Name: Szybka i ekonomiczna ekstrakcja RNA tkanki trzustki szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj szybką i ekonomiczną metodę ekstrakcji RNA z tkanki trzustki szczura. Ta technika zapewnia wysoką czystość i integralność izolowanego RNA przy minimalnej ilości materiału.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsze badanie zostało wsparte finansowo przez Uniwersytet Medyczny Shiraz (Grant nr 93-01-01-7178\03-07-2014). Dziękujemy Panu Zomorodianowi i Panu Rostami z Wydziału E-Learningu w Naukach Medycznych, Wirtualnej Szkole i Centrum Doskonałości w e-Learningu, Uniwersytetu Nauk Medycznych w Shiraz za montaż filmu.

Etyczna aprobata dla tego badania została uzyskana od Uniwersytetu Nauk Medycznych w Shiraz (numer zatwierdzenia: 93-01-01-7178\03-07-2014).
UWAGA: Użyj samców szczurów Sprague-Dawley o wadze 250 g. Umieść fiolkę zawierającą skrawek tkanki trzustki zanurzony w odczynniku stabilizującym RNA w zbiorniku z ciekłym azotem w temperaturze -80 °C i użyj roztworu odczynnika do ekstrakcji RNA, aby zachować integralność RNA.
1. Usunięcie tkanki trzustki szczura
<ol>
	<li>Przygotuj salę operacyjną i umieść wszystkie potrzebne materiały pod maską.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne (kleszcze opatrunkowe, kleszcze Browna-Adsona, nożyczki Iris i nożyczki Littlera) w piecu przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 240 °C, aby dezaktywować RNazy15. Powierzchnię miejsca zabiegowego należy wysterylizować 70% alkoholem pod maską.</li>
	<li>Ketaminę/ksylazynę wstrzyknąć dootrzewnowo za pomocą strzykawki insulinowej [80/8 mg/kg]. Sprawdź głębokość znieczulenia, szczypiąc palce u nóg szczura pod kątem braku odpowiedzi.</li>
	<li>Dodać 1 ml odczynnika stabilizującego RNA do odpowiedniej mikroprobówki (2 ml), aby zahamować aktywację endonukleaz w wycinanych tkankach.</li>
	<li>Natychmiast umieść szczura na desce chirurgicznej (głowa z dala od chirurga) w celu nacięcia w linii środkowej.</li>
	<li>Wysterylizuj całą powierzchnię brzucha 70% alkoholem i usuń sierść szczura za pomocą maszynki do strzyżenia włosów z ostrzami #40.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w kształcie litery V, aby otworzyć brzuch od okolicy łonowej do przednich nóg za pomocą kleszczy opatrunkowych, kleszczy Browna-Adsona, nożyczek Iris i nożyczek Littler.</li>
	<li>Odwróć narządy jamy brzusznej w lewą stronę, aby odsłonić trzustkę. Ostrożnie znajdź tkankę trzustki, która rozprzestrzenia się w jamie brzusznej. Zlokalizuj obszar pod śledzioną, aby znaleźć trzustkę, nie myląc jej z tkanką tłuszczową.</li>
	<li>Natychmiast usunąć 20-30 mg trzustki z jamy brzusznej w czasie krótszym niż 2 minuty. Usuniętą tkankę należy szybko umieścić w mikroprobówce o pojemności 2 ml i przeciąć sterylnym nożem, aby przeniknąć do oddzielonych tkanek odczynnikiem stabilizującym RNA.</li>
	<li>Umieść mikroprobówkę w zbiorniku z azotem, aby natychmiast zamrozić. Przechowuj mikroprobówkę w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez 24 godziny16.</li>
	<li>Po 24 godzinach przenieś drobne kawałki tkanek trzustki do pojemnika na lód.</li>
	<li>Wstrzyknąć chlorek potasu (KCl) dosercowo w celu eutanazji szczurów po operacji.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Wysterylizuj powierzchnię pod maską 70% alkoholem.</li>
	<li>Umieścić 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA, który zawiera tiocyjanian guanidyny w celu zahamowania RNazy, do sterylnej mikroprobówki.</li>
	<li>Przenieś oddzieloną tkankę trzustki do mikroprobówki. Przenieś mikroprobówkę do ciekłego azotu w celu natychmiastowego zamrożenia.</li>
	<li>Homogenizować tkankę za pomocą sonografu z mikrokońcówką w temperaturze 4 °C ustawionej na poziom 20 przez 60 s włączone i 5 s wyłączone.</li>
	<li>Każdą homogenizowaną próbkę inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C, używając kruszonego lodu, aby umożliwić całkowitą dysocjację kompleksów nukleoproteinowych.</li>
	<li>Wzbogać próbki o 0,2 ml chloroformu na każdy 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA. Mocno zakręć rurkę i potrząsaj nią mocno przez 15 sekund.</li>
	<li>Inkubować probówkę przez 15 minut na kruszonym lodzie (4 °C) w celu rozdzielenia odczynnika na trzy fazy.</li>
	<li>Uruchomić wirówkę przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze od +2 do +8 °C. Przenieść bezbarwną fazę wodną do nowej mikroprobówki.</li>
	<li>Do fazy wodnej dodać 0,5 ml 100% izopropanolu. Zamknij probówkę, a następnie odwróć ją co najmniej 3 razy, aby dokładnie wymieszać RNA.</li>
	<li>Inkubować próbkę przez 5-10 minut w chłodni (4 °C), aby umożliwić wytrącenie RNA.</li>
	<li>Uruchomić wirówkę przy 12 000 x g na 15 minut w temperaturze od +2 do +8 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Wzbogać każdą z probówek wirówkowych w 1 ml 75% etanolu.</li>
	<li>Umyj osad RNA, odwracając probówkę co najmniej 3 razy.</li>
	<li>Uruchomić wirówkę przy 7 500 x g w temperaturze od +2 do +8 °C przez 5 minut. Wyrzucić supernatant w celu usunięcia nadmiaru etanolu z osadu RNA poprzez suszenie na powietrzu.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad RNA w wodzie wolnej od RNaz poddanej działaniu dietylowęglanu (DEPC).</li>
	<li>Przepuść roztwór przez końcówkę pipety kilka razy, aby rozpuścić osad RNA. Następnie inkubować roztwór przez 10-15 minut w temperaturze +65 °C.</li>
</ol>
3. Ocena integralności RNA za pomocą elektroforezy denaturacyjnej
<ol>
	<li>Przygotuj bufor do biegania w żelu: 50 mM NaAc (poddane działaniu DEPC) i 0,5 M EDTA (pH 8,0) w H2O poddanym działaniu DEPC.</li>
	<li>Przygotuj 5x bufor do biegania w żelu formaldehydowym (bufor do biegania MOPS): 0,1 M MOPS (pH 7,0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8,0).
	<ol>
		<li>Rozpuścić 20,6 g MOPS w 800 ml octanu sodu 50 mM poddanego działaniu DEPC. Doprowadzić pH do 7,0 za pomocą 2 N NaOH. Dodać 10 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) poddanego działaniu DEPC. Dostosować objętość roztworu do 1 l wodą uzdatnioną DEPC.</li>
		<li>Przefiltruj roztwór przez filtr 0,2 μm i utrzymuj go w temperaturze pokojowej z dala od światła w celu sterylizacji. Bufor z czasem żółknie, jeśli jest wystawiony na działanie światła lub jest sterylizowany w autoklawie. Bufor w kolorze słomkowym działa dobrze, ale ciemniejsze już nie17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 1,5% żel agarozowy18. Na 50 ml dodaj 0,75 g agarozy i 31 mlH2O. Podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej w kuchence mikrofalowej przez 1 minutę. Dodaj 9 ml formaldehydu i 10 ml 5x buforu do biegania MOPS.</li>
	<li>Przygotuj próbki do żelu. Wymieszaj następujące składniki w sterylnej probówce do mikrofuge: 
	X μL RNA (do 30 μg) 
	2 μl 5x bufor ładujący żel 
	10 μL formamidu 
	4 μl MOPS z uruchomionym buforem 
	1 μl 0,1 mg/ml EtBr 
	3 μL formaldehydu 5-x μL DEPC-H2O</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze 65 °C przez 15 minut i schłodzić na lodzie. Wirować przez 5 sekund, aż cały płyn się osadzi.</li>
	<li>Uruchom żel pod napięciem 5 V/cm przez 5 minut.</li>
	<li>Natychmiast załaduj próbki do pasów żelu, a następnie zanurz żel w 1x buforze do działania w żelu formaldehydowym. Pracować przy 3-4 V/cm19.</li>
</ol>

<ol><li>McCarthy, B., Hoyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+of+DNA+and+diversity+of+messenger+RNA+molecules+in+normal+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).</li>
<li>Tan, S. C., Yiap, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%2C+RNA%2C+and+protein+extraction%3A+the+past+and+the+present%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present.</a> BioMed Research International. 2009, (2009).</li>
<li>Peirson, S. N., Butler, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+extraction+from+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circadian+Rhythms%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">RNA extraction from mammalian tissues.</a> Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).</li>
<li>Skidmore, A. F., Beebee, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+use+of+the+potent+ribonuclease+inhibitor+aurintricarboxylic+acid+for+the+isolation+of+RNA+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues.</a> Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).</li>
<li>Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+total+RNA+from+tissues+or+cell+lines%3A+visualization+in+gel%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Isolation+and+Characterization+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel.</a> RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).</li>
<li>Raeymaekers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR%3A+theoretical+considerations+with+practical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications.</a> Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).</li>
<li>Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+homogenization+as+a+key+step+in+extracting+RNA+from+human+and+rat+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue.</a> Biotechniques. 22 (3), 408(1997).</li>
<li>Kiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+RNA+extraction+from+rat+pancreas+for+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis.</a> Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).</li>
<li>Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+recovery+of+intact+RNA+from+rat+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas.</a> Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).</li>
<li>Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+a+novel+room+temperature+RNA+storage+medium+for+compatibility+in+microarray+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis.</a> Biotechniques. 47 (2), 667(2009).</li>
<li>Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+ductal+perfusion+to+facilitate+isolation+of+high-quality+RNA+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas.</a> Biotechniques. 40 (5), 617(2006).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+method+using+TRIzol+reagent+and+liquid+nitrogen+produces+high-quality+RNA+from+rat+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).</li>
<li>Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+versatile+method+for+obtaining+high+quality+rna+from+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas.</a> Biotechniques. 52 (5), 332(2012).</li>
<li>Jun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+optimization+for+extracting+high-quality+RNA+from+the+human+pancreas+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Translation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue.</a> Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+win+the+battle+with+RNase%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857(2019).</li>
<li>Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Dai, L. -j <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649(2009).</li>
<li>Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol%3A+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis.</a> Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).</li>
<li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+gel%3A+a+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+spring+harbor+laboratory+press%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning: a laboratory manual.</a> Cold spring harbor laboratory press. , (1989).</li>
<li>Potenza, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridase+activity+of+human+ribonuclease-1+revealed+by+a+real-time+fluorometric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay.</a> Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).</li>
<li>Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+extraction+of+DNA+and+RNA+and+analysis+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction.</a> Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).</li>
<li>Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, Á <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+the+pancreatic+%CE%B1-cell+and+glucagon+secretion%3A+role+in+glucose+homeostasis+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes.</a> Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).</li>
<li>Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Homogenization+with+the+MagNA+Lyser+Instrument+for+Total+RNA+Extraction+Using+the+TriPure+Reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+%28mg%29%22%5BJournal%5D)">Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent.</a> Liver (mg). 100 (100), 100(2004).</li>
<li>Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+RNA+extraction+from+rat+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Iranian+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue.</a> Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282(2014).</li>
</ol>

Żaden nie zadeklarował.

W biologii molekularnej niezbędne jest uzyskanie wysokiej jakości RNA. Obecność enzymów rybonukleazy w komórkach i tkankach szybko degraduje RNA i sprawia, że ekstrakcja staje się złożona. RNazy są stabilnymi enzymami działającymi bez żadnych kofaktorów. Niewielkie ilości RNazy są wystarczające do zniszczenia RNA. Po usunięciu tkanki trzustki szczura z jamy brzusznej należy zdezynfekować narzędzia chirurgiczne silnymi detergentami, dokładnie je wypłukać i wstawić do pieca na co najmniej 4 godziny w temperaturze 240 °C w ...

Dane strukturalne genów mogą być transkrybowane do funkcjonalnego produktu poprzez ekspresję genów. Analiza RNA służy do odkrywania różnic w ekspresji genów w różnych warunkach. Istnieje wiele metod ekstrakcji kwasów nukleinowych w następujący sposób: tiocyjanian guanidyny, ekstrakcja za pomocą chloroformu fenolowego, chromatografia na bazie celulozy, ekstrakcja za pomocą matryc krzemionkowych i wymiana anionów1,2.
Prawidłowe wykrywanie ekspresji genów zależy od integralności RNA wyizolowanego z tkanek; dlatego ważne jest, aby ocenić integralność RNA wyizolowanego z tkanek przed przeprowadzeniem dalszych testów, ponieważ uzupełniające testy molekularne na RNA niskiej jakości mogą zagrozić wynikom aplikacji diagnostycznej. W związku z tym RNA o wysokiej integralności jest potrzebne do molekularnych testów biologicznych o różnych zastosowaniach diagnostycznych: ilościowy RT-PCR, mikromacierze, test ochrony rybonukleazami, analiza northern blot, mapowanie RNA i budowa biblioteki cDNA3,4.
RNA staje się raczej niestabilne po długim przechowywaniu. Długie fragmenty mRNA powyżej 10 kb są szczególnie podatne na degradację5,6. Dlatego naukowcy muszą wziąć pod uwagę różne czynniki, które wpływają na integralność oczyszczonego RNA. Czystość RNA musi być chroniona przed zanieczyszczeniem RNazami, białkami, genomowym DNA i inhibitorami enzymatycznymi. Ponadto najlepszy i akceptowalny stosunek absorpcji RNA do UV (260/280) musi mieścić się w zakresie 1,8-2,0 przy minimalnym rozdrobnieniu w stosunku do elektroforezy. Niedawno opracowane techniki laboratoryjne umożliwiły naukowcom bardziej praktyczną ocenę integralności próbki do analizy molekularnej7,8.
O wiele trudniej jest wydobyć nieuszkodzone RNA z tkanki trzustki niż z innych typów tkanek ze względu na dużą ilość rybonukleaz (RNaz). Jednak istniejące metody ekstrakcji, a mianowicie szybkie wyrzucanie tkanki trzustki z jamy brzusznej i homogenizacja w niskich temperaturach w celu zahamowania RNaz, okazały się nieskuteczne7,8,9,10,11,12,13,Rozdział 14.
Celem obecnego eksperymentalnego badania porównawczego jest modyfikowanie i porównywanie istniejących metod w celu określenia najbardziej efektywnych metod. W tym celu zmodyfikowano i porównano różne protokoły ekstrakcji RNA. Miało ono na celu określenie najtańszej metody wymagającej minimalnej ilości tkanki trzustkowej.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Merck</td><td>116801</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Atoclave</td><td>Teb Zaim</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sigma</td><td></td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>107024</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Woda uzdatniona dwupirowęglanem (DEPC)</td><td>Sigma</td><td></td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>sigma</td><td>60-00-4</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Zbiornik do elektroforezy</td><td>Payapajoohesh</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>Eppendorf microTube</td><td>Extragene</td><td></td><td>Tajwan</td></tr><tr><td>EtBr</td><td>sigma</td><td>E 8751</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>81870</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Falcon Tube</td><td>Extragene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tajwan Formaldehyd</td><td>Merck</td><td>344198</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Merck</td><td>344206</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Homogenizator-sunikator</td><td>Microson XL 2000</td><td></td><td>Stany Zjednoczone</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>sigma</td><td>19516</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>sigma</td><td>1867-66-9</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>Jal Tajhiz</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>Mieszadło mgnetyczne</td><td>Labrotechnik</td><td></td><td>USA</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet</td><td>Extragene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tajwan MOPS</td><td>sigma</td><td>85022106</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Na AC</td><td>Merck</td><td>567422</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>109137</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Teb Zaim</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>PH</td> <td>miernikKnick</td><td></td><td>Germany</td></tr><tr><td>RNA Later/odczynnik stabilizujący RNA</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>USA</td></tr><tr><td>Instrument chirurgiczny</td><td>Agn Thos</td><td></td><td>Niemieckie</td></tr><tr><td>strzykawki</td><td>AvaPezeshk</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>TriPure odczynnik / odczynnik do ekstrakcji RNA</td><td>Roche</td><td>11667157001</td><td>USA</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labinco</td><td></td><td>Holandia</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Memmert</td><td></td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>zylazyna</td><td>sigma</td><td>7361-61-7</td><td>Niemcy</td></tr></tbody></table>

szybka i ekonomiczna ekstrakcja rna tkanki trzustki szczura

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Niezależnie od metody ekstrakcji, zoptymalizowana ekstrakcja RNA tkanek i linii komórkowych odbywa się w czterech etapach: 1) homogenizacja, 2) skuteczna denaturacja białek z RNA, 3) inaktywacja rybonukleazy i 4) usuwanie zanieczyszczeń z DNA, białek i węglowodanów. Jednak utrzymanie integralności RNA jest bardzo pracochłonne, gdy w tkance występuje wysoki poziom RNazy. Spontaniczna autoliza bardzo utrudnia ekstrakcję RNA z tkanki trzustki bez jej uszkodzenia. Dlatego potrzebna jest praktyczna metoda ekstrakcji RNA, aby zachować integralność tkanek trzustki podczas procesu ekstrakcji. Przeprowadzono badanie eksperymentalne i porównawcze istniejących protokołów, uzyskując 20-30 mg tkanek trzustki szczura w czasie krótszym niż 2 minuty i ekstrahując RNA. Wyniki oceniano za pomocą elektroforezy. Eksperymenty przeprowadzono trzykrotnie w celu uogólnienia wyników. Zanurzenie tkanki trzustki w odczynniku stabilizującym RNA w temperaturze -80 °C przez 24 godziny dało RNA o wysokiej integralności, gdy jako odczynnik użyto odczynnika do ekstrakcji RNA. Uzyskane wyniki były porównywalne z wynikami uzyskanymi z komercyjnych zestawów z wiązaniami spin column.

Ocena integralności RNA w odczynniku do ekstrakcji RNA zgodnie z rutynowym i zmodyfikowanym protokołem chirurgicznym bez zastosowania odczynnika stabilizującego RNA 
Po ekstrakcji RNA przy użyciu odczynnika do ekstrakcji RNA zgodnie z rutynowym protokołem chirurgicznym zaobserwowano nieakceptowalne prążki. Ścieżka 1 przedstawia RNA z wątroby jako kontrolę. Ścieżka 2 pokazuje stan degradacji prążków 28S/18S rRNA w całkowitym RNA uzyskanym zgodnie z rutynowym protokołem chirurgicznym. Gdy ilość tkanki t...

Czystość i integralność izolowanego RNA jest kluczowym krokiem w testach zależnych od RNA. Tutaj przedstawiamy praktyczną, szybką i niedrogą metodę ekstrakcji RNA z niewielkiej ilości nieuszkodzonej tkanki trzustki.

Szybka i ekonomiczna ekstrakcja RNA tkanki trzustki szczura

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Witajcie wszyscy. Opracowaliśmy prostą, szybką i opisową metodę wydajnej ekstrakcji RNA z tkanki trzustki. Główną zaletą tej metody jest zoptymalizowana procedura ekstrakcji RNA z minimalnej ilości tkanki, co jest istotne ze względu na autolizę. Ponownie witajcie. Procedurę zaprezentuje Sanaz Dastghaib, moja studentka doktoratu w laboratorium Katedry Biochemii Uniwersytetu Nauk Medycznych w Shiraz. Najpierw przygotuj miejsce operacji, umieszczając wszystkie niezbędne materiały pod wyciągiem. Aby dezaktywować RNazy, wysterylizuj wszystkie instrumenty chirurgiczne w autoklawie. Wstrzyknij ketaminę i ksylazynę drogą donosową w dawce 80/8 mg/kg. Dodaj 1 cc odczynnika do stabilizacji RNA do odpowiedniej mikroprowetki, aby zahamować aktywację endonukleazy w istniejących tkankach. Natychmiast umieść szczura na stole operacyjnym. Chirurg powinien skierować głowę zwierzęcia w stronę przeciwną do nacięcia po linii środkowej. Następnie zdezynfekuj całą powierzchnię brzucha 70% alkoholem, aby usunąć sierść szczura. Rozetnij skórę w celu wykonania zabiegu. Wykonano nacięcie w celu otwarcia jamy brzusznej od okolicy łonowej do przednich łap. Odsuń organy brzuszne na lewą stronę, aby odsłonić trz

rapid-and-cost-effective-rna-extraction-of-rat-pancreatic-tissue

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Mikrodysekcja laserowa to technika, która pozwala na odzyskanie wybranych komórek z niewielkich ilości miąższu. W tym miejscu opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych do wykorzystania w badaniach transkryptomicznych. Nasz protokół poprawia wewnętrzną autofluorescencję ludzkich komórek beta, ułatwiając w ten sposób ich pobieranie.

Ulepszony protokół mikrodysekcji laserowej ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych

Opisujemy procedurę izolowania RNA o wysokiej integralności z bogatej w rybonukleazy trzustki myszy.

Izolacja RNA z trzustki myszy: tkanka bogata w rybonukleazę

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Metoda ta nadaje się do badania profilu ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura w kilku stanach patologicznych.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Tutaj prezentujemy protokół generowania ekspresji insuliny 3D mysich trzustek z swobodnie pływających e10.5 dysocjowanych komórek progenitorowych trzustki i związanych z nimi mezenchymów.

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Opisujemy metodę izolacji komórek endokrynnych z embrionalnej, noworodkowej i postnatalnej trzustki, a następnie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Metoda ta pozwala na analizę rozwoju linii endokrynnej trzustki, heterogeniczności komórek i dynamiki transkryptomicznej.

Jednokomórkowe analizy transkryptomiczne komórek endokrynnych trzustki myszy

Komórki metaplastyczne trzustki są prekursorami komórek nowotworowych, które powodują powstawanie guzów trzustki. Jednak wyizolowanie nienaruszonych żywotnych komórek trzustki jest trudne. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę dysocjacji tkanek trzustkowych. Komórki można następnie wykorzystać do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) lub do dwu- lub trójwymiarowej kohodowli.

Wypreparowanie tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Poznaj szybką i ekonomiczną metodę ekstrakcji RNA z tkanki trzustki szczura. Ta technika zapewnia wysoką czystość i integralność izolowanego RNA przy minimalnej ilości materiału.

Szybka i ekonomiczna ekstrakcja RNA tkanki trzustki szczura

Przeglądaj więcej filmów