Name: Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj metodę obrazowania transportu neurofilamentów w mielinizowanych aksonach myszy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia pomiar kierunkowości i prędkości transportu w izolowanych segmentach nerwów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Pauli Monsmie za instrukcje i pomoc przy mikroskopii konfokalnej i sekcji nerwu piszczelowego oraz dr Atsuko Uchida, Chloe Duger i Sana Chahande za pomoc w hodowli myszy. Praca ta była częściowo wspierana przez wspólne granty National Science Foundation IOS1656784 dla A.B. i IOS1656765 dla P.J. oraz granty National Institutes of Health R01 NS038526, P30 NS104177 i S10 OD010383 dla A.B. N.P.B. było wspierane przez stypendium z programu podoktoranckiego rektora Uniwersytetu Stanowego Ohio.

<ol><li>Hoffman, P. N., Lasek, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+component+of+axonal+transport.+Identification+of+major+structural+polypeptides+of+the+axon+and+their+generality+among+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons.</a> Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).</li>
<li>Brown, A. Slow Axonal Transport. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+A+%22Reference+Module+in+Biomedical+Sciences%22">Reference Module in Biomedical Sciences</a>. , (2014).</li>
<li>Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+movement+of+axonal+neurofilaments+interrupted+by+prolonged+pauses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses.</a> Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).</li>
<li>Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+neurofilament+transport+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons.</a> Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).</li>
<li>Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilaments+switch+between+distinct+mobile+and+stationary+states+during+their+transport+along+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).</li>
<li>Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+regulation+of+neurofilament+transport+by+myelinating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells.</a> Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).</li>
<li>Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Acceleration+of+Neurofilament+Transport+at+Nodes+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier.</a> Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).</li>
<li>Li, Y., Brown, A., Jung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+axonal+transport+kinetics+of+neurofilaments+using+the+fluorescence+photoactivation+pulse-escape+method%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method.</a> Physical Biology. 11 (2), 026001(2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Breuer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+transport+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+an+intra-axonal+organelle+traffic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis.</a> Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells%3A+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Model, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensity+calibration+and+flat-field+correction+for+fluorescence+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes.</a> Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).</li>
<li>Schmidt, M. M., Dringen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+iodoacetamide+and+iodoacetate+on+glycolysis+and+glutathione+metabolism+of+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroenergetics%22%5BJournal%5D)">Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes.</a> Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).</li>
<li>Surre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+increase+in+the+autofluorescence+of+cells+signals+struggle+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12088(2018).</li>
<li>Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Least+Squares+Congealing+for+Unsupervised+Alignment+of+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE+Computer+Society+Conference+on+Computer+Vision+and+Pattern+Recognition%22%5BJournal%5D)">Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).</li>
<li>Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy+of+NAD%28P%29H+and+flavoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).</li>
<li>Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kymograph+analysis+with+high+temporal+resolution+reveals+new+features+of+neurofilament+transport+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics.</a> Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).</li>
<li>Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Va+increases+the+efficiency+of+neurofilament+transport+by+decreasing+the+duration+of+long-term+pauses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses.</a> Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).</li>
<li>Xu, Z., Tung, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+Spatial+Variations+in+Slow+Axonal+Transport+Velocity+Along+Peripheral+Motoneuron+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons.</a> Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).</li>
<li>Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+Slowing+of+Neurofilament+Transport+Along+the+Mouse+Sciatic+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve.</a> Physical Biology. 6 (4), 046002(2009).</li>
<li>Cohen, J. The effect size index: d. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+J+%22Statistical+Power+Analysis+for+the+Behavioral+Sciences+2nd+ed%22">Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed</a>. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).</li>
<li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria in vivo.</a> Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).</li>
<li>Gilley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+axonal+transport+and+locomotor+changes+and+tau+hypophosphorylation+in+a+%22P301L%22+tau+knockin+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse.</a> Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).</li>
<li>Marinkovic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).</li>
<li>Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+declines+with+age+in+two+distinct+phases+separated+by+a+period+of+relative+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).</li>
<li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Należy zachować ostrożność przy analizie eksperymentów z ucieczką i rozproszeniem impulsu, ponieważ istnieje znaczne ryzyko wprowadzenia błędu podczas przetwarzania końcowego, głównie podczas korekcji płaskiego pola, wyrównywania obrazu i korekcji wybielania. Korekcja płaskiego pola jest konieczna, aby skorygować niejednorodność oświetlenia, która powoduje spadek intensywności w całym polu widzenia od środka do obrzeży. Zakres niejednorodności jest zależny od długości fali, a zatem powinien być zawsze wykonywany na długo...

Axonalny transport neurofilamentów został po raz pierwszy zademonstrowany w latach siedemdziesiątych przez radioizotopowe znakowanie impulsami1. Podejście to dostarczyło wielu informacji na temat transportu neurofilamentów in vivo, ale ma stosunkowo niską rozdzielczość przestrzenną i czasową, zwykle rzędu milimetrów i dni w najlepszym razie2. Co więcej, znakowanie impulsami radioizotopowymi jest podejściem pośrednim, które wymaga wstrzyknięcia i poświęcenia wielu zwierząt w celu wygenerowania jednego przebiegu czasowego. Wraz z odkryciem białek fluorescencyjnych i postępami w mikroskopii fluorescencyjnej w latach 90., możliwe stało się obrazowanie transportu neurofilamentów bezpośrednio w hodowanych neuronach w skali sekund lub minut i z submikrometrową rozdzielczością przestrzenną, co daje znacznie lepszy wgląd w mechanizm ruchu3. Badania te wykazały, że polimery neurofilamentów w aksonach poruszają się szybko i z przerwami zarówno w kierunku następczym, jak i wstecznym wzdłuż torów mikrotubul, napędzane przez białka motoryczne mikrotubul. Jednak neurofilamenty są strukturami o ograniczonej dyfrakcji o średnicy zaledwie 10 nm, które są zwykle oddalone od swoich sąsiadów o zaledwie kilkadziesiąt nanometrów; W związku z tym polimery mogą być śledzone tylko w hodowanych neuronach, które zawierają słabo rozmieszczone neurofilamenty, dzięki czemu poruszające się polimery mogą być rozdzielone od ich sąsiadów4. W związku z tym obecnie nie jest możliwe śledzenie pojedynczych neurofilamentów w aksonach, które zawierają obfite polimery neurofilamentów, takie jak aksony mielinizowane.
Aby przeanalizować transport aksonalny neurofilamentów w aksonach bogatych w neurofilamenty za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, używamy metody ucieczki impulsu fotoaktywacji fluorescencji, którą opracowaliśmy w celu zbadania długoterminowego zachowania neurofilamentów w hodowanych komórkach nerwowych4,5. Neurofilamenty oznaczone fotoaktywowalnym fluorescencyjnym białkiem fuzyjnym neurofilamentu są aktywowane w krótkim segmencie aksonu, a następnie szybkość opuszczania tych włókien z aktywowanego obszaru jest określana ilościowo, mierząc zanik fluorescencji w czasie. Zaletą tego podejścia jest to, że jest to analiza transportu neurofilamentów na poziomie populacji, która może być stosowana w skali czasu minut lub godzin bez konieczności śledzenia ruchu poszczególnych polimerów neurofilamentu. Na przykład użyliśmy tej metody do analizy kinetyki transportu neurofilamentów w kulturach mielinizujących6.
Niedawno opisaliśmy rozwój transgenicznej myszy transgenicznej hThy1-paGFP-NFM, która wykazuje niski poziom białka neurofilamentu M (paGFP-NFM) znakowanego paGFP w neuronach pod kontrolą ludzkiego specyficznego dla neuronów promotora Thy17. Mysz ta umożliwia analizę transportu neurofilamentów in situ za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tym artykule opisujemy eksperymentalne podejścia do analizy transportu neurofilamentów w mielinizowanych aksonach nerwów piszczelowych od tych myszy przy użyciu dwóch podejść. Pierwszym z tych podejść jest opisana powyżej metoda ucieczki impulsów. Metoda ta może generować informacje o zachowaniu neurofilamentów podczas pauzy, ale jest ślepa na kierunek, w którym włókna opuszczają aktywowany obszar, a zatem nie pozwala na pomiar kierunkowości netto i prędkości transportu8. Drugim z tych podejść jest nowa metoda rozpraszania impulsów, w której analizujemy nie tylko utratę fluorescencji z aktywowanego obszaru, ale także przejściowy wzrost fluorescencji w dwóch oknach bocznych, przez które poruszają się włókna fluorescencyjne, opuszczając aktywowany obszar zarówno w kierunku następczym, jak i wstecznym. W obu podejściach parametry transportu neurofilamentów, takie jak średnia prędkość, kierunkowość netto i zachowanie pauzyjne, można uzyskać za pomocą analizy matematycznej i modelowania zmian fluorescencji w oknach pomiarowych. Rysunek 3 ilustruje te dwa podejścia.
Ten protokół demonstruje preparację i przygotowanie nerwu, aktywację i obrazowanie fluorescencji paGFP oraz kwantyfikację transportu neurofilamentów z pozyskanych obrazów przy użyciu pakietu dystrybucyjnego FIJI ImageJ9. Używamy nerwu piszczelowego, ponieważ jest długi (kilka cm) i nie rozgałęzia się; jednak w zasadzie każdy nerw wyrażający paGFP-NFM jest odpowiedni do stosowania w tej technice, jeśli można go wypreparować i usunąć z osłonki bez uszkadzania aksonów.

<table><tbody><tr><td>14 x 22 Uszczelka prostokątna 0,1 mm</td><td>Bioptechs</td><td>1907-1422-100</td> uszczelka <td>wewnętrzna</td></tr><tr><td>2-deoksy-D-glukoza</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka okrągła 30 mm z</td><td>otworami Bioptechs</td><td>1907-08-750</td> uszczelka <td>zewnętrzna</td></tr><tr><td>35 x 10mm talerz</td><td>Thermo Fisher</td><td>153066</td><td>naczynia preparacyjne</td></tr><tr><td>40mm okrągłe szkiełka nakrywkowe</td><td>Bioptechs</td><td>40-1313-0319</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 60 ml - końcówka Luer-lock</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>System konfokalny Andor Revolution WD z wirującym dyskiem</td><td>Andor</td><td></td><td>wyposażony w systemy Perfect Focus i FRAPPA</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td><td>do szkiełka fluoresceinowego</td></tr><tr><td>D-(+)-roztwór glukozy</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-70</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>kleszcze z cienką końcówką</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Zeiss</td><td>47 50 03</td><td></td></tr><tr><td>Patelnia preparcyjna z woskiem</td><td>Ginsberg Scientific</td><td>568859</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>inicjał nożyczki preparacyjne</td></tr><tr><td>Komora perfuzyjna FCS2</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina sodowa</td><td>Fluka</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz roztworu</td><td>liniowego Warner Instruments</td><td>SH27-B</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do laminektomii</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>kleszcze do wstępnego rozwarstwienia</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Zjeżdżalnia mikroakweduktu</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td>do szkiełka fluoresceinowego</td></tr><tr><td>Wkładka stolika mikroskopu</td><td>Stosowane Oprzyrządowanie Naukowe</td><td>I-3017</td><td></td></tr><tr><td>System podgrzewania obiektywów</td><td>Okolab</td><td></td><td>Oko Touch z kołnierzem obiektywu</td></tr><tr><td>Olej do obiektywów - typ A</td><td>Nikon</td><td>wycofany z produkcji</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 100x 1.40 NA</td><td>obiektyw Nikon</td><td>MRD01901</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sód Jodooctan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2512</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Sage Instruments</td><td>Model 355</td><td></td></tr><tr><td>Adapter rurki - żeński</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td>1005109</tr><tr><td>Adapter do węży - męski</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td>1005012</tr><tr><td>Rurki Tygon</td><td>Bioptechs</td><td></td><td>1/16" ID, grubość ścianki 1/32"</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>cienkie nożyczki</td></tr></tbody></table>

obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Polimery białek neurofilamentowych poruszają się wzdłuż aksonów w powolnym komponencie transportu aksonalnego ze średnią prędkością ~0,35-3,5 mm/dzień. Do niedawna badanie tego ruchu in situ było możliwe tylko przy użyciu radioizotopowego znakowania impulsami, które pozwala na analizę transportu aksonalnego w całych nerwach z rozdzielczością czasową dni i rozdzielczością przestrzenną milimetrów. Aby zbadać transport neurofilamentów in situ z wyższą rozdzielczością czasową i przestrzenną, opracowaliśmy transgeniczną mysz hThy1-paGFP-NFM, która eksprymuje białko neurofilamentu M oznaczone fotoaktywowalnym GFP w neuronach. Tutaj opisujemy metody fluorescencji, fotoaktywacji, ucieczki impulsów i rozprzestrzeniania impulsów w celu analizy transportu neurofilamentów w pojedynczych mielinowanych aksonach nerwów piszczelowych od tych myszy ex vivo. Izolowane segmenty nerwowe są utrzymywane na stoliku mikroskopowym przez perfuzję z natlenioną solą fizjologiczną i obrazowane za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem. Światło fioletowe służy do aktywacji fluorescencji w krótkim oknie aksonalnym. Fluorescencja w obszarach aktywowanych i flankujących jest analizowana w czasie, co pozwala na badanie transportu neurofilamentów z rozdzielczością czasową i przestrzenną odpowiednio rzędu minut i mikronów. Modelowanie matematyczne można wykorzystać do wyodrębnienia parametrów kinetycznych transportu neurofilamentów, w tym prędkości, odchylenia kierunkowego i zachowania pauzy z uzyskanych danych. Metody ucieczki i rozprzestrzeniania się impulsu mogą być również dostosowane do wizualizacji transportu neurofilamentów w innych nerwach. Wraz z rozwojem dodatkowych myszy transgenicznych, metody te mogą być również wykorzystywane do obrazowania i analizowania transportu aksonalnego innych białek cytoszkieletu i cytozolu w aksonach.

Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne obrazy z eksperymentów ucieczki impulsu (pulse-escape) oraz rozprzestrzeniania się impulsu (pulse-spread). Opublikowaliśmy kilka badań opisujących dane uzyskane metodą pulse-escape oraz nasze metody analizy tych danych5,6,7,8,17. Poniżej pokazujemy, w jaki sposób dane z eksperymentów pulse-spr...

Opisujemy metody fotoaktywacji fluorescencji do analizy transportu aksonalnego neurofilamentów w pojedynczych mielinizowanych aksonach nerwów obwodowych od transgenicznych myszy, które wyrażają fotoaktywowane białko neurofilamentu.

Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Protokół ten umożliwia bezpośrednie obrazowanie populacji neurofilamentów w mielinizowanych aksonach od młodych lub dorosłych myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając pomiar kierunkowości i prędkości transportu neurofilamentów w izolowanych segmentach nerwowych. Metoda ta zależy od dostępności myszy wykazujących ekspresję fotoaktywowanej fluorescencyjnej fuzji białka będącego przedmiotem zainteresowania, ale może być dostosowana do użycia w każdym łatwo wypreparowanym nerwie. Na początek wlej natlenioną sól fizjologiczną do 60-mililitrowej strzykawki i upewnij się, że w strzykawce pozostało minimalną ilość powietrza.Podłączyć strzykawkę do rurki, a następnie umieścić rurkę odpływową w kolbie na odpady. Umieść uszczelkę zewnętrzną w obudowie komory perfuzyjnej, upewniając się, że słupki wlotowe i wylotowe przepływu są wyrównane z otworami w uszczelce, a następnie połóż uszczelkę wewnętrzną na okrągłym szkiełku nakrywkowym o numerze 1.5 i ostrożnie wygładź wszelkie zmarszczki w uszczelce, aby zapewnić szczelne uszczelnienie. Umieść szkiełko nakrywkowe i uszczelkę na ręczniku papierowym lub chusteczce roboczej z uszczelką skierowaną do góry.Użyj pary dużych nożyczek preparacyjnych, aby wykonać nacięcie grzbietowe w skórze w pobliżu środka kręgosłupa i kontynuuj cięcie wokół brzusznej części zwierzęcia. Powoli odciągnij skórę od mięśnia i przetnij powięź. Następnie użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby wykonać nacięcie w mięśniach ud w połowie odległości między ogonem a kolanem, aby odsłonić nerw kulszowy.Upewnij się, że nerw, który jest widoczny przez mięsień, nie jest przecięty. Przedłuż nacięcie grzbietowo i brzusznie, aby usunąć mięsień, a następnie usuń mięśnie łydki, utrzymując płytkie i krótkie nacięcia, aby uniknąć uszkodzenia nerwów. Kontynuuj usuwanie mięśni, aż nerw piszczelowy zostanie całkowicie odsłonięty od punktu, w którym rozgałęzia się od nerwu kulszowego do pięty.Chwyć nerw piszczelowy na bliższym końcu kręgosłupa za pomocą kleszczy i przetnij go nożyczkami do mikrodysekcji, uważając, aby nie wywierać zbyt dużego napięcia na nerw. Ostrożnie odsuń go od mięśnia i odetnij wszelkie przyczepy, uważając, aby nie napinać nerwu. Przeciąć dystalny koniec kręgosłupa nerwu piszczelowego i przenieść go na małą szalkę Petriego z natlenioną solą fizjologiczną o temperaturze pokojowej.Zaczynając od bliższego końca nerwu, delikatnie chwyć odsłonięte końce aksonów parą bardzo cienkich kleszczyków. Za pomocą drugiej pary kleszczy chwyć osłonkę nerwową proksymalnie i powoli pociągnij w kierunku dystalnego końca nerwu, upewniając się, że podczas tego procesu nie zostanie zastosowane nadmierne napięcie. Chwyć bliższy koniec nerwu i powoli połóż go na szkiełku nakrywkowym, a następnie wyprostuj pod delikatnym napięciem.Umieść zjeżdżalnię mikroakweduktu nad nerwem z rowkowaną zjeżdżalnią w dół i ustaw kierunek przepływu równolegle do nerwu. Odwróć szkiełko nakrywkowe i zespół mikroakweduktu i umieść go w obudowie komory perfuzyjnej tak, aby suwak był przeciwny do uszczelki zewnętrznej. Aby zabezpieczyć komorę profuzyjną, umieść ją w metalowej obudowie i obróć pierścień blokujący.Powoli wciśnij tłok strzykawki z solą fizjologiczną i napełnij komorę perfuzyjną. Rurki wlotowe i wylotowe, kolba wylotowa i strzykawka powinny być uniesione nad samą komorą przez cały czas podczas konfiguracji i obrazowania. Przenieś zestaw profuzji do odwróconego stolika mikroskopowego i zamontuj strzykawkę z solą fizjologiczną w pompie strzykawkowej, a następnie uruchom silnik i dostosuj prędkość do natężenia przepływu 0,25 mililitra na minutę.Podłącz wbudowany podgrzewacz roztworu i ustaw go na 37 stopni Celsjusza. Podłącz grzejnik obiektywowy i ustaw go na 37 stopni Celsjusza. Nałóż olej na obiektyw i włóż komorę propryzyjną do mocowania stage.Nałóż olej na podkładkę grzejną komory i przymocuj ją do komory perfuzyjnej, a następnie podłącz i ustaw na 37 stopni Celsjusza. Zablokuj komorę profuzji w stage adapter i doprowadź olej do obiektywu do kontaktu ze szkiełkiem nakrywkowym na spodzie komory. Użyj oświetlenia Brightfield, aby skupić się na warstwie aksonów na dolnej powierzchni nerwu znajdującej się najbliżej powierzchni szkiełka nakrywkowego.Zmielinizowane aksony można zidentyfikować po obecności osłonki mielinowej, która jest widoczna w świetle przechodzącym w jasnym polu bez wzmocnienia kontrastu. Uzyskaj obraz referencyjny Brightfield, rejestrując kierunkowość nerwu, a następnie uzyskaj obraz konfokalny za pomocą lasera 488 nanometrów i filtra emisyjnego odpowiedniego dla fotoaktywowanego GFP. Ustaw moc lasera na około pięciokrotność normalnej mocy obrazowania i uzyskaj obraz o czasie ekspozycji od trzech do czterech minut, a następnie uzyskaj kolejny obraz konfokalny, aby zarejestrować autofluorescencję przed aktywacją po etapie wybielania.Narysuj linię równoległą do aksonów o długości równej żądanemu rozmiarowi okna aktywacji obrazu Brightfield. Używając tej linii jako przewodnika, narysuj prostokątny obszar zainteresowania w poprzek pola widzenia prostopadłego do aksonów. Aktywuj fluorescencję GFP w tym regionie poprzez wzbudzenie wzoru światłem o długości 405 nanometrów, upewniając się, że obraz jest uzyskiwany tuż przed i bezpośrednio po aktywacji.Po zakończeniu aktywacji uruchom jednominutowy minutnik. Kiedy się wyłączy, zacznij nabywać serię poklatkową. Dodaj 250 miligramów fluoresceiny w proszku do 0,5 mililitra podwójnie destylowanej wody i mieszaj, aż nie będzie widocznych cząstek, a następnie wiruj roztwór przez 30 sekund w wirówce stołowej, aby osadzać nierozpuszczony materiał.Dodać osiem mikrolitrów roztworu fluoresceiny do szkiełka podstawowego i nałożyć szkiełko nakrywkowe o numerze 1,5. Zetrzyj nadmiar płynu, uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i pozostaw szkiełko do wyschnięcia. Umieść szkiełko nakrywkowe stroną do dołu na odwróconym stoliku mikroskopu i wyreguluj ostrość na cienkiej płaszczyźnie fluorescencji na powierzchni szkiełka nakrywkowego.Przesuń szkiełko, aby znaleźć pole widzenia, które nie zawiera pęcherzyków powietrza ani dużych cząstek fluoresceiny, i uzyskaj stos Z obejmujący sześć mikrometrów w odstępach 0,2 mikrometra, tak aby środkowy obraz był oryginalną płaszczyzną ostrości. Zamknij wszystkie migawki ścieżki światła, w tym migawkę aparatu, i ustaw moc lasera oraz czas naświetlania na zero sekund. Uzyskaj stos 100 obrazów z tymi ustawieniami, które zostaną uśrednione w celu wygenerowania obrazu ciemnego pola.Reprezentatywne obrazy z eksperymentów z ucieczką i rozprzestrzenianiem się impulsów są pokazane tutaj. W przypadku metody ucieczki impulsu, kinetyka zaniku fluorescencji w aktywowanym regionie może dostarczyć informacji na temat długotrwałego i krótkoterminowego zachowania pauzy. Aktywowany region może być krótki dla tych eksperymentów.W metodzie rozpraszania impulsów stosuje się dłuższy obszar aktywowany w celu zapewnienia większej puli fluorescencyjnych neurofilamentów. Wydłuża to czas, w którym wzrost fluorescencji w obszarach bocznych pozostaje liniowy. Zastosowano tu 15-mikrometrowe okna boczne.Określono ilościowo całkowitą fluorescencję z okienka pomiarowego. Rozpad jest dwufazowy dla metody ucieczki impulsu, przy czym początkowy rozpad wykładniczy reprezentuje odejście neurofilamentów na torze, a drugi wolniejszy rozpad wykładniczy po 10 do 20 minutach, który reprezentuje odejście włókien poza torem. W przypadku strategii rozrzutu impulsów obliczenia prędkości i kierunkowości ruchu są zależne tylko od nachyleń w oknach bocznych.W przypadku zastosowanych tutaj długości okien faza liniowa trwa około pięciu minut. Pokazano tutaj timelapse z nerwu hamowanego glikolitycznie pokazującego pozorne zmniejszenie transportu z aktywowanego obszaru. Rzeczywiście, zbocza dystalne i proksymalne są znacznie niższe w nerwach leczonych inhibitorem.Obserwuje się również znaczny spadek prędkości populacji między tymi dwoma warunkami. Próbując tego protokołu, pamiętaj, że bardzo ważne jest, aby zachować pośpiech w przeprowadzaniu sekcji i montażu części komory, ponieważ zdrowie nerwów pogarsza się po złożeniu zwierzęcia w ofierze. Hodowla komórek neuronalnych może pozwolić na pomiar i analizę ruchu poszczególnych neurofilamentów, co uzupełniłoby dane w skali populacji zebrane za pomocą tego protokołu.

imaging-analysis-neurofilament-transport-excised-mouse-tibial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Immunocytochemiczna identyfikacja podtypów włókien obwodowych nerwów czuciowych (oraz wykrywanie ekspresji białek w ich obrębie) jest kluczowa dla zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw czucia obwodowego. W niniejszej pracy opisujemy metody przygotowania próbek tkanek obwodowych i trzewnych, takich jak skóra i kości kończyn, do specyficznego barwienia immunologicznego obwodowych włókien nerwów czuciowych.

Przygotowanie tkanek i immunobarwienie włókien nerwów czuciowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn

W niniejszym raporcie opisujemy metodę zmiażdżenia nerwu kulszowego u myszy. Metoda ta wykorzystuje powszechnie dostępne kleszczyki hemostatyczne i pozwala w prosty oraz powtarzalny sposób uzyskać całkowite zmiażdżenie nerwu kulszowego. Ponadto opisujemy metodę przygotowania preparatów całych mięśni, odpowiednich do analizy regeneracji nerwów po zmiażdżeniu nerwu kulszowego.

Powtarzalny model zmiażdżenia nerwu kulszowego myszy i późniejsza ocena regeneracji poprzez analizę całego preparatu mięśnia

Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej uwidocznij uszkodzony nerw, który wykazuje postępujący wzrost obrzęków i rozłączeń aksonów.

Mikroskopowa analiza elektronowa uszkodzenia aksonów w nerwie wzrokowym myszy z uszkodzeniem mózgu

Źródło: Boyer, N. P. et. al., Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy. J. Vis. exp. (2020) Ten film przedstawia metodę fotoaktywacji fluorescencji do analizy transport neurofilamentów w mielinowanych aksonach nerwów obwodowych. Śledząc fotoaktywowane zielone neurofilamenty znakowane fluoroforem, technika ta dostarcza informacji na temat transportu aksonalnego w chorobach neurodegeneracyjnych.

Obrazowanie fotoaktywacji fluorescencyjnej transportu neurofilamentów w mielinizowanych aksonach myszy 

Przedstawiono protokół dynamicznego obrazowania podłużnego i selektywnego laserowego uszkadzania zakończeń nerwowych u reporterowych myszy transgenicznych.

In vivo (in vivo) Mikroskopia dwufotonowa pojedynczych zakończeń nerwowych w skórze

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Celem tej techniki jest przygotowanie wysoce wzbogaconej kultury pierwotnych neuronów ruchowych (MN) z mysiego rdzenia kręgowego. Aby ocenić konsekwencje mutacji powodujących choroby MN, opisujemy tutaj izolację tych izolowanych MN i ich transfekcję przez magnetofekcję.

Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy

Elektroporacja to skuteczne podejście do dostarczania interesujących genów do komórek. Stosując to podejście in vivo na neuronach zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy (DRG), opisujemy model do badania regeneracji aksonów in vivo.

Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Korzystając z transgenicznych myszy fluorescencyjnych, opisano szczegółowe protokoły do oceny in vivo transportu aksonalnego endosomów sygnałowych i mitochondriów w obrębie aksonów motorycznych i czuciowych nienaruszonego nerwu kulszowego u żywych zwierząt.

Rozszerzenie zestawu narzędzi do obrazowania in vivo transportu aksonalnego

Protokół pokazuje metodę badania korelacji przestrzennej między zakończeniami presynaptycznymi, receptorami postsynaptycznymi i okołosynaptycznymi komórkami Schwanna w mięśniu brzuchatym łydki szczura przy użyciu immunohistochemii fluorescencyjnej z różnymi biomarkerami, a mianowicie: neurofilamentem 200, pęcherzykowym transporterem acetylocholiny, alfa-bungarotoksyną i S100.

Wizualizacja cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowym szczura

Poznaj metodę obrazowania transportu neurofilamentów w mielinizowanych aksonach myszy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia pomiar kierunkowości i prędkości transportu w izolowanych segmentach nerwów.

Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy

Przeglądaj więcej filmów