Name: Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych na małych substratach DNA i RNA. Ta metoda umożliwia wykrywanie subtelnych zmian fosforylacji końców 5' kwasów nukleinowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Andrew Sikkema i Andrei Kaminski za ich krytyczną lekturę tego rękopisu. Prace te były wspierane przez amerykański National Institute of Health Intramural Research Program; Amerykański Narodowy Instytut Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (NIEHS; ZIA ES103247 do R.E.S) oraz Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR; 146626 do M.C.P).

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotować bufor i odczynniki.
	<ol>
		<li>Przygotuj 1x bufor reakcyjny, łącząc 20 μl 1 M Tris (pH = 8,0), 40 μl 5 M chlorku sodu, 2,5 μl 2 M chlorku magnezu, 100 μl 50% (v / v) glicerolu i wody wolnej od RNaz, aby osiągnąć całkowitą objętość 1 ml.</li>
		<li>Przygotuj barwnik obciążający mocznik, łącząc 4,8 g mocznika, 200 μl 1 M Tris (pH = 8,0), 20 μl 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 ml 1% (w/v) błękitu bromofenolowego i wody wolnej od RNaz, aby osiągnąć całkowitą objętość 10 ml.</li>
		<li>Przygotuj 10x bufor TBE, łącząc 108 g zasady Tris, 55 g kwasu borowego, 40 ml 0,5 M EDTA (pH = 8,0) i wody wolnej od RNaz, aby osiągnąć całkowitą objętość 1 l.</li>
		<li>Wytwarzać 10% (w/v) nadsiarczanu amonu (APS). Odważyć 0,5 g APS i dodać 3 ml wody wolnej od RNaz, aby rozpuścić ciało stałe. Dodaj wodę wolną od RNaz, aby osiągnąć całkowitą objętość 5 ml. Owinąć probówkę w folię i przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Rozpuszczony SOA zanika z czasem. Wymieniaj 10% kolbę APS co 2 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymać enzym kinazy polinukleotydowej.
	<ol>
		<li>Pozyskaj czysty enzym PNK Las1-Grc3 2 przechowywany w buforze reakcyjnym (patrz krok 1.1.1) w stężeniu podstawowym 20 μM. Bufor pamięci masowej będzie się różnić w zależności od konkretnego kodu PNK.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować substrat kwasu nukleinowego. 
	UWAGA: Ten protokół monitoruje fosforylację 5' substratu 27 nt RNA, który zawiera miejsce przetwarzania Las1-Grc3 (miejsce C2) zawarte w pre-rybosomalnym wewnętrznym transkrybowanym dystansie 2 Saccharomyces cerevisiae (SC-ITS2; patrz Tabela 1)2,25,26.
	<ol>
		<li>Chemicznie zsyntetyzować substrat oligonukleotydowy RNA zawierający koniec 5'-hydroksylowy wraz ze znacznikiem 3'-fluorescencyjnym. Fluorofor zostanie wykorzystany do wizualizacji RNA. Upewnij się, że fluorofor jest umieszczony na końcu RNA, który nie jest celem fosforylacji. Jako alternatywę dla źródeł komercyjnych, wewnętrzne i końcowe znakowanie fluorescencyjne substratów RNA można przeprowadzić we własnym zakresie przy użyciu opłacalnych protokołów27.</li>
		<li>Usuń nadmiar fluoroforu z reakcji znakowania RNA za pomocą HPLC-purification28.</li>
		<li>Zawiesić liofilizowany RNA za pomocą wody wolnej od RNaz do 500 nM.</li>
		<li>Podwielokrotności RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania lub -20 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować serię stężeń ATP.
	<ol>
		<li>Wykonać 20 mM zapas roboczy ATP za pomocą bufora reakcyjnego (patrz krok 1.1.1). Użyj tego materiału roboczego do wygenerowania czterech seryjnych rozcieńczeń w zakresie od 20 mM do 0,02 mM.</li>
		<li>Aby dokonać pierwszego rozcieńczenia serii stężeń, zmieszać 1 μl 20 mM materiału roboczego ATP z 9 μl buforu reakcyjnego. Spowoduje to 10-krotne rozcieńczenie ATP o końcowym stężeniu 2 mM.</li>
		<li>Użyć 2 mM zapasu ATP wygenerowanego w kroku 1.4.2, aby wykonać następne rozcieńczenie w szeregu stężeń. Zmieszać 1 μl 2 mM podstawowego ATP z 9 μl buforu reakcyjnego. To sprawi, że nowe stężenie ATP wyniesie 0,2 mM.</li>
		<li>Kontynuować rozcieńczanie 1 μl poprzedniego zapasu ATP za pomocą 9 μl buforu reakcyjnego, aby uzyskać kolejny zapas ATP w szeregu stężeń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Reakcja kinazy RNA in vitro
UWAGA: Ten test może być używany do pomiaru kilku zmiennych, takich jak czas, poziomy nukleotydów czy stężenie enzymów. Celem tego eksperymentu jest ocena ilości ufosforylowanego RNA w obecności stałego kompleksu Las1-Grc3 i różnych poziomów ATP.
<ol>
	<li>Dla każdej reakcji kinazy enzymatycznej RNA połącz 1 μl substratu RNA 500 nM, 8,3 μl 130 nM Las1-Grc3 i 0,2 μl 5 mM EDTA. 
	UWAGA: W przypadku przeprowadzania kilku reakcji należy przygotować główny zapas mieszaniny RNA-enzym i podamy 9,5 μl tej głównej mieszaniny do każdej probówki reakcyjnej.</li>
	<li>Rozpocznij test.
	<ol>
		<li>Ustawić blok grzewczy na 37 °C.</li>
		<li>W odstępach 10 s zmieszać 0,5 μl jednego podmateriału ATP z serii stężeń ATP przygotowanej w kroku 1.4 z jedną mieszaniną RNA-enzym i umieścić reakcję w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Dodać 0,5 μl buforu reakcyjnego zamiast ATP do jednej mieszaniny RNA-enzym w celu uzyskania kontroli ujemnej PNK. Użyj również innej niezbędnej kontroli (tj. substratu RNA w przypadku braku enzymu PNK).</li>
		<li>Inkubować reakcje przez 60 minut w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: RNA znakowane fluorescencyjnie jest wrażliwe na światło; Dlatego przykryj reakcje folią.</li>
		<li>Stosując tę samą kolejność, co w kroku 2.2.2, wygaszać każdą reakcję co 10 sekund, dodając do reakcji 10 μl barwnika ładującego mocznik (patrz krok 1.1.2). 
		UWAGA: Oprócz 4 M mocznika, na tym etapie można dodać proteinazę K w celu degradacji enzymu. Postępuj zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez dostawcę, aby określić wymaganą ilość proteazy i warunki reakcji.</li>
		<li>Wygaszone reakcje kinazy RNA in vitro należy natychmiast wykorzystać do dalszej analizy (patrz punkt 3) lub przechowywać w temperaturze -20 °C do analizy w późniejszym terminie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Elektroforeza żelowa
<ol>
	<li>Przygotować 15% roztwór żelu akrylamidowego/8 M mocznika. 
	UWAGA: Z akrylamidem należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jest to neurotoksyna. Podczas obchodzenia się z nim zawsze noś rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary.
	<ol>
		<li>W szklanej zlewce o pojemności 150 ml wymieszaj 22,5 ml wstępnie zmieszanego 40% roztworu akrylamidu/bis-akrylamidu 29:1, 6 ml 10 x TBE (patrz krok 1.1.3), 28,8 g mocznika i wody wolnej od RNaz do całkowitej objętości 59 ml. Delikatnie wymieszaj roztwór. 
		UWAGA: W zależności od długości substratu RNA, zmiana procentowej zawartości poliakrylamidu może poprawić rozdzielczość między niefosforylowanym i fosforylowanym RNA.</li>
		<li>Aby rozpuścić mocznik, podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej przez 20 s, wymieszaj płyn i natychmiast umieść roztwór z powrotem w kuchence mikrofalowej na kolejne 20 sekund. Delikatnie mieszaj roztwór, aż mocznik całkowicie się rozpuści.</li>
		<li>Powoli schłodzić roztwór, umieszczając szklaną zlewkę w płytkiej łaźni wodnej zawierającej zimną wodę. Upewnij się, że poziom zimnej wody otaczającej szklaną zlewkę jest wyższy niż poziom roztworu wewnątrz szklanej zlewki. Będzie to sprzyjać efektywnemu przenoszeniu ciepła. Czekamy 5 min. 
		UWAGA: Nie kontynuuj tego protokołu, jeśli szklana zlewka jest ciepła; temperatura wody powinna być niższa niż 25 °C. Jeśli po 5 minutach nadal jest ciepły, zastąp wodę w łaźni wodnej świeżą zimną wodą i odczekaj kolejne 5 minut.</li>
		<li>Przefiltruj i odgazuj roztwór za pomocą jednorazowej jednostki filtrującej 0,22 μm w celu usunięcia cząstek stałych i mikroskopijnych pęcherzyków powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlej żel denaturujący.
	<ol>
		<li>Użyj mydła i ciepłej wody do czyszczenia krótkiej i długiej szklanej płytki przeznaczonej do żeli o wymiarach całkowitych 31,0 cm x 38,5 cm. Spryskaj każdą szklaną płytkę 95% etanolem i wytrzyj szkło, aby usunąć wilgoć. 
		UWAGA: Jedna z dwóch płytek może być silikonowana, aby zapobiec uszkodzeniu żelu podczas oddzielania kanapki ze szklaną płytą. Jednak ten krok nie jest konieczny, ponieważ protokół ten ma na celu wizualizację RNA bez oddzielania szklanych płytek.</li>
		<li>Umieść długą szklaną płytkę poziomo na pudełku, tak aby była podniesiona z blatu. 
		UWAGA: Akrylamid jest toksyczny, dlatego stacja nalewania żelu musi być pokryta papierem stołowym, który może wchłonąć rozlaną ciecz i natychmiast po zakończeniu procedury umieścić ją w worku na odpady.</li>
		<li>Umieść czystą przekładkę 0.4 mm wzdłuż długich krawędzi długiej szklanej płyty.</li>
		<li>Połóż krótką szklaną płytkę na długiej płycie i upewnij się, że krawędzie krótkiej płytki, długiej płytki i przekładek są wyrównane. Zaciśnij każdą stronę za pomocą trzech równomiernie rozmieszczonych metalowych zacisków.</li>
		<li>Dodać 24 μl TEMED do 15% roztworu akryloamidu/8 M mocznika przygotowanego w kroku 3.1 i wymieszać roztwór.</li>
		<li>Dodać 600 μl 10% (w/v) APS (patrz krok 1.1.4) do roztworu w kroku 3.2.5 i delikatnie wymieszać roztwór.</li>
		<li>Natychmiast wlej roztwór między szklane płytki. 
		UWAGA: Aby uniknąć pęcherzyków, postukaj w szklankę podczas nalewania roztworu.</li>
		<li>Ostrożnie dodaj czysty, 32-dołkowy grzebień o średnicy 0,4 mm na wierzch kanapki ze szklaną płytą.</li>
		<li>Odczekaj co najmniej 30 minut, aby akrylamid uległ polimeryzacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom żel denaturujący.
	<ol>
		<li>Ustawić blok grzewczy na 75 °C.</li>
		<li>Zdejmij metalowe clamps przytrzymujące kanapkę ze szklaną płytą razem i dokładnie umyj i osusz kanapkę ze szklaną płytą.</li>
		<li>Umieść kanapkę ze szklaną płytką w aparacie żelowym z krótką płytką skierowaną do wewnątrz.</li>
		<li>Przygotuj 0,5 x TBE bufor do biegania, łącząc 100 ml 10 x TBE z 1,9 l wody wolnej od RNaz. Dodać 600 ml buforu do górnej i dolnej komory aparatu żelowego.</li>
		<li>Delikatnie wyjmij grzebień i dokładnie wypłucz studzienki za pomocą strzykawki. 
		UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla usunięcia mocznika ze studzienek.</li>
		<li>Uruchom żel przez 30 minut przy 50 W. Napięcie wynosi około 2 000 V. 
		UWAGA: Ten aparat żelowy działa z dużą mocą, a użytkownicy powinni zachować ostrożność.</li>
		<li>Dokładnie wypłukać studzienki za pomocą strzykawki. 
		UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla równomiernego załadunku próbki do studzienek.</li>
		<li>Pulsacyjnie obracać wygaszone reakcje z kroku 2.2.5. Następnie inkubować probówki w temperaturze 75 °C przez 3 minuty. Powtórz wirowanie impulsowe.</li>
		<li>Natychmiast załadować 10 μl próbki do studzienki i uruchomić żel przez 3 godziny przy 50 W. 
		UWAGA: RNA znakowane fluorescencyjnie jest wrażliwe na światło; Dlatego przykryj aparat żelowy folią.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyobraź sobie żel denaturujący.
	<ol>
		<li>Wyłącz zasilanie i opróżnij górną komorę aparatu żelowego.</li>
		<li>Umyj i osusz zewnętrzną stronę kanapki ze szklaną płytą wodą z mydłem. Przykryj kanapkę ze szklaną płytą folią podczas transportu żelu.</li>
		<li>Zamontuj kanapkę ze szklaną płytką na stoliku skanera laserowego zdolnego do ilościowej i czułej detekcji fluorescencji. 
		UWAGA: Ten żel jest niezwykle cienki, aby zapewnić maksymalną rozdzielczość. Z tego powodu protokół ten ma na celu uniknięcie trudności z usuwaniem żelu z kanapki ze szklaną płytką poprzez bezpośrednią wizualizację znakowanego fluorescencyjnie RNA przez szklane płytki. Zastosowanie dostępnych na rynku płytek szklanych o niskiej fluorescencji zwiększy przechwytywany sygnał poprzez poprawę stosunku sygnału do szumu.</li>
		<li>Ustaw długości fal wzbudzenia i emisji skanera laserowego dla żądanego fluoroforu. 
		UWAGA: Optymalne długości fal wzbudzenia i emisji mogą się różnić dla konkretnych fluoroforów. Dla fluoroforu FAM długości fal wzbudzenia i emisji wynoszą odpowiednio 495 nm i 535 nm.</li>
		<li>Zdefiniuj obszar, który ma być wizualizowany na stoliku skanera laserowego i zobrazuj żel zgodnie z instrukcjami producenta (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza obrazu i kwantyfikacja sygnału
<ol>
	<li>Załaduj cyfrowy obraz żelu uzyskany w kroku 3.4.5 do oprogramowania do przetwarzania obrazu (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Za pomocą lewego przycisku myszy kliknij i przeciągnij prostokąt, aby zdefiniować pole szablonu, aby zaznaczyć granice na cyfrowym obrazie żelu, który zostanie użyty do ilościowego określenia każdego prążka RNA. Prążek RNA widoczny w mieszaninie reakcyjnej ustawionej pod nieobecność enzymu PNK jest zwykle dobrym pasmem do wygenerowania tej matrycy. 
	UWAGA: Aby uniknąć odchylenia spowodowanego sygnałem tła, bardzo ważne jest, aby obszar otaczający każde mierzone pasmo RNA był identyczny. Z tego powodu najlepiej jest użyć tego samego pola szablonu do wyznaczenia każdego prążka RNA.</li>
	<li>Otwórz Menedżera ROI w sekcji "Narzędzia" i zaznacz pozycję pola szablonu, klikając "Dodaj". 
	UWAGA: Programy do pomiaru ilościowego mogą również rysować pola automatycznie zgodnie z instrukcją obsługi oprogramowania.</li>
	<li>Za pomocą lewego przycisku myszy kliknij i przeciągnij pole szablonu do następnego pasma RNA i powtórz krok 4.3. Kontynuuj ten proces, aż położenie wszystkich nieufosforylowanych i ufosforylowanych prążków RNA w każdej reakcji zostanie oznaczone.</li>
	<li>Zmierz zintegrowaną gęstość w każdym polu, klikając "Zmierz" w Menedżerze ROI.</li>
	<li>Aby obliczyć względną ilość ufosforylowanego RNA w reakcji, podziel zintegrowaną gęstość fosforylowanego pasma RNA przez sumę zintegrowanych gęstości nieufosforylowanych i fosforylowanych prążków RNA z tej samej reakcji. Podejście to można również zastosować do obliczenia względnej ilości niefosforylowanego RNA.</li>
	<li>Aby zobrazować akumulację fosforylowanego produktu RNA i odpowiadające mu zubożenie nieufosforylowanego substratu RNA w całej serii stężeń ATP, należy wykreślić względną ilość RNA obliczoną w kroku 4.6 w stosunku do stężenia ATP.</li>
</ol>

<ol><li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+%28NiKs%29+and+their+role+in+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li>
<li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease%2C+Polynucleotide+Kinase%2C+and+Exonuclease+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li>
<li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li>
<li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme%2C+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-end+labeling+of+RNA+with+%5Bgamma-32P%5DATP+and+T4+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li>
<li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+labeling%2C+conjugation+and+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li>
<li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End+labeling+procedures%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li>
<li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li>
<li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li>
<li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li>
<li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+tRNA+repair+enzyme+and+molecular+biology+workhorse%3A+T4+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase.</a> Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Molecular+Evolutionary+Analysis+Uncovers+a+Variety+of+Polynucleotide+Kinase+Clp1+Family+Proteins+in+the+Three+Domains+of+Life%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+Evolution%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life.</a> Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).</li>
<li>Jain, R., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+thermostable+archaeal+polynucleotide+kinase+homologous+to+human+Clp1%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1.</a> RNA. 15 (5), 923-931 (2009).</li>
<li>Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+RNA%22%5BJournal%5D)">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li>
<li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase%3A+an+RNA+repair+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li>
<li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li>
<li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li>
<li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li>
<li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase%2Fphosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex%2Fhemin+DNAzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li>
<li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li>
<li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li>
<li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3%2FLas1+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li>
<li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5%27--%3E3%27+exonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li>
<li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li>
<li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li>
<li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+5%27-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Application%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li>
<li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano test do pomiaru aktywności kinazy Grc3 PNK na znakowanych fluorescencyjnie substratach nukleotydowych. Protokół ten można zastosować do scharakteryzowania innych enzymów PNK poprzez adaptację buforu reakcyjnego i substratu oligonukleotydowego. Na przykład protokół wymaga śladowej ilości EDTA. Dodatek EDTA jest korzystny z dwóch powodów: po pierwsze, podejście to faworyzuje Grc3 związany z magnezem, zapobiegając wiązaniu enzymu ze śladowymi ilościami metali zanieczyszczających w mieszaninie. Po drugie, niewielka i...

Kinazy polinukleotydowe (PNK) odgrywają kluczową rolę w wielu szlakach przetwarzania DNA i RNA, takich jak naprawa DNA i składanie rybosomów1,2,3,4,5. Te podstawowe enzymy katalizują przenoszenie końcowego (gamma) monofosforanu z trifosforanu nukleozydu (NTP, najczęściej ATP) do końca hydroksylowego 5' substratu nukleotydowego. Jednym z najlepiej scharakteryzowanych PNK jest bakteriofag T4 PNK, który ma szeroką specyficzność substratową i jest intensywnie wykorzystywany przez laboratoria biologii molekularnej do wprowadzania znaczników izotopów promieniotwórczych na 5 końcach substratu DNA lub RNA6,7,8,9,10,11,12. Innym przykładem enzymu PNK jest CLP1, który znajduje się w Eukarya, Eubacteria i Archaea i jest zaangażowany w kilka szlaków przetwarzania RNA4,13,14,15.
Historycznie rzecz biorąc, większość testów mierzących aktywność kinazy polinukleotydowej zależy od znakowania izotopów radioaktywnych i późniejszej autoradiografii5,16. W ostatnich latach opracowano szereg dodatkowych testów do pomiaru aktywności PNK, w tym podejścia jednocząsteczkowe, elektroforezę mikroprocesorów, latarnie molekularne, a także testy kolorymetryczne i oparte na luminescencji17,18,19,20,21,22. Podczas gdy wiele z tych nowych podejść zapewnia zwiększone granice wykrywalności i pozwala uniknąć stosowania radioaktywności, każde z nich ma wady, takie jak koszt, zależność od unieruchomionej żywicy i ograniczenia w wyborze podłoża.
Grc3 to kinaza polinukleotydowa, która odgrywa kluczową rolę w przetwarzaniu prerybosomalnego RNA2,3,23. Grc3 tworzy kompleks obligatoryjny z endorybonukleazą Las1, która rozszczepia wewnętrzny transkrybowany dystans 2 (ITS2) prerybosomalnej klasy RNA3. Rozszczepienie ITS2 przez Las1 generuje produkt zawierający hydroksyl 5', który jest następnie fosforylowany przez kinazę Grc33. Aby zbadać specyficzność nukleotydów i substratów Grc3, potrzebny był niedrogi test, który pozwolił na testowanie różnych substratów oligonukleotydowych. W związku z tym opracowano test fosforylacji PNK przy użyciu substratów znakowanych fluorescencyjnie. Ten test został z powodzeniem wykorzystany do określenia, że Grc3 może wykorzystywać dowolny NTP do aktywności transferu fosforylu, ale faworyzuje ATP24. Protokół ten dostosowuje oryginalny test do pomiaru aktywności PNK Grc3 na RNA naśladującym jego prerybosomalny substrat RNA (SC-ITS2, Tabela 1). Jednym z wyzwań związanych z tym podejściem opartym na fluorescencji jest poleganie na dużych żelach poliakrylamidowych w celu skutecznego usuwania substratów fosforylowanych i niefosforylowanych. Protokół zawiera szczegółowe informacje na temat nalewania tych dużych żeli i unikania typowych pułapek przy tym.
Praca z RNA wymaga szczególnej ostrożności, ponieważ jest ono bardzo podatne na degradację. Istnieją proste kroki zapobiegawcze, które można podjąć, aby ograniczyć zanieczyszczenie rybonukleazą. Często pomocna jest oddzielna stacja robocza RNA, którą można łatwo leczyć środkiem czyszczącym zawierającym inhibitory RNazy. Podczas obchodzenia się z próbkami należy zawsze nosić rękawice i używać certyfikowanych materiałów eksploatacyjnych wolnych od RNaz. Ponieważ woda jest kolejnym częstym źródłem zanieczyszczeń, najlepiej jest używać świeżo oczyszczonej wody i sterylizować wszystkie roztwory za pomocą filtra 0,22 μm.

<table><tbody><tr><td>0,4 mm Grzebień 34-dołkowy</td><td>BioRad</td><td>1653848</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mm dystans</td><td>BioRad</td><td>1653812</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA ph 8,0</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3130</td><td></td></tr><tr><td>1M Chlorek Magnezu</td><td>KD Medical</td><td>CAC-5290</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris pH 8,0</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3360</td><td></td></tr><tr><td>40% Akrylamid/Bis Roztwór 29:1</td><td>BioRad</td><td></td><td></td>1610146</tr><tr><td>5M Chlorek sodu</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3720</td><td></td></tr><tr><td>nadsiarczan amonu (APS)</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383-1G</td><td></td></tr><tr><td>kwas borowy</td><td>Sigma</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>bromofenol niebieska sól sodowa</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Szklane talerze</td><td>Thomas Scientific</td><td>1188K51</td><td></td></tr><tr><td>Hoefer SQ3 Sequencer</td><td>Hoefer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Image J Oprogramowanie</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>Znakowane oligonukleotydy RNA</td><td>IDT</td><td>Zamówienie</td><td></td>niestandardowe</tr><tr><td>Pharmacia EPS 3500 Zasilacz</td><td>Pharmacia</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip 0. 22 um Filtr</td><td>miliporowy</td><td>5FCP00525</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>tris base</td><td>Sigma</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9500 żel imager</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure DEPC</td> Water <td>Invitrogen</td><td>750023</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>19E1056865</td><td></td></tr><tr><td>mocznik</td><td>Fisher Chemical</td><td>U15-500</td><td></td></tr></tbody></table>

test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Kinazy polinukleotydowe (PNK) to enzymy, które katalizują fosforylację 5' hydroksylowego końca oligonukleotydów DNA i RNA. Aktywność PNK można określić ilościowo za pomocą metod bezpośrednich lub pośrednich. Przedstawiono bezpośrednie podejście in vitro do pomiaru aktywności PNK, które opiera się na znakowanym fluorescencyjnie substracie oligonukleotydowym i elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. Takie podejście zapewnia rozdzielczość fosforylowanych produktów przy jednoczesnym unikaniu stosowania substratów znakowanych radioaktywnie. Protokół szczegółowo opisuje, jak ustawić reakcję fosforylacji, przygotować i uruchomić duże żele poliakrylamidowe oraz określić ilościowo produkty reakcji. Najtrudniejszą technicznie częścią tego testu jest nalewanie i uruchamianie dużych żeli poliakrylamidowych; W związku z tym podano ważne szczegóły, aby przezwyciężyć typowe trudności. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem Grc3, PNK, który łączy się w obligatoryjny kompleks przetwarzania prerybosomalnego RNA z jego partnerem wiążącym, nukleazą Las1. Protokół ten można jednak dostosować do pomiaru aktywności innych enzymów PNK. Co więcej, test ten można również zmodyfikować w celu określenia wpływu różnych składników reakcji, takich jak trifosforan nukleozydu, jony metali i oligonukleotydy.

Reprezentatywny, prawidłowy żel denaturujący z miareczkowania ATP stałą ilością kompleksu Las1-Grc3 przedstawiono na Rysunku 1. Dodanie enzymu spowodowało zależne od Las1 cięcie substratu RNA SC-ITS2, co doprowadziło do powstania określonego fragmentu RNA (RNA C2 z końcem 5-OH). Po dodaniu ATP fragment RNA C2 został ufosforylowany przez Grc3 PNK (RNA C2 z końcem 5-P). W żelach denaturujących ufosforylowane RNA migruje szybciej niż jego nieufosforylowany odpow...

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące fosforylacji pięciu pierwszych końców cząsteczek DNA lub RNA przez specjalną klasę enzymów znanych jako kinaza polinukleotydowa. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma rozdzielczość pozwalającą na wykrywanie bardzo małych zmian w substratach DNA i RNA. Zacznij od przygotowania reakcji kinazy enzymatycznej RNA.Dla każdej reakcji połącz jeden mikrolitr 500 nanomolowego substratu RNA. 8,3 mikrolitra 130 nanomolowych ostatniego, GRC trzy i 0,2 mikrolitra pięciomilimolowego EDTA. Ustaw blok grzewczy na 37 stopni Celsjusza.Następnie wymieszać 0,5 mikrolitra podzapasu ATP z serii koncentracji z jedną mieszaniną enzymów RNA i umieścić reakcję na bloku grzewczym. Kontynuuj mieszanie reakcji i umieszczanie ich na bloku grzewczym w odstępach dziesięciosekundowych. Po 60 minutach inkubacji na bloku cieplnym, wygaś każdą reakcję, doprawiając ją 10 mikrolitrami barwnika ładującego mocznik.Natychmiast przeprowadź dalszą analizę lub przechowuj reakcje w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do analizy w późniejszym terminie. Aby przygotować 15% denaturujący roztwór żelu akryloamidowego, połącz 22,5 mililitra wstępnie zmieszanego 40%29 z jednym roztworem akrylamidu/bis-akryloamidu. Sześć mililitrów po dziesięć x TBE.28,8 grama mocznika. I woda wolna od RNaz do całkowitej objętości 59 mililitrów. Następnie delikatnie wymieszaj roztwór.Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej przez 20 sekund. Wymieszaj i natychmiast włóż z powrotem do kuchenki mikrofalowej na kolejne 20 sekund. Delikatnie mieszaj roztwór, aż mocznik całkowicie się rozpuści.Umieścić szklaną zlewkę w płytkiej łaźni wodnej zawierającej zimną wodę przez pięć minut, upewniając się, że poziom zimnej wody otaczającej szklaną zlewkę jest wyższy niż poziom roztworu wewnątrz szklanej zlewki. Gdy roztwór ostygnie, przefiltruj go i odgazuj za pomocą jednorazowej jednostki filtrującej o wielkości 0,2 mikrometra, aby usunąć cząstki stałe i mikroskopijne pęcherzyki powietrza. Umyj krótką i długą szklaną płytkę wodą z mydłem, a następnie spryskaj każdą płytkę 95% etanolem i wytrzyj szkło, aby usunąć wilgoć.Podnieś długi talerz z blatu, umieszczając go na pudełku. Następnie umieść 0,4 milimetra przekładki wzdłuż długich krawędzi płyty. Połóż krótką płytkę na długiej płycie, upewniając się, że krawędzie krótkiej płyty, długiej płyty i przekładek są wyrównane.Następnie zaciśnij każdą stronę za pomocą trzech równomiernie rozmieszczonych metalowych zacisków. Dodaj 24 mikrolitry TEMED do roztworu akrylamidu i wymieszaj. Następnie dodaj 600 mikrolitrów 10% APS i natychmiast wlej roztwór między szklane płytki.Wlanie roztworu akrylamidu między kanapkę ze szklaną płytą może być naprawdę trudne. Aby uniknąć pęcherzyków powietrza, postukaj w kanapkę ze szklanym talerzem podczas nalewania roztworu. Ostrożnie dodaj czysty 32-dołkowy grzebień na wierzch kanapki ze szklanym talerzem.I pozwól akrylamidowi polimeryzować przez 30 minut. Aby uruchomić żel, ustaw blok grzewczy na 75 stopni Celsjusza. Usuń metalowe zaciski.I dokładnie umyj i osusz kanapkę ze szklaną płytą. Umieścić płytkę warstwową i aparat żelowy z krótką płytką skierowaną do przodu i przygotować bufor do pracy 0,5 X TBE, łącząc 100 mililitrów 10 X TBE z 1,9 litra wody wolnej od RNazy. Dodać 600 mililitrów buforu do górnej i dolnej komory aparatu.Delikatnie wyjmij grzebień z żelu i dokładnie spłucz studzienki strzykawką. Uruchom żel z mocą 50 watów przez 30 minut. Następnie ponownie spłucz studzienki.Po odwirowaniu reakcje wygaszania i inkubuj je w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Powtórz wirowanie impulsowe i natychmiast załaduj 10 mikrolitrów każdej próbki na żel. Następnie uruchom żel na trzy godziny przy mocy 50 watów.Po zakończeniu pracy wyłącz zasilanie i opróżnij górną komorę aparatu. Umyj i osusz zewnętrzną stronę kanapki ze szklaną płytą. Następnie przykryj go folią i przenieś do skanera laserowego w celu zobrazowania.Zamontuj kanapkę ze szklaną płytą na stoliku skanera laserowego. Ustaw długości fal wzbudzenia i emisji dla żądanego piętra i zobrazuj żel. Pokazano tutaj reprezentatywny udany żel denaturujący miareczkowania ATP z ustaloną ilością ostatniego kompleksu GRC trzy.Dodanie enzymu spowodowało ostatnie rozszczepienie RNA za pośrednictwem Saccharomyces cerevisiae ITS dwóch substratów RNA, co doprowadziło do zdefiniowanego fragmentu RNA. Po dodaniu ATP fragment RNA C2 został ufosforylowany przez GrC3 PNK. Aby zobrazować fosforylację fragmentu C2 RNA, względną ilość nieufosforylowanego i ufosforylowanego C2 RNA wykreślono w stosunku do stężenia ATP.Nasz reprezentatywny nieudany żel denaturujący jest pokazany tutaj. Substrat 21 nukleotydowego RNA zawierał produkty degradacji, które nakładały się na produkt fosforylowany i uniemożliwiały dokładne ilościowe określenie fosforylacji. W przeciwieństwie do tego, najkrótszy produkt degradacji RNA mógł być z powodzeniem analizowany, ponieważ ten obszar żelu nie zawierał żadnych dodatkowych gatunków RNA, które utrudniałyby dokładne określenie ilościowe jego fosforylowanego odpowiednika.Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas próbowania tego protokołu, jest przepłukanie dołków żelu, aby zapewnić równomierne załadowanie próbki. Po tej procedurze można przeprowadzić eksperyment z wymianą RNA. Aby zmierzyć tempo degradacji RNA, fosforylacja często sygnalizuje inicjację degradacji RNA.Technika ta toruje drogę do odpowiedzi na szczegółowe pytania dotyczące aktywności, specyfiki i kinetyki kinaz polinukleotydowych.

nonradioactive-assay-to-measure-polynucleotide-phosphorylation-small

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy elektroforezę w żelu poliakrylamidowym do denaturacji w celu oddzielenia fosforylowanych gatunków RNA od ich niefosforylowanych odpowiedników. Gatunki RNA są znakowane fluorescencyjnie w celu detekcji laserowej na żelu.

Denaturacja elektroforezy w żelu poliakryloamidowym mocznika do analizy RNA: technika oddzielania fluorescencyjnie znakowanych fosforylowanych oligonukleotydów RNA od ich niefosforylowanych odpowiedników

Ten film demonstruje czułą technikę fosforylacji białek za pomocą testu ściągania pojedynczej cząsteczki. Funkcjonalizacja glikolu polietylenowego-biotyny i zastosowanie znakowanych przeciwciał zwiększa wykrywalność fosforylowanej tyrozyny ze swoistością.

Test jednocząsteczkowy pull-down do analizy fosforylacji białek: wysokoprzepustowa technika ilościowego określania fosforylacji białek w lizacie komórkowym

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są wielodomenowymi białkami, które kodują zarówno domeny GTPazy, jak i kinazy, i które są fosforylowane w komórkach. W tym miejscu przedstawiamy protokół znakowania LRRK1 i LRRK2 w komórkach za pomocą ortofosforanu 32P, zapewniając w ten sposób sposób sposób sposób sposób na pomiar ich ogólnego poziomu fosforylacji komórkowej.

Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem

Opisany tutaj protokół reprezentuje łatwą i powtarzalną metodę, która wykorzystuje wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) do pomiaru metabolizmu puryn na komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) hodowanych w różnych warunkach.

Test oparty na HPLC do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej

Przedstawiamy i demonstrujemy zoptymalizowany test wiązania nitrocelulozy, który może być użyty do ilościowego określenia autofosforylacji oczyszczonych bakteryjnych kinaz histydynowych. Nasza metoda ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi technikami opartymi na SDS-PAGE, stanowiąc cenną alternatywę dla charakterystyki tych ważnych białek.

Kwantyfikacja autofosforylacji bakteryjnej kinazy histydynowej przy użyciu testu wiązania nitrocelulozy

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Opisujemy prostą metodę szybkiego oznaczania ilościowego nieorganicznego polifosforanu w różnych bakteriach, w tym Gram-ujemnych, Gram-dodatnich i mykobakteriach.

Oznaczanie na obecność nieorganicznego polifosforanu w bakteriach

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Poznaj nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych na małych substratach DNA i RNA. Ta metoda umożliwia wykrywanie subtelnych zmian fosforylacji końców 5' kwasów nukleinowych.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Przeglądaj więcej filmów