Name: Genetyczne badania przesiewowe z wykorzystaniem transgenicznego Calcium Reporter Aequorin w celu identyfikacji nowych celów w sygnalizacji wapniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę przesiewowego badania genetycznego w Arabidopsis z wykorzystaniem reportera wapniowego aequorin. Technika EMS pozwala identyfikować nowe geny w sygnalizacji wapniowej roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Narodowemu Instytutowi Badań nad Genomem Roślinnym - Phytotron Facility for plant growth, Bombay Locale za sesję zdjęciową oraz Departamentowi Biotechnologii - eLibrary Consortium za udostępnienie e-zasobów. Prace te były wspierane przez Departament Biotechnologii Indii w ramach grantu National Institute of Plant Genome Research Core Grant, programu Max Planck Gesellschaft-India Partner Group; oraz CSIR-Junior Research Fellowship (dla D.M i S.M) oraz Department of Biotechnology-Junior Research Fellowship (dla R.P).

1. Mutageneza EMS i zbiór nasion na podstawie pojedynczego rodowodowego (1-3 miesiące)
<ol>
	<li>Zważ 150 mg nasion (~ 7500) aequoryny do mutagenezy EMS (nasiona M0). Zważyć kolejne 150 mg nasion, które mają być użyte jako kontrola.</li>
	<li>Przenieś nasiona do probówki o pojemności 50 ml i dodaj 25 ml 0,2% EMS (v/v) (UWAGA) (do zaprawiania) lub 25 ml autoklawizowanej wody (do kontroli). 
	UWAGA: Sulfonian etylu metanu jest środkiem chemicznym służącym do mutagenizacji materiału roślinnego.</li>
	<li>Uszczelnij rurkę parafilmem i zawiń ją w folię aluminiową. Obracaj rurkę od końca do końca przez 18 godzin w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pozwól nasionom osiąść. Ostrożnie usunąć roztwór EMS i wyrzucić do pojemnika na odpady zawierającego 1 M NaOH w równych objętościach (NaOH pomaga zneutralizować/dezaktywować EMS, dzięki czemu można go bezpiecznie wyrzucić). Wyrzuć zużyte naczynie z tworzywa sztucznego do 1 M roztworu NaOH. 
	UWAGA: Po 24 godzinach należy zutylizować odrzuty zgodnie z praktykami laboratoryjnymi dotyczącymi materiałów niebezpiecznych.</li>
	<li>Umyj dokładnie zmutagizowane nasiona 40 ml autoklawowanej wody co najmniej 8 razy. Wyrzuć EMS zawierający wodę do pojemnika na odpady NaOH, jak wspomniano powyżej.</li>
	<li>Do końcowego prania dodaj 40 ml 100 mM tiosiarczanu sodu i spłucz 3 razy, aby usunąć ślady EMS.</li>
	<li>Namocz nasiona w 40 ml autoklawizowanej wody przez ~ 1 godzinę, aby rozproszyć EMS z nasion, a następnie umieść je na bibule filtracyjnej, aż do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Przenieść nasiona do probówki mikrowirówkowej i rozwarstwić nasiona w temperaturze 4 °C w 40 ml autoklawowanej wody przez 2-4 dni. Pomaga to w przerwaniu spoczynku nasion i zapewnia jednorodny wzrost.</li>
	<li>Przenieść zarówno nasiona mutagegenizowane (M0), jak i nasiona kontrolne na glebę (skład gleby: agropet: soilrite, 1:1) i przenieść je do pomieszczeń wzrostowych z 16 h światłem / 8 h ciemnym fotoperiodem, natężeniem światła 150 μmol∙m−2∙s−1 i ~70% wilgotnością względną.</li>
	<li>Aby ustalić, czy mutageneza zakończyła się sukcesem, należy zwrócić uwagę na zmniejszoną szybkość kiełkowania i wzrost siewek oraz sektorowanie chlorofilu18 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Porównaj rośliny zmutagizowane z roślinami kontrolnymi, aby zidentyfikować te różnice fizjologiczne i rozwojowe. 
	UWAGA: Do zbioru nasion z roślin M1 można stosować różne metody. W tym protokole zastosowaliśmy metodę zbioru nasion opartą na pojedynczym rodowodzie. Każdy zakład M1 ma unikalny numer, począwszy od A1 do A3500.</li>
	<li>Utrzymuj indywidualnie ponumerowane rośliny jako odrębne linie roślin (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Po osiągnięciu dojrzałości zbierz nasiona z tych pojedynczych zmutowanych roślin i przechowuj je jako pojedyncze linie M1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Z pojedynczej kolekcji nasion rodowodowych uzyskaliśmy około 5000 linii M1, z czego 3500 linii M1 zostało przesianych.</li>
</ol>
2. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu wyselekcjonowania mutantów (8 miesięcy)
<ol>
	<li>Identyfikacja nowych mutantów na podstawie odpowiedzi Ca2+ na wybrany bodziec. Tutaj użyliśmy H2O2 jako przykładu.</li>
	<li>W celu identyfikacji mutantów należy przeprowadzić badania przesiewowe generacji M2. Ponieważ mutanty recesywne segregują się z częstotliwością 1/8 w pokoleniu M2 po mutagenezie EMS14, badania przesiewowe roślin segregujących 8-12 M2 obejmują jedną linię M1 i identyfikują homozygotycznego recesywnego mutanta (użycie 12 sadzonek zwiększa prawdopodobieństwo znalezienia mutanta). Z każdej niezależnej linii M1 przebadać 12 sadzonek M2 pod kątem odpowiedzi Ca2+ na H2O2 (12 M2 siewek na M1 linia).</li>
	<li>Użyj wysokowydajnego protokołu sterylizacji nasion i hydroponicznego wzrostu roślin19. Umieścić prawie 12-15 M2 nasion na linię M1 w indywidualnych studzienkach 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i sterylizować przy użyciu chloru gazowego (40 ml 12% podchlorynu sodu i kwasu solnego, 3:1, v/v) w eksykatorze przez 4 godziny w dygestorium. Po zabiegu należy otworzyć eksykator i pozostawić na noc do odparowania chloru gazowego.</li>
	<li>Po sterylizacji wynieś płytki na zewnątrz i dodaj płynną pożywkę 1/2 MS (MS o połowie mocy bez agaru) do poszczególnych dołków. Uszczelnij płytki parafilmem i rozwarstwiaj nasiona przez 2-4 dni w temperaturze 4 °C, a następnie przenieś nasiona do komory wzrostowej z 10 godzinami światła / 14 godzin ciemnego fotoperiodu w temperaturze 20-22 °C i wilgotności względnej 70%.</li>
	<li>Gdy sadzonki osiągną wiek 8-12 dni, umieść 12 M2 sadzonki z każdej linii indywidualnie na 96-dołkowej płytce luminometru. Do pomiaru odpowiedzi Ca2+ na H2O2 należy użyć czytnika płytek luminometru.</li>
	<li>Po przeniesieniu sadzonki dodać 150 μl 5-10 μM roztworu koelentrazyny (rozcieńczonego w autoklalawowanej wodzie z 5 mM zapasu metanolu) (UWAGA) do indywidualnych studzienek w ciemnym/słabo oświetlonym miejscu i przechowywać w ciemności w temperaturze 21 °C przez 8 h. 
	UWAGA: Koelentrazyna jest grupą protetyczną, która wiąże się z apo-aequorin i odtwarza ją do funkcjonalnej aequorin. Koelentrazyna jest wrażliwa na światło i dlatego jest przechowywana w ciemnych butelkach, chronionych przed światłem.</li>
	<li>Następnego dnia wykonaj badanie przesiewowe mutantów przy użyciu 10 mM H2O2 jako bodźca i zmierz późniejszą odpowiedź Ca2+.</li>
	<li>Aby uzyskać jednoczesny pomiar 24 dołków, utwórz zautomatyzowany program kinetyczny, który mierzy tło przez 1 minutę, następnie dodawanie bodźców (40 μL) i pomiar przez 10 minut, a następnie całkowite wyładowanie aequorin (2 M CaCl2 w 150 μL 20% etanolu) przez 1-2 min. 
	UWAGA: Wyładowanie końcowe dla całkowitej aequoryny jest potrzebne do ilościowego określenia zmierzonego Ca2+ i jako dodatkowa kontrola dla funkcjonalnej aequoryny. Wyładowanie końcowe trwa krótko 1-2 minuty i nie powoduje znacznego obumierania roślin. Alternatywnie, jeśli rośliny umrą po etapie rozładowania, należy ponownie przesiać określoną linięM1 i uratować bez rozładowania. Takie mutanty można potwierdzić w pokoleniach M3 i M4 za pomocą etapu rozładowania.</li>
	<li>Użyj metody skanowania w formacie 24-dołkowym, która mierzy każdy rząd w odstępie 7 sekund z czasem integracji 300 ms na dołek na punkt pomiarowy. Użyj sadzonki typu dzikiego jako kontroli w każdym rzędzie do porównania i oceny mutanta. 
	UWAGA: Pojedyncza 96-dołkowa płytka zawierająca sadzonki M2 pokryje 8 pojedynczych linii M1 (8 M1 * 12 = 96 M2) i może być przesiewana w ciągu 2,5 godziny, a każdego dnia przesiewane będą 32 linie M1, 640 M1 roślin miesięcznie. Cała procedura przesiewania po tym, jak rośliny są gotowe, trwa około 8 miesięcy.</li>
	<li>Identyfikacja mutantów na podstawie utraty lub zmniejszonej odpowiedzi Ca2+ z H2O2 . Uratuj wybrane mutanty dzięki procesowi mycia opartemu na antybiotykach. Umyj sadzonkę dwukrotnie roztworem cefotaksymu o stężeniu 25 mg/l, a następnie przenieś do pożywki ratunkowej zawierającej 25 mg/l cefotaksymu w 1/2 MS agary.</li>
	<li>Hoduj płytki w świetle 10 godzin / 14 godzin ciemnego fotoperiodu, aby uzyskać zmutowaną roślinę. Mycie cefotaksymem pomaga usunąć wszelkie szkodliwe mikroorganizmy z sadzonki. Ponieważ sadzonki po rozpuszczeniu są utrzymywane bez zamknięcia, należy zminimalizować zanieczyszczenie podczas przenoszenia z powrotem do stanu sterylnego.</li>
	<li>Przenieś zmutowaną roślinę do gleby, aby uzyskać homozygotyczną populacjęM3.</li>
</ol>
3. Analiza danych i identyfikacja mutantów (1-3 miesiące)
UWAGA: Odczyty dostarczone z powyższej metody są w jednostkach światła względnego (RLU).
<ol>
	<li>Do obliczenia stężenia [Ca2+]cyt należy użyć następującego równania stężenia20. 
	pCa = 0,332588(−log (L/Lmax)) + 5,5593 
	Liczba luminescencji () i łączna liczba pozostałych (maks.).</li>
	<li>Przelicz uzyskane wartości pCa na wartości [Ca2+]cyt w μM, mnożąc przez 106. Następnie wykreśl graficznie względem kontroli aequorin (transgeniczny Col-0 aequorin) w celu zidentyfikowania przypuszczalnych mutantów H2O2 na odpowiedź Ca2 +.</li>
	<li>Uratowane sadzonki wykazujące utratę lub zmniejszoną reakcję na aplikacjęH2O2uratowane.</li>
	<li>Po osiągnięciu dojrzałości zbierz nasiona z uratowanego mutanta i ponownie przesiewaj je pod kątem reakcji na H2O2 w siewkach M3. Jeśli wszystkie 12 siewek M3 wykazują odpowiedź Ca2+ podobną do rośliny matecznej, należy uznać populację za homozygotyczną populację zmutowanąM3. Jeśli wszystkie 12 siewek nie wykazuje takiej odpowiedzi, przenieś je do pokolenia M4 i ponownie przesiew, aby uzyskać populację homozygotyczną.</li>
	<li>Po uzyskaniu homozygotycznej linii roślin zidentyfikuj gen prowadzący do zmiany fenotypu za pomocą sekwencjonowania nowej generacji.</li>
</ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+The+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: The lead currency of plant information processing.</a> The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Wasternack, C., Hause, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jasmonates%3A+biosynthesis%2C+perception%2C+signal+transduction+and+action+in+plant+stress+response%2C+growth+and+development.+An+update+to+the+2007+review+in+Annals+of+Botany%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany.</a> Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).</li>
<li>Kiep, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+cytosolic+Ca2%2B+elevation+is+activated+upon+wounding+and+herbivory+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+Luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>White, P. J., Broadley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Calcium in plants.</a> Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).</li>
<li>Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+impaired+in+intracellular+calcium+elevation+is+sensitive+to+biotic+and+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 162(2014).</li>
<li>Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The language of calcium signaling.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).</li>
<li>Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+calcium+signalling+and+early+signalling+elements+during+defence+responses+to+microbe-+or+damage-associated+molecular+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns.</a> The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).</li>
<li>Downie, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals+in+plant+immunity%3A+a+spiky+issue%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Calcium signals in plant immunity: a spiky issue.</a> New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).</li>
<li>Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+interplay+of+Ca2%2B+and+ROS+signaling+in+plant+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response.</a> Plant Science. 283, 343-354 (2019).</li>
<li>McAnish, M. R., Pittman, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+calcium+signature%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Shaping the calcium signature.</a> New Phytologist. 181, 275-294 (2009).</li>
<li>Colbert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+-throughput+screening+for+induced+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">High -throughput screening for induced point mutations.</a> Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).</li>
<li>Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoornneef%2C+M+%22Molecular+Plant+Biology%22">Molecular Plant Biology</a>. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).</li>
<li>Page, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+K+%22G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+in+Plants.+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).</li>
<li>Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+aequorin+monitors+cytosolic+calcium+transients+in+soybean+cells+challenged+with+beta-glucan+or+chitin+elicitors%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors.</a> Planta. 207 (4), 566-574 (1999).</li>
<li>Arisha, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethyl+methane+sulfonate+induced+mutations+in+M2+generation+and+physiological+variations+in+M1+generation+of+peppers+%28Capsicum+annuum+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.).</a> Frontiers in Plant Science. 6, 399(2015).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Rentel, M. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-induced+calcium+signalling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).</li>
<li>Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mutagenesis+of+seed+and+vegetatively+propagated+plants+using+EMS%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).</li>
<li>Espina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Phenotypic+Screening+of+an+Ethyl+Methane+Sulfonate+Mutant+Population+in+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 394(2018).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetics+in+Arabidopsis%3A+Finding+Mutations+that+Cause+Particular+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).</li>
<li>Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaple%2C+J+%22Circadian+Rhythms.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology</a>. Rosato, E. , 362(2007).</li>
<li>Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQu%2C+LJ+%22Arabidopsis+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).</li>
<li>Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeyser%2C+HMO+%22Arabidopsis%3A+the+Complete+Guide+%28Electronic+v.+1.4%29%22">Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4)</a>. Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).</li>
<li>Pauly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleus+together+with+the+cytosol+generates+patterns+of+specific+cellular+calcium+signatures+in+tobacco+suspension+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells.</a> Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).</li>
<li>Mithöfer, A., Mazars, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+measurements+of+intracellular+Ca2%2B-signatures+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells.</a> Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).</li>
<li>Mehlmer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signatures+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation.</a> The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).</li>
<li>Sello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+Ca2%2B+fluxes+into+and+across+thylakoids+revealed+by+thylakoid-targeted+aequorin+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes.</a> Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast-localized+BICAT+proteins+shape+stromal+calcium+signals+and+are+required+for+efficient+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis.</a> New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+plant+receptor+for+extracellular+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a plant receptor for extracellular ATP.</a> Science. 343 (6168), 290-294 (2014).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSCA1+mediates+osmotic-stress-evoked+Ca2%2B+increases+vital+for+osmosensing+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis.</a> Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lectin+S-domain+receptor+kinase+mediates+lipopolysaccharide+sensing+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).</li>
<li>Johnson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Poly%28A%29+Ribonuclease+Controls+the+Cellotriose-Based+Interaction+between+Piriformospora+indica+and+Its+Host+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+sensor+HPCA1+is+an+LRR+receptor+kinase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis.</a> Nature. 578, 577-581 (2020).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Mutageneza EMS jest potężnym narzędziem do generowania mutacji w populacji. Klasyczne przesiewowe badania genetyczne z wykorzystaniem EMS są skutecznym narzędziem do identyfikacji nowych genów z dwóch głównych powodów: po pierwsze, nie wymagają żadnych wcześniejszych założeń dotyczących tożsamości genów, a po drugie, nie wprowadzają żadnych uprzedzeń. Istnieje kilka metod generowania populacji przesiewowych, takich jak EMS, insercje T-DNA, promieniowanie itp. Spośród wszystkich metod, mutageneza oparta na EMS ma niewiele...

Zmiana stężenia cytozolowego wapnia (Ca2+) po dostrzeżenie bodźca biotycznego lub abiotycznego jest dobrze zbadanym wczesnym zdarzeniem sygnalizacyjnym, które aktywuje wiele szlaków sygnałowych1,2,3,4. Komórka w podstawowym stanie spoczynku utrzymuje niższe stężenie Ca2 + w cytozolu i sekwestruje nadmiar Ca2 + w różnych organellach wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowym apoplast, co prowadzi do stromego gradientu Ca2 + 5,6. Po percepcji sygnału poziom Ca2+ wzrasta w cytozolu z powodu napływu Ca2+ ze źródeł zewnątrzkomórkowych i / lub wewnątrzkomórkowych i generuje specyficzną dla bodźców sygnaturę wapnia7,8,9. Wzrost Ca2+ w cytozolu jest aktywowany przez wiele bodźców, ale swoistość jest utrzymywana przez odrębne magazyny uwalniające Ca2+, unikalną sygnaturę Ca2+ i odpowiednie białka sensoryczne10,11.
Użycie środka alkilatującego, sulfonianu etylometanu (EMS) do mutagenezy jest potężnym narzędziem w klasycznych badaniach genetycznych do identyfikacji wielu niezależnych genów zaangażowanych w proces. EMS jest mutagenem chemicznym indukującym głównie losowe przejścia C do T i G do A w całym genomie i powoduje zmianę o 1 pz na każde 125 kb genomu. Mutageneza EMS wywoła ≈1000 zmian pojedynczej pary zasad, albo insercji/delecji (InDel), albo polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) na genom12. Mutacje indukowane przez EMS to mutacje wielopunktowe o częstości mutacji od 1/300 do 1/30000 na locus. Zmniejsza to liczbę roślin M1 potrzebnych do znalezienia mutacji w danym genie. Zakres populacji nasion M1 wynoszący 2000-3000 jest zwykle używany do uzyskiwania interesujących mutacji u Arabidopsis thaliana13,14.
transgeniczne Aequorin to rośliny ekotypu Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) wykazujące ekspresję p35S-apoaequorin (pMAQ2) w klasie cytozolu<sup="xref">15. Aequorin jest białkiem wiążącym Ca2+ składającym się z apoproteiny i grupy protetycznej składającej się z cząsteczki lucyferyny, koelenterazyny. Wiązanie Ca2 + z ekworyną, która ma trzy miejsca wiązania Ca2 + EF rąk, powoduje utlenianie i cyklizację koelentrazyny w celu nadania dioksetanonowi produktu pośredniego, po której następuje zmiana konformacyjna białka, której towarzyszy uwolnienie dwutlenku węgla i celuenteramidu wzbudzonego singletem16. Wytworzony w ten sposób celenteramid emituje światło niebieskie (λmax, 470 nm), które może być wykryte przez luminometr17. Niezwykle szybkie wzrosty Ca2+ mogą być zatem mierzone w czasie rzeczywistym i wykorzystywane do szybkich badań genetycznych. Protokół ten ma na celu wykorzystanie specyfiki odpowiedzi wapnia do identyfikacji nowych kluczowych graczy, którzy są zaangażowani w sygnaturę Ca2 +. Aby osiągnąć to zadanie, wykorzystujemy mutagenezę EMS w transgenicznej aequorynie i identyfikujemy SNP związane ze zmienioną sygnalizacją Ca2 +. Protokół identyfikuje mutanty, które nie wykazują lub wykazują zmniejszone podwyższenie Ca2+ po dodaniu bodźców. Mutanty te można następnie zmapować w celu zidentyfikowania genów odpowiedzialnych za odpowiedź Ca2+. Metoda ma zastosowanie do każdego rodzaju bodźców płynnych w roślinach, które powodują podniesienie Ca2+. Ponieważ podniesienie Ca2+ jest jedną z pierwszych reakcji na szlaku sygnałowym obrony roślin, identyfikacja składników odpowiedzi na wcześniejszym etapie może dostarczyć kandydatów do inżynierii genetycznej w celu wyhodowania odpornych roślin.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowych</td><td>Jetbiofil</td><td>11024</td><td>do uprawy sadzonek</td></tr><tr><td>96-dołkowa biała płytka kliniczna</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502887</td><td>do pomiarów luminometrem</td></tr><tr><td>Aequorin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agropet</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>do wzrostu roślin</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>12135</td><td>do rozładowania rozwiązanie</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>PJK</td><td>55779-48-1</td><td>grupa protetyczna dla aequorin</td></tr><tr><td>Sulfonian ehtylmetanu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0880-5G</td><td>do mutagenezy nasion</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Odczynnik analityczny</td><td>1170</td><td>do roztworu odprowadzającego</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93001.0521</td><td>roztwór do sterylizacji</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>15465</td><td>jako bodziec do podniesienia poziomu wapnia</td></tr><tr><td>Wznoszenie Luminoskan</td><td>Thermo Scientific</td><td>5300172</td><td>pomiar luminescencji aequorin</td></tr><tr><td>Bufor MES Himedia</td><td></td><td>RM1128-100G</td><td>Wzrost roślin</td></tr><tr><td>Murashige i skoog Media</td><td>Himedia</td><td>PT021-25L</td><td>Wzrost roślin</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>27805</td><td>do neutralizacji EMS</td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93607.5021</td><td>roztwór do sterylizacji</td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>28005</td><td>do mycia nasion w kroku 1.6</td></tr><tr><td>soilryt</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>do wzrostu roślin</td></tr><tr><td>Doniczki kwadratowe</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>do wzrostu roślin</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>wzrost roślin</td></tr><tr><td>Taxim</td><td>Alkem</td><td>7180720</td><td>do ratowania sadzonek</td></tr></tbody></table>

genetyczne badania przesiewowe z wykorzystaniem transgenicznego calcium reporter aequorin w celu identyfikacji nowych celów w sygnalizacji wapniowej

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Genetyczne badania przesiewowe były ważnymi narzędziami w bezstronnej identyfikacji składników genetycznych zaangażowanych w kilka ścieżek biologicznych. Podstawą badania przesiewowego jest wygenerowanie populacji mutantów, którą można poddać badaniom przesiewowym pod kątem interesującego nas fenotypu. EMS (sulfonian etylometanu) jest powszechnie stosowanym środkiem alkilującym do wywoływania losowych mutacji w klasycznym przesiewowym badaniu genetycznym w celu identyfikacji wielu genów zaangażowanych w dowolny proces. Zwiększenie stężenia wapnia w cytozolu (Ca2+) jest kluczowym wczesnym szlakiem sygnałowym, który jest aktywowany po percepcji stresu. Jednak tożsamość receptorów, kanałów, pomp i transporterów Ca2+ jest nadal nieuchwytna w wielu badanych systemach. Aequorin jest komórkowym białkiem reporterowym wapnia wyizolowanym z Aequorea victoria i stabilnie eksprymowanym w Arabidopsis. Wykorzystując to, zaprojektowaliśmy przesiewowe badanie genetyczne, w którym zmutagizowaliśmy transgeniczną aequorin za pomocą EMS. Nasiona ze zmutowanych roślin zebrano (M1) i przeprowadzono badania przesiewowe pod kątem fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania w populacji segregującej (M2). Korzystając z 96-dołkowego protokołu pomiaru Ca2+ o wysokiej przepustowości, można zidentyfikować kilka nowych mutantów, które mają różną odpowiedź wapniową i są mierzone w czasie rzeczywistym. Mutanty o interesującym nas fenotypie są ratowane i rozmnażane aż do uzyskania homozygotycznej populacji zmutowanych roślin. Protokół ten zapewnia metodę przesiewowych badań genetycznych w tle reporterowym Ca2 + i identyfikacji nowych celów regulowanych przez Ca2 +.

Populację EMS przesiewano pod kątem wzrostu stężenia Ca2+ indukowanego przez H2O2 . Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, z każdej linii M1 przesiewano 12 poszczególnych siewek M2. Na Rysunku 3 przedstawiono jedną z takich linii M1, gdzie każdy panel pokazuje 12 poszczególnych siewek M2. Jako kontrolę do porównania i oceny odpowiedzi mutantów wykorzystano aequorynę typu dzikiego. Mutant recesywny segreguje w stosunk...

Przesiewowe badanie genetyczne oparte na wzroście Ca2+ jako odczyt prowadzi do identyfikacji składników genetycznych zaangażowanych w zależne od wapnia szlaki sygnałowe u roślin.

Genetyczne badania przesiewowe z wykorzystaniem transgenicznego Calcium Reporter Aequorin w celu identyfikacji nowych celów w sygnalizacji wapniowej

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Celem tego protokołu jest zidentyfikowanie metody, która może być wykorzystana do identyfikacji nowych genów zaangażowanych w sygnalizację wapniową. W tym celu korzystamy z klasycznego badania genetycznego. Sygnalizacja wapniowa jest ważnym szlakiem odpowiedzi obronnej w kilku systemach roślinnych.Aby zidentyfikować geny zaangażowane w ten szlak, użyliśmy klasycznego przesiewowego badania genetycznego. W tej metodzie EMS byłby używany jako środek alkilujący do wprowadzania losowych mutacji w systemach roślinnych. Opracowana generacja mutantów może być następnie wykorzystana do badań przesiewowych pod kątem interesującego nas fenotypu.Po zidentyfikowaniu interesującego nas fenotypu, gen przyczynowy może zostać zmapowany. W tym badaniu używamy modelowej rośliny Arabidopsis, która ma w swoim spektrum aequorynę reporterową wapnia. Zważyć 150 mg nasion aequorin do mutagenezy EMS i kolejne 150 mg nasion do użycia jako kontrola.Przenieś nasiona do 50 ml probówki Falcon i dodaj 2% EMS lub wodę w autoklawie. Podczas korzystania z EMS należy zachować ostrożność, ponieważ jest on rakotwórczy. Podczas korzystania z EMS należy nosić sprzęt ochronny i zapobiegać wszelkiego rodzaju rozlaniu.Uszczelnij tuby Falcon parafiną i zawiń je w folię aluminiową. Obracaj koniec rurki przez 18 godzin w temperaturze pokojowej. Pozostawić nasiona do opadnięcia i ostrożnie usunąć roztwór EMS i wyrzucić do pojemnika na odpady zawierającego jeden molowy NaOH.Umyj dokładnie zmutagenizowane nasiona 40 ml autoklalawowanej wody co najmniej osiem razy. Do końcowego prania dodaj 100 milimolowy tiosiarczan sodu i płucz co najmniej trzy razy, aby usunąć ślady EMS. Namocz nasiona w 40 ml autoklawowanej wody przez godzinę, aby rozproszyć EMS z nasion, a następnie umieść je na papierze Whatman, aż całkowicie wyschną.Przenieś nasiona do Eppendorf i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa do czterech dni w celu stratyfikacji. Przenieś zarówno zmutagenizowane nasiona, jak i nasiona poddane działaniu wody na glebę i przenieś je do pomieszczeń wzrostowych z 16-godzinnym światłem i ośmiogodzinnym ciemnym okresem zdjęciowym w temperaturze 22 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 70%. Aby ustalić, czy mutageneza zakończyła się sukcesem, poszukaj sektorów chlorofilu.Zastosowaliśmy metodę zbioru nasion opartą na pojedynczym rodowodzie, a każda roślina M1 ma nadawany unikalny numer. Po osiągnięciu dojrzałości nasiona są zbierane z tych pojedynczych zmutowanych roślin i przechowywane jako indywidualne linie M1. Stosuje się wysokowydajną sterylizację nasion i hydroponiczny protokół korzeni roślin, zaadaptowany z Ranf i wsp.Pierwszego dnia umieść prawie 12 do 15 M2 nasion na M1 w jednej linii w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i sterylizuj za pomocą podchlorynu sodu i roztworu kwasu solnego w stosunku trzy do jednego. To uwalnia chlor gazowy, który sterylizuje nasiona. Pozostaw płytkę na noc, aby całkowicie odparować pozostały chlor gazowy.Po sterylizacji dodaj płynne podłoża MS o połowie mocy do poszczególnych dołków i rozwarstwiaj nasiona przez dwa do czterech dni w czterech stopniach Celsjusza, a następnie przenieś nasiona do komory wzrostowej z okresem fotograficznym 10-godzinnego światła i 14-godzinnej ciemności w temperaturze 22 stopni Celsjusza, 70% wilgotności względnej. W 14 dniu, gdy sadzonki osiągną wiek od ośmiu do 12 dni, umieść 12 sadzonek M2 z każdej linii indywidualnie na 96-dołkowej płytce luminometru. Po przeniesieniu sadzonki dodaj 150 mikrolitrów pięciomikromolowego roztworu Coelenterazine do indywidualnych dołków i przechowuj w ciemności w temperaturze 21 stopni Celsjusza przez osiem godzin.Celenterazyna jest grupą protetyczną, która wiąże się z apoaequoryną, tworząc funkcjonalną aequorinę. Celenterazyna jest wrażliwa na światło i dlatego jest przechowywana w ciemnych butelkach chronionych przed światłem. Następnego dnia przebadaj mutanty za pomocą nadtlenku wodoru jako bodźca i zmierz późniejszy wzrost poziomu wapnia.Do jednoczesnego pomiaru 24 dołków wykonywany jest automatyczny program kinetyczny, który obejmuje pomiar tła przez jedną minutę, następnie dodanie bodźca i pomiar przez 10 minut, a następnie wstrzyknięcie wyładowania 150 mikrolitrów i pomiar przez trzy do pięciu minut. A wszelkie wydzieliny dla aequorin potomnych byłyby uwzględniane w odczycie w celu ilościowego określenia zmierzonego wapnia i jako dodatkowa kontrola dla funkcjonalnej aequoryny. Odczyty podane za pomocą powyższej metody są podane we względnych jednostkach światła.Do obliczenia stężenia cytozolowych jonów wapnia stosuje się wcześniej opisane równanie stężenia podane przez Rental i Knighta w 2004 roku, które jest opisane w protokole. RLU uzyskane z luminometru są dodawane do równania w celu obliczenia stężenia jonów wapnia. Uzyskane cytozolowe wartości jonów wapnia są następnie przedstawiane graficznie w stosunku do kontroli typu dzikiego w celu identyfikacji przypuszczalnych mutantów nadtlenku wodoru na odpowiedź wapnia.Jest to reprezentatywny wynik przedstawionego protokołu. Pokazaliśmy jedną linię M1 z 12 pojedynczymi siewkami, które zostały zmierzone pod kątem podniesienia stężenia jonów wapnia. Zielona linia na wykresie wskazuje aequorin typu dzikiego, który został zmierzony wraz z mutantami.Czerwona to średnia ze wszystkich 12 siewek, a linia to pojedyncze siewki M2 mierzone pod kątem wysokości jonów wapnia. Siewki wykazujące znacznie obniżoną reakcję na aplikację nadtlenku wodoru są następnie ratowane. Uratowane mutanty są następnie ponownie potwierdzane w następnym pokoleniu, a następnie mapowane w celu zidentyfikowania genów sprawczych.Należy zachować ostrożność podczas stosowania EMS jako mutagenu, ponieważ jest on czynnikiem rakotwórczym. Przez cały czas należy nosić sprzęt ochronny, a wszelkie rozlania należy rozpatrywać zgodnie z dobrymi praktykami laboratoryjnymi. Dodatkowo, podczas zbierania nasion na podstawie rodowodu, poszczególne rośliny powinny być zbierane z najwyższą starannością, aby na żadnym etapie nie doszło do wymieszania się jakichkolwiek nasion.Pomoże to cofnąć się i prześledzić roślinę mateczną, która jest homozygotyczną rośliną zmutowaną. Ponadto, ponieważ metoda ta nie wprowadza żadnych uprzedzeń ani żadnych wcześniejszych założeń do metody przesiewowej, można ją zastosować do jednego lub więcej warunków w celu zidentyfikowania fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto przy użyciu tego samego protokołu można również zidentyfikować wiele niezależnych genów.Protokół jest łatwy w użyciu, ponieważ przy małej dawce ogromna liczba roślin może zostać zmutagizowana. Ta ogromna liczba zmutowanych roślin może być wykorzystana w kilku populacjach i w kilku stanach oraz do identyfikacji kilku genów. Za pomocą tej metody można zidentyfikować częściową utratę funkcji, zmienioną funkcję, całkowitą utratę funkcji, a także konstytutywną funkcję genu.Mapowanie powinno być łatwym zadaniem, biorąc pod uwagę postęp w technologiach mapowania w obecnych scenariuszach. System mapowania oparty na de novo, wykres rasowy oparty na SNP i wiele innych może być wykorzystany do identyfikacji genu przyczynowego powodującego fenotyp będący przedmiotem zainteresowania. Biorąc pod uwagę możliwość zastosowania tej metody, może ona być stosowana nie tylko na roślinach modelowych Arabidopsis, ale także na innych roślinach modelowych, pod warunkiem, że można ustalić fenotyp będący przedmiotem zainteresowania.

forward-genetic-screen-using-transgenic-calcium-reporter-aequorin-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Tutaj prezentujemy nowatorskie podejście do obrazowania Ca2+ za pomocą bioluminescencyjnego reportera. Podejście to wykorzystuje stopiony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z Ca2+ i emituje światło, eliminując potrzebę wzbudzenia światła. Co istotne, metoda ta pozwala na długie, ciągłe obrazowanie, dostęp do głębokich struktur mózgu i wysoką rozdzielczość czasową.

In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Opisujemy podejścia do manipulacji genami w systemie modelu ewolucyjnego Astyanax mexicanus. Opisano trzy różne techniki: transgenezę za pośrednictwem Tol2, ukierunkowaną manipulację genomem za pomocą CRISPR/Cas9 oraz knockdown ekspresji za pomocą morpholinos. Narzędzia te powinny ułatwić bezpośrednie badanie genów leżących u podstaw zmienności między formami zamieszkującymi powierzchnię i jaskinie.

Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Opisujemy tutaj, założenie i zastosowanie mysiej linii reporterowej Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (określanej poniżej jako αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) do oceny przeprogramowania serca. Noworodkowe fibroblasty serca (NCF) wyizolowane ze szczepu myszy są przekształcane w indukowane kardiomiocyty (iCM), co pozwala na wygodną i efektywną ocenę skuteczności przeprogramowania i funkcjonalnego dojrzewania iCM poprzez strumień wapnia (Ca2+).

Ocena in vitro przeprogramowania serca poprzez pomiar specyficznego dla serca strumienia wapnia za pomocą reportera GCaMP3

Obecny protokół opisuje całkowicie optyczną kontrolę i obserwację wyzwalanej aktywności komórkowej w kardiomiocytach pochodzących z iPSC (iPSC-CMs) dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności. Pokazano wieloparametryczną kwantyfikację wzorców fenotypowych w czasie i przestrzeni. Wykazano długoterminowe działanie leków w ciągu godzin lub sekwencyjne pomiary w ciągu kilku dni.

Wysokoprzepustowe sterowanie optyczne i rejestrowanie sygnału wapnia w kardiomiocytach pochodzących z iPSC do badań toksyczności i fenotypowych badań przesiewowych leków

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Protezy siatkówki mają zdolność generowania percepcji wzrokowej. Aby przyspieszyć rozwój nowych protez, potrzebne są metody ex vivo do testowania urządzeń przed implantacją. W tym artykule przedstawiono kompleksowy protokół badania aktywności wapnia w warstwie komórek zwojowych siatkówki poddanych stymulacji elektrycznej.

Obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach

Poznaj metodę przesiewowego badania genetycznego w Arabidopsis z wykorzystaniem reportera wapniowego aequorin. Technika EMS pozwala identyfikować nowe geny w sygnalizacji wapniowej roślin.

Genetyczne badania przesiewowe z wykorzystaniem transgenicznego Calcium Reporter Aequorin w celu identyfikacji nowych celów w sygnalizacji wapniowej (Wideo) | JoVE Journal

Genetyczne badania przesiewowe z wykorzystaniem transgenicznego Calcium Reporter Aequorin w celu identyfikacji nowych celów w sygnalizacji wapniowej

Przeglądaj więcej filmów