyżej. Patrz dodatkowe uwagi dotyczące systemu portalowego i membrany (Tabela 1).</li>
	<li>Chwyć wyrostek mieczykowaty hemostatem i przetnij klatkę piersiową obustronnie (mniej więcej w linii środkowej pachy) tuż przed wewnętrznymi tętnicami piersiowymi.</li>
	<li>Złożyć nadal połączoną klatkę piersiową tak, aby spoczywała na szyi/głowie zwierzęcia, całkowicie odsłaniając jamę klatki piersiowej.</li>
	<li>Wykonaj krok 3.1 powyżej, a następnie usuń płuca. Gdy aorta piersiowa (TA) jest widoczna, zaczep pod nią końcówki zakrzywionych kleszczy, ~10 mm powyżej przepony. Chwyć 3-centymetrowy jedwab 7-0, przeciągnij z powrotem przez otwór pod TA i utwórz luźny szew jednorzutowy. Powtórz tę procedurę ~8 mm nad membraną.</li>
	<li>W przypadku struktur wyższych niż przepona użyj nożyczek sprężynowych, aby utworzyć mały otwór (~30% całkowitego obwodu) w brzusznej części TA, ~2 mm poniżej luźnych szwów umieszczonych w kroku 6.4.
	<ol>
		<li>W przypadku struktur niższych od przepony należy zamiast tego utworzyć mały otwór ~2 mm lepszy od luźnych szwów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W zależności od wielkości zwierzęcia wprowadzić jednostkę 1 lub 2 do naczynia, wyjść poza luźne szwy i delikatnie podwiązać naczynie.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokiem 3.7, ustawiając pompę strzykawkową na szybkość 1,0 ml/min i perfując co najmniej 5 ml. Perfuzat wyjdzie przez IVC.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami 5.1 - 5.4, dostosowując szybkość infuzji do 0,05 ml/min, wizualnie monitorując tkankę docelową w czasie rzeczywistym. 
	UWAGA: Objętość infuzji zależy od wieku narządów i zwierząt. Objętość może być dodatkowo ograniczona przez podwiązanie gałęzi tętniczych prowadzących do niedocelowych łożysk naczyniowych (tj. mózgu, wątroby, nerek, jelit).</li>
	<li>Postępuj zgodnie z 5.6, a następnie usuń tkankę docelową i umieść w formalinie.</li>
</ol>
7. Próbka do mikro-tomografii komputerowej
<ol>
	<li>Używając folii parafinowej, utwórz płaską powierzchnię na stole skanującym i wyśrodkuj mokrą próbkę na tej powierzchni (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). 
	UWAGA: Jeśli zostanie wykryty artefakt ruchu, próbka może wymagać dalszej stabilizacji.</li>
	<li>Lekko namiot/przykryj próbkę dodatkową folią parafinową, aby zapobiec odwodnieniu. Należy zwrócić szczególną ostrożność, aby nie oprzeć filmu parafinowego na próbce, powodując deformację tkanki (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Zeskanuj próbkę przy użyciu ustawień opisanych w Tabeli 2 i ustandaryzuj te parametry w ramach danego eksperymentu. 
	UWAGA: Jest to zależne od eksperymentu/punktu końcowego. Ustandaryzuj wybrane parametry, aby ułatwić porównywanie próbek.</li>
	<li>Przenieś zrekonstruowane skany do obróbki końcowej i analizy.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Prawidłowo wykonana metoda daje uderzające obrazy sieci tętnic płucnych, co pozwala na porównanie i eksperymentowanie na modelach gryzoni. Kilka kluczowych kroków po drodze zapewnia sukces. Po pierwsze, badacze muszą heparynizować zwierzę w fazie przygotowawczej, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów krwi w naczyniach płucnych i komorach serca. Pozwala to na całkowity tranzyt tętniczy związku polimerowego. Po drugie, podczas nakłuwania przepony i usuwania klatki piersiowej należy uważać, aby chronić płuca przed niezamierzo...

Głównym celem tej techniki jest wizualizacja architektury tętnic płucnych za pomocą związku na bazie polimeru u myszy. Chociaż przeprowadzono szeroko zakrojone prace nad ogólnoustrojowymi łożyskami naczyniowymi, takimi jak mózg, serce i nerki1,2,3,4,5, dostępnych jest mniej informacji na temat przygotowania i wypełnienia sieci tętnic płucnych. Celem tego badania jest zatem rozwinięcie poprzednich prac6,7,8 i dostarczenie szczegółowego pisemnego i wizualnego odniesienia, które badacze mogą łatwo śledzić, aby uzyskać obrazy drzewa tętnicy płucnej w wysokiej rozdzielczości.
Chociaż istnieje wiele metod oznaczania i obrazowania naczyń płuc, takich jak rezonans magnetyczny, echokardiografia lub angiografia CT9,10, wiele z tych metod nie jest w stanie odpowiednio wypełnić i/lub uchwycić małych naczyń, co ogranicza zakres tego, co można badać. Metody takie jak szeregowe przekroje i rekonstrukcja zapewniają wysoką rozdzielczość, ale są czasochłonne/pracochłonne11,12,13. Integralność otaczających tkanek miękkich jest zagrożona w tradycyjnym odlewaniu korozyjnym10,13,14,15,16. Nawet wiek i wielkość zwierzęcia stają się czynnikami przy próbie wprowadzenia cewnika lub brakuje rozdzielczości. Z drugiej strony technika iniekcji polimeru wypełnia tętnice aż do poziomu naczyń włosowatych, a w połączeniu z μCT pozwala na uzyskanie niezrównanej rozdzielczości5. Próbki z płuc myszy już w 14 dniu po urodzeniu zostały pomyślnie odlane8 i przetworzone w ciągu kilku godzin. Można je skanować ponownie w nieskończoność, a nawet wysyłać do przygotowania histologicznego/mikroskopii elektronowej (EM) bez narażania istniejących tkanek miękkich17. Głównymi ograniczeniami tej metody są początkowy koszt sprzętu/oprogramowania do tomografii komputerowej, wyzwania związane z dokładnym monitorowaniem ciśnienia wewnątrznaczyniowego oraz brak możliwości uzyskania danych w ujęciu wzdłużnym u tego samego zwierzęcia.
Ten artykuł opiera się na istniejących pracach, aby jeszcze bardziej zoptymalizować technikę iniekcji do tętnicy płucnej i przesunąć granice związane z wiekiem/rozmiarem do 1 dnia po urodzeniu (P1), aby uzyskać uderzające wyniki. Jest to najbardziej przydatne dla zespołów, które chcą badać sieci naczyń tętniczych. W związku z tym zapewniamy nowe wytyczne dotyczące umieszczania/stabilizacji cewnika, zwiększoną kontrolę nad szybkością/objętością napełniania i podkreślamy godne uwagi pułapki dla zwiększenia sukcesu odlewania. Uzyskane odlewy można następnie wykorzystać do przyszłej charakterystyki i analizy morfologicznej. Być może ważniejsze jest to, że jest to pierwsza wizualna demonstracja, o ile nam wiadomo, która przeprowadza użytkownika przez tę skomplikowaną procedurę.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1cc</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>20ml Szklane fiolki scyntylacyjne</td><td>Fisher</td><td>03-340-25P</td><td></td></tr><tr><td>30G Igła</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>50mL stożkowe probówki</td><td>Cornin</td><td>352098</td><td>Do przechowywania i skanowania</td></tr> próbki <tr><td>Strzykawka 60cc</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>7-0 jedwab szew</td><td>Teleflex</td><td>103-S</td><td></td></tr><tr><td>Analyze 12.0 Oprogramowanie</td><td>AnalyzeDirect Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>podstawowego oprogramowania</td></tr><tr><td>Amira 6.7 Oprogramowanie</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nie dotyczy</td><td>alternatywnego oprogramowania</td></tr><tr><td>CeramaCut Nożyczki 9 cm</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze z powłoką ceramiczną</td><td>Narzędzia do nauki o nakładzie</td><td>11272-50</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik CO2</td><td>Robert's Oxygen Co.</td><td></td><td></td>brak</tr><tr><td>danych Podwójna pompa strzykawkowa</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-74900-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Mini-kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11200-14</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma - Nauki biologiczne</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Covidien</td><td>441215</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Narzędzia do nauk ścisłych</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna (1000 jednostek USP / ml)</td> <td>Hospira</td><td>NDC 0409-2720-01</td><td></td></tr><tr><td>Horos Software</td><td>Horos Project</td><td>N/A</td><td>Alternatywna</td></tr><tr><td>komora indukcyjna</td> Sofware <td>n/a</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td></td><td>Fisher 06-666</td><td>chusteczka do czyszczenia światłowodów</td></tr><tr><td>Taśma do etykietowania</td><td>Fisher</td><td>15966</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa magnetyczna</td><td>Kanetec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>System Micro-CT</td><td>PerkinElmer</td><td>Quantum GX</td><td></td></tr><tr><td>Microfil (Związek polimerowy)</td><td>Flowech Inc.</td><td>Zestaw B - MV-122</td><td>8 uncji związku MV; 8 uncji rozcieńczalnika; MV-Curing Agent</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Stoelting</td><td>56131</td><td></td></tr><tr><td>Monoject 1/2 ml Strzykawka insulinowa</td><td>Covidien</td><td>1188528012</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze ośmiokątne Proste zęby</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11042-08</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis company, Inc.</td><td></td><td></td>#PM999</tr><tr><td>Rurka PE-10</td><td>Instech</td><td>BTPE-10</td><td></td></tr><tr><td>Buforowana sól fizjologiczna Phospahte</td><td>BioRad</td>#<td>161-0780</td><td></td></tr><tr><td>Stojak pierścieniowy</td><td>Fisher</td><td>S13747</td><td>Wysokość 24in.</td></tr><tr><td>Nitroprusydek</td><td>sodu sigma</td><td>71778-25G</td><td></td></tr><tr><td>Płyta stalowa</td><td>NIE DOTYCZY</td><td>NIE DOTYCZY</td><td>powierzchni 16 x 16 cali, 1/16 cala grubości</td></tr><tr><td>Proste nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik teflonowy SURFLO 24G Dożylny</td> Santa <td>Cruz Biotechnology</td><td>360103</td><td></td></tr><tr><td>Tablica chirurgiczna</td><td>Fisher</td><td>12-587-20</td><td>To jest przerobiony uchwyt na suwak</td></tr><tr><td>Uniwersalny zacisk 3-bolcowy</td><td>Fisher</td><td>S24280</td><td></td></tr><tr><td>Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Rurka</td><td>Nipro</td><td>PR25G19</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi-508 Luneta sekcyjna</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

odlew naczyniowy płuc myszy dorosłych i wczesnych po urodzeniu do obrazowania mikro-ct

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Naczynia krwionośne tworzą skomplikowane sieci w przestrzeni 3-wymiarowej. W związku z tym trudno jest wizualnie docenić, w jaki sposób sieci naczyniowe oddziałują i zachowują się, obserwując powierzchnię tkanki. Metoda ta umożliwia wizualizację złożonej trójwymiarowej architektury naczyniowej płuc.
Aby to osiągnąć, do tętnicy płucnej wprowadza się cewnik, a naczynia krwionośne są jednocześnie płukane z krwi i chemicznie rozszerzane, aby ograniczyć opór. Płuca są następnie napompowywane przez tchawicę pod standardowym ciśnieniem, a związek polimerowy jest podawany do łożyska naczyniowego ze standardową szybkością przepływu. Po wypełnieniu całej sieci tętniczej i pozostawieniu do wyleczenia, układ naczyniowy płuc można uwidocznić bezpośrednio lub zobrazować za pomocą skanera mikro-CT (μCT).
Gdy zostanie przeprowadzone pomyślnie, można docenić sieć tętnic płucnych u myszy od wczesnego wieku pourodzeniowego do dorosłych. Dodatkowo, chociaż wykazano to w łożysku tętnicy płucnej, metoda ta może być stosowana do dowolnego łożyska naczyniowego ze zoptymalizowanym umieszczeniem cewnika i punktami końcowymi.

Prawidłowo wykonany odlew wykaże jednorodne wypełnienie całej sieci tętnic płucnych. Zaprezentowano to na myszach C57Bl/6J w różnym wieku: w 90. dniu po urodzeniu P90 (Rycina 4A), P30 (Rycina 4B), P7 (Rycina 4C) oraz P1 (Rycina 4D). Dzięki kontrolowaniu szybkości przepływu i monitorowaniu wypełniania w czasie rzeczywistym, uzyskano wiarygodne punkty końcowe w obrębie naj...

Celem tej techniki jest wizualizacja ex vivo sieci tętnic płucnych u myszy wcześnie urodzonych i dorosłych poprzez napompowanie płuc i wstrzyknięcie przez tętnicę płucną nieprzezroczystego związku na bazie polimeru radiologicznego. Omówiono również potencjalne zastosowania tkanek odlewanych.

Odlew naczyniowy płuc myszy dorosłych i wczesnych po urodzeniu do obrazowania mikro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Protokół ten zawiera precyzyjne wskazówki krok po kroku dotyczące odlewania naczyń tętniczych płuc zarówno u dorosłych, jak i wczesnych myszy po urodzeniu. Technika ta umożliwia użytkownikom pełne odlanie całej sieci naczyniowej w celu wizualizacji za pomocą różnych metod, w tym mikro-CT, przy jednoczesnym zachowaniu integralności tkanek miękkich. Technika ta jest szczególnie przydatna do badania morfologii i architektury naczyń płucnych, ale można ją łatwo dostosować do celowania w inne łożyska naczyniowe.Podobnie jak w przypadku wielu operacji i sekcji, nic nie zastąpi wizualizacji procedury, a widzowie mogą odnieść korzyści z oglądania niektórych z trudniejszych manewrów. Po odsłonięciu wyrostka mieczykowatego delikatnie chwyć i unieś klatkę piersiową. Ostrożnie wykonaj nacięcie w odsłoniętej, półprzezroczystej membranie.Płuca widocznie zapadną się i wycofają z przepony. Po odsłonięciu płuca i tchawicy nawlecz 15 centymetrów rurki PE10 na piastę igły o rozmiarze 30. I podłącz tę jednostkę do jednomililitrowej strzykawki, zawierającej od 10 do 4 molowych nitroprusydku sodu, w PBS.Przesunąć tłok, aby zalać rurkę, aż całe powietrze zostanie usunięte. Jako skuteczną alternatywę dla tekstu, przeniknij do wierzchołka serca z jednej strony i przeprowadź końcówki zakrzywionych kleszczy przez mięsień i na zewnątrz po drugiej stronie tkanki. Chwyć jeden koniec 10-centymetrowego jedwabiu 7-0 i przeciągnij około dwóch centymetrów przez tkankę.Po zawiązaniu szwu użyj pozostałych ośmiu centymetrów szwu, aby doogonowo pociągnąć serce. I przyklej koniec szwu do deski chirurgicznej. Zaczep końcówki zakrzywionych kleszczy zarówno pod aortą wstępującą, jak i pniem tętnicy płucnej.I przeciągnij trzycentymetrowy jedwab 7-0 z powrotem przez otwór, aby stworzyć luźny szew z jednym rzutem. Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie o długości od jednego do dwóch milimetrów w kierunku wierzchołka serca, penetrując cienkościenną prawą komorę. I wprowadź zagruntowany rurkę do prawej komory, delikatnie przesuwając cewnik do półprzezroczystego, cienkościennego pnia tętnicy płucnej.Sprawdź wzrokowo, czy cewnik nie przesunął się ani do lewej, ani do prawej gałęzi płucnej i nie przylega do punktu odgałęzienia tętnicy płucnej. Przyklej dystalną część rurki do deski chirurgicznej i delikatnie zaciśnij luźny szew wokół obu dużych naczyń. Odetnij ośmiocentymetrowy kawałek szwu, aby przywrócić serce do naturalnej pozycji spoczynkowej.I przytnij lewą wyrocznię serca, aby perfuzat mógł opuścić naczynia krwionośne. Następnie za pomocą pompy strzykawkowej podać nitroprusydek sodu z szybkością przepływu 0,5 ml/min, aby zarówno wypłukać krew, jak i maksymalnie rozszerzyć naczynia krwionośne, aż perfuzat stanie się czysty. Aby skonstruować urządzenie do pompowania płuc, wytnij elastyczny plastikowy cewnik dożylny o rozmiarze 24 z wanny i podłącz do igły zestawu do infuzji motylkowej.Podłącz to urządzenie do kranu i przymocuj kran do otwartej 50-mililitrowej strzykawki. Po załadowaniu strzykawki formaliną i zalaniu cewnika, przy zamkniętym kurku, umieść strzykawkę w stojaku pierścieniowym, do punktu, w którym łąkotka znajduje się 20 centymetrów nad tchawicą. Umieść dwa luźne szwy, oddalone od siebie o dwa do czterech milimetrów, poniżej chrząstki kości grzbietowej i użyj nożyczek, aby wykonać małe nacięcie w więzadle pierściennym tarczycy, lepszym od szwów.Włóż cewnik do otworu i przesuń końcówkę poza dwa luźne szwy. Zaciśnij szwy wokół tchawicy i otwórz kurek, aby formalina mogła dostać się do płuc grawitacyjnie. Poczekaj pięć minut, aż płuca całkowicie się napompują.Jeśli płuca przylegają do klatki piersiowej podczas pompowania, użyj kleszczy z końcówkami, aby chwycić zewnętrzną część klatki piersiowej i poruszaj żebrami we wszystkich kierunkach, aby pomóc w uwolnieniu płatów bez bezpośredniego kontaktu z płucami. Po pięciu minutach wycofaj cewnik za pierwszy szew i podwiązaj. Następnie wycofaj cewnik za drugi szew i podwiązaj.Płuca powinny być teraz napompowane w stanie zamkniętym pod ciśnieniem. Aby odlewać naczynia krwionośne, załaduj jeden mililitr roztworu 8-1-1 utwardzacza rozcieńczalnika polimerowego do strzykawki o pojemności jednego mililitra. I ostrożnie włóż tłok.Trzymając strzykawkę odwróconą, wcisnąć tłok, aby usunąć powietrze i umożliwić utworzenie menisku na końcu strzykawki. Wyjąć strzykawkę z nitroprusycydem sodu z piasty igły i wlać do niej dodatek PBS, aby utworzyć menisk. Połączyć strzykawkę ze związkiem polimerowym z piastą i rozpocząć infuzję z prędkością 0,02 milimetra na minutę.Monitoruj związek, gdy swobodnie przepływa przez rurkę, zwracając uwagę na objętość strzykawki, gdy wchodzi do pnia tętnicy płucnej. Kontynuuj obfitość, aż wszystkie płaty zostaną całkowicie wypełnione, aż do najmniejszego naczynia. Zatrzymaj pompę i ponownie zwróć uwagę na objętość strzykawki.Przykryj płuca chusteczką do czyszczenia światłowodów i obficie nałóż PBS. Pozostaw próbkę w spokoju przez 30 do 40 minut w temperaturze pokojowej. Gdy związek polimerowy zostanie utwardzony i stwardniały, odetnij kończyny i dolną połowę myszy.I umieść głowę i klatkę piersiową w 50-mililitrowym, stożkowym wypełnionym 10% buforowanym formaliną na noc. Następnego ranka chwyć tchawicę, aby delikatnie oddzielić jednostkę serca i płuc od pozostałej klatki piersiowej i klatki piersiowej. Umieść pobrany blok tkanki w fiolce scyntylacyjnej wypełnionej formaliną.Udany odlew będzie skutkował równomiernym wypełnieniem całej sieci tętnic płucnych. Jeśli dojdzie do uszkodzenia płuc lub dróg oddechowych płuc, małe nieszczelności uniemożliwią płucom utrzymanie ciśnienia. Niejednolite lub niepełne wypełnienie może powstać w wyniku śluzy powietrznej w wyniku wprowadzenia powietrza do układu naczyniowego przez cewnik, blokując dalszy przepływ związku.Niedopełnienie występuje, gdy do układu naczyniowego wprowadzana jest zbyt mała ilość związku. Alternatywnie, przepełnienie lub zbyt szybkie wprowadzenie zbyt dużej ilości związku polimerowego może spowodować pęknięcie tętnicy lub, częściej, przejście żylne. Przesunięcie cewnika zbyt daleko w dół pnia płucnego może spowodować zaklinowanie się końcówki w jednej gałęzi tętnicy płucnej, powodując brak równowagi przepływu i powodując szybsze wypełnianie jednej strony niż drugiej.Staranne wykonanie techniki, jak pokazano, przy użyciu odpowiedniego bezpośredniego monitorowania punktów końcowych dystalnego układu naczyniowego i standardowych szybkości infuzji może skutkować optymalnym wypełnieniem naczyń płucnych. Co więcej, dostosowanie tej techniki do unaczynienia układowego może przynieść równie korzystne wyniki w innych łożyskach naczyniowych. Po odlaniu próbki można przetworzyć do skanowania za pomocą mikrotomografii komputerowej.Do przetwarzania końcowego można użyć komercyjnego pakietu oprogramowania do wygenerowania renderowania objętości 3D drzewa płucno-naczyniowego. Próbując tej techniki po raz pierwszy, należy szczególnie uważać wokół delikatnych płuc i tętnicy płucnej. Co najważniejsze, unikaj wprowadzania powietrza do obwodu naczyniowego.Po udanym odlewie próbkę można zeskanować za pomocą mikrotomografii komputerowej i zbadać pytania dotyczące morfometrii i architektury naczyń.

vascular-casting-adult-early-postnatal-mouse-lungs-for-micro-ct

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt z kontrastem za pomocą mikrotomografii komputerowej (microCT) jest szybką, kosztowo efektywną i wysokoprzepustową techniką do seryjnych badań in situ rozwoju guzów, analizy sieci naczyń krwionośnych je odżywiających oraz monitorowania odpowiedzi guzów na przedkliniczne interwencje terapeutyczne.

Obrazowanie naczyń z kontrastem przy użyciu mikrotomografii komputerowej (MicroCT)

Nieniszcząca wizualizacja objętościowa jest możliwa do uzyskania jedynie za pomocą technik tomograficznych, z których najefektywniejszą jest mikrotomografia komputerowa (CT) promieniami rentgenowskimi.

Wysokorozdzielcze obrazowanie 3D Ex-vivo Próbki biologiczne w mikro-tomografii komputerowej (mikro-CT)

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą i praktyczną technikę odlewu naczyniowego mózgu, która jest łatwa w wykonaniu i może być wykorzystana do obrazowania drzewa naczyniowego mózgu dorosłej myszy.

Odlewanie naczyń mózgowych dorosłej myszy do obrazowania 3D i analizy morfologicznej

Przedstawiamy protokół do oceny szybkości usuwania płynu z pęcherzyków płucnych lub obrzęku płuc u noworodków myszy za pomocą technologii obrazowania rentgenowskiego.

Obrazowanie rentgenowskie w czasie rzeczywistym objętości płynu płucnego w płucach noworodków myszy

Opisujemy metodę wykrywania rozwoju guzka guza w płucach mysiego modelu gruczolakoraka za pomocą mikrotomografii komputerowej i jej użycie do monitorowania zmian wielkości guzka w czasie i w odpowiedzi na leczenie. Dokładność oceny potwierdzono kwantyfikacją histologiczną punktu końcowego.

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do oceny rozwoju guza i obserwacji odpowiedzi na leczenie w mysim modelu raka płuc

Opisujemy nieinwazyjne podejście do obrazowania multimodalnego oparte na Micro-CT i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny modelu zwłóknienia płuc myszy wywołanego podwójnym wkropleniem dotchawiczym bleomycyny.

Multimodalne podejście do obrazowania oparte na mikrotomografii komputerowej i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną u myszy

Tutaj prezentujemy protokół amputacji terminalnego paliczka dorosłej myszy w celu zbadania powstawania blastema u ssaków i kostnienia wewnątrzbłoniastego, analizowany za pomocą immunohistochemii fluorescencyjnej i sekwencyjnej tomografii mikrokomputerowej in vivo.

Amputacja i regeneracja palców dorosłych myszy : prosty model do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego u ssaków

Tutaj prezentujemy protokół chirurgicznego wszczepienia na stałe stałego okna optycznego dla mysiej klatki piersiowej, który umożliwia wysokorozdzielcze, przyżyciowe obrazowanie płuc. Trwałość okienka sprawia, że dobrze nadaje się ono do badania dynamicznych procesów komórkowych w płucach, zwłaszcza tych, które powoli ewoluują, takich jak progresja przerzutowa rozsianych komórek nowotworowych.

Stałe okno do badania przerzutów raka do płuc

Mikrotomografia komputerowa z podwójnym odlewem z żywicy, czyli DUCT, umożliwia wizualizację, digitalizację i segmentację dwóch systemów rurowych jednocześnie, co ułatwia analizę 3D architektury organów. DUCT łączy wstrzyknięcie ex vivo dwóch żywic nieprzepuszczających promieni rentgenowskich, a następnie skanowanie mikrotomografii komputerowej i segmentację danych tomograficznych.

DUCT: Podwójny odlew z żywicy, a następnie tomografia mikrokomputerowa do analizy wątroby 3D

W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) do ilościowego oznaczania wentylowanych regionów w jednostronnym modelu zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną poprzez wkroplenie dotchawicze po stronie zmiany.

Jednostronna analiza objętości płuc za pomocą mikrotomografii komputerowej w celu lepszej oceny zwłóknienia płuc w modelach przedklinicznych

Poznaj technikę odlewu naczyniowego płuc myszy dorosłych i wczesnych po urodzeniu do obrazowania mikro-CT. Ta metoda umożliwia wizualizację sieci naczyniowej przy zachowaniu integralności tkanek miękkich.

Odlew naczyniowy płuc myszy dorosłych i wczesnych po urodzeniu do obrazowania mikro-CT

Przeglądaj więcej filmów