Name: Rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Poznaj metodę rozwarstwienia, immunohistochemii i montażu mózgów larwalnych i dorosłych Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego. Trzy strategie montażu umożliwiają optymalne obrazowanie struktur nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Claude'owi Desplanowi za udostępnienie nam porcji przeciwciała Bsh. Przeciwciała monoklonalne DE-Cadherin, Jamnik, Eyes Absent, Seven-up i Bruchpilot uzyskano z Developmental Studies Hybridoma Bank, utworzonego przez NICHD NIH i utrzymywanego na Uniwersytecie Iowa, Wydział Biologii, Iowa City, IA 52242. Prace te zostały wsparte grantem NSERC Discovery Grant przyznanym T.E. Zjednoczone Emiraty Arabskie są wspierane przez stypendium NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship. P.V. jest wspierany przez stypendium dla absolwentów Ontario.

<ol><li>Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optic+lobe+of+Drosophila+melanogaster.+I.+A+Golgi+analysis+of+wild-type+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell Tissue Research. 258, (1989).</li>
<li>Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+pattern+and+early+differentiation+of+the+optic+lobes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Roux%27s+Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Proliferation pattern and early differentiation of the optic lobes in Drosophila melanogaster.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 198, 264-274 (1990).</li>
<li>Sanes, J. R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Principles+of+Insect+and+Vertebrate+Visual+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Design Principles of Insect and Vertebrate Visual Systems.</a> Neuron. 66, 15-36 (2010).</li>
<li>Nériec, N., Desplan, C. From the Eye to the Brain. Development of the Drosophila Visual System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%A9riec%2C+N+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22">Current Topics in Developmental Biology</a>. 116, Academic Press Inc. 247-271 (2016).</li>
<li>Apitz, H., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Challenge+of+Numbers+and+Diversity%3A+Neurogenesis+in+the+Drosophila+Optic+Lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A Challenge of Numbers and Diversity: Neurogenesis in the Drosophila Optic Lobe.</a> Journal of Neurogenetics. 28, 233-249 (2014).</li>
<li>Contreras, E. G., Sierralta, J., Oliva, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategies+for+the+generation+of+neuronal+diversity%3A+Lessons+from+the+fly+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Novel strategies for the generation of neuronal diversity: Lessons from the fly visual system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 140(2019).</li>
<li>Erclik, T., Hartenstein, V., Lipshitz, H. D., McInnes, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Role+of+the+Vsx+Genes+Supports+a+Monophyletic+Origin+for+Bilaterian+Visual+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved Role of the Vsx Genes Supports a Monophyletic Origin for Bilaterian Visual Systems.</a> Current Biology. 18, 1278-1287 (2008).</li>
<li>Erclik, T., Hartenstein, V., McInnes, R. R., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+evolution+at+high+resolution%3A+The+neuron+as+a+unit+of+homology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Eye evolution at high resolution: The neuron as a unit of homology.</a> Developmental Biology. 332, 70-79 (2009).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+projection+neurons+in+the+Drosophila+lobula+link+feature+detection+to+distinct+behavioral+programs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Visual projection neurons in the Drosophila lobula link feature detection to distinct behavioral programs.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Ngo, K. T., Andrade, I., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+pattern+of+neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+visual+system%3A+A+user%27s+guide+to+the+dynamic+morphology+of+the+developing+optic+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal pattern of neuronal differentiation in the Drosophila visual system: A user's guide to the dynamic morphology of the developing optic lobe.</a> Developmental Biology. 428, 1-24 (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterning+of+Drosophila+medulla+neuroblasts+controls+neural+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temporal patterning of Drosophila medulla neuroblasts controls neural fates.</a> Nature. 498, 456-462 (2013).</li>
<li>Erclik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+temporal+and+spatial+patterning+generates+neural+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integration of temporal and spatial patterning generates neural diversity.</a> Nature. 541, 365-370 (2017).</li>
<li>Apitz, H., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+region-specific+neurogenesis+mode+requires+migratory+progenitors+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A region-specific neurogenesis mode requires migratory progenitors in the Drosophila visual system.</a> Nature Neuroscience. 18, 46-55 (2015).</li>
<li>Suzuki, T., Kaido, M., Takayama, R., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporal+mechanism+that+produces+neuronal+diversity+in+the+Drosophila+visual+center%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A temporal mechanism that produces neuronal diversity in the Drosophila visual center.</a> Developmental Biology. 380, 12-24 (2013).</li>
<li>Hara, Y., Sudo, T., Togane, Y., Akagawa, H., Tsujimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+neural+precursor+cells+and+neurons+before+neurite+formation+prevents+the+emergence+of+abnormal+neural+structures+in+the+Drosophila+optic+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell death in neural precursor cells and neurons before neurite formation prevents the emergence of abnormal neural structures in the Drosophila optic lobe.</a> Developmental Biology. 436, 28-41 (2018).</li>
<li>Morante, J., Erclik, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+Drosophila+optic+lobe+neurons+is+controlled+by+eyeless%2FPax6%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell migration in Drosophila optic lobe neurons is controlled by eyeless/Pax6.</a> Development. 138, 687-693 (2011).</li>
<li>Millard, S. S., Pecot, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+assembling+columns+and+layers+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Strategies for assembling columns and layers in the Drosophila visual system.</a> Neural Development. 13, 1-17 (2018).</li>
<li>Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuits+of+the+Drosophila+optic+lobe%3A+The+input+terminals+to+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: The input terminals to the medulla.</a> Journal of Comparative Neurology. 509, 493-513 (2008).</li>
<li>Akin, O., Bajar, B. T., Keles, M. F., Frye, M. A., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-Specific+Patterned+Stimulus-Independent+Neuronal+Activity+in+the+Drosophila+Visual+System+during+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-type-Specific Patterned Stimulus-Independent Neuronal Activity in the Drosophila Visual System during Synapse Formation.</a> Neuron. 101, 894-904 (2019).</li>
<li>Spratford, C. M., Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+immunostaining+of+imaginal+discs+from+drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51792(2014).</li>
<li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atonal%2C+rough+and+the+resoluton+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atonal, rough and the resoluton of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122, Cambridge, England. 4139-4147 (1996).</li>
<li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+immunohistochemistry+of+larval%2C+pupal+and+adult+Drosophila+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas.</a> Journal of visualized experiments. , e4347(2012).</li>
<li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+immunofluorescent+staining+of+mushroom+body+and+photoreceptor+neurons+in+adult+Drosophila+melanogaster+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56174(2017).</li>
<li>Williamson, R. W., Hiesinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. , e1936(2010).</li>
<li>Bertet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterning+of+neuroblasts+controls+notch-mediated+cell+survival+through+regulation+of+hid+or+reaper%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal patterning of neuroblasts controls notch-mediated cell survival through regulation of hid or reaper.</a> Cell. 158, 1173-1186 (2014).</li>
<li>Pinto-Teixeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Concurrent+Retinotopic+Maps+in+the+Fly+Motion+Detection+Circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development of Concurrent Retinotopic Maps in the Fly Motion Detection Circuit.</a> Cell. 173, 485-498 (2018).</li>
<li>Plevock, D. A., Rusan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51756(2014).</li>
<li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+dendritic+morphology+in+columns+and+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing dendritic morphology in columns and layers.</a> Journal of Visualized Experiments. , e55410(2017).</li>
<li>Özel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> eLife. 4, (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym protokole opisujemy metodę immunobarwienia mózgów larw i dorosłych Drosophila i montowania ich w kilku orientacjach. Podczas gdy metody barwienia mózgów larw i dorosłych zostały już wcześniej opisane 22,23,24,27,28, mniej uwagi poświęcono strategiom montażu w celu optymalnej wizualizacji określonych struktur płata wzrokowego 28...

System wzrokowy Drosophila, składający się z oka złożonego i leżącego pod nim płata wzrokowego, był doskonałym modelem do badania rozwoju i funkcji obwodów nerwowych. W ostatnich latach w szczególności płat wzrokowy stał się potężnym systemem, w którym można badać procesy neurorozwojowe, takie jak neurogeneza i okablowanie obwodów1,2,3,4,5,6,7,8. Składa się z czterech neuropils: blaszki, rdzenia, zrazika i płytki zrazikowej (dwie ostatnie tworzą kompleks zrazika)1,2,3,4,5,6. Fotoreceptory z oka celują w neurony blaszki i rdzenia, które przetwarzają bodźce wzrokowe i przekazują je do neuropils kompleksu zrazika1,2,3,4,5,6. Neurony projekcyjne w kompleksie zrazika następnie wysyłają informacje wizualne do centrów przetwarzania wyższego rzędu w centralnym mózgu1,5,9. Złożona organizacja płata wzrokowego, wymuszona potrzebą utrzymania retinotopii i przetwarzania różnych rodzajów bodźców wzrokowych, sprawia, że jest to atrakcyjny system do badania, w jaki sposób budowane są wyrafinowane obwody neuronowe. Warto zauważyć, że rdzeń ma uderzające podobieństwa zarówno pod względem organizacji, jak i rozwoju z neurosiatkówką, która od dawna jest modelem rozwoju obwodów nerwowych kręgowców3,8.
Rozwój płata wzrokowego rozpoczyna się podczas embriogenezy, z wyszczególnieniem ~35 komórek ektodermalnych, które tworzą placode wzrokowy2,4,5,6,7,8. Po wykluciu się larwy placode wzrokowy dzieli się na dwie odrębne zawiązki: 1) zewnętrzne centrum proliferacji (OPC), które generuje neurony blaszki i zewnętrznego rdzenia oraz 2) wewnętrzne centrum proliferacji (IPC), które generuje neurony wewnętrznego rdzenia i kompleksu płatowego4,5,6,10. U larwy drugiego stadium rozwoju komórki neuroepitelialne OPC i IPC zaczynają przekształcać się w neuroblasty, które następnie generują neurony za pośrednictwem komórek macierzystych zwojów pośrednich4,5,11,12. Neuroblasty płata wzrokowego są wzorowane na ograniczonych przestrzennie i czasowo czynnikach transkrypcyjnych, które działają razem, aby generować różnorodność neuronalną u ich potomstwa11,12,13,14. W poczwarce obwody neuropils płata wzrokowego są łączone poprzez koordynację kilku procesów, w tym programowanej śmierci komórki11,15, migracja neuronalna12,16, celowanie aksonalne/dendrytyczne10,17, tworzenie synaps18,19 i neuropil rotations10,17.
Tutaj opisujemy metodologię, za pomocą której larwy i dorosłe mózgi są preparowane, barwione immunologicznie i montowane do obrazowania płata wzrokowego. Biorąc pod uwagę jego złożoną trójwymiarową organizację, analiza płata wzrokowego wymaga zrozumienia, w jaki sposób jego dorosłe neuropils i larwalne przodki są ustawione względem siebie i centralnego mózgu. W związku z tym kładziemy szczególny nacisk na to, jak orientacja montażu odnosi się do organizacji przestrzennej struktur płata wzrokowego. Opisujemy trzy strategie montażu dla mózgów larw (przedni, tylny i boczny) oraz trzy dla mózgów dorosłych (przedni, tylny i poziomy), z których każda zapewnia optymalny kąt do obrazowania określonej populacji progenitorów płata wzrokowego lub neuropilu.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Bioshop</td><td>PBS405</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyd</td><td>Bioshop</td><td>FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (koza) wtórny</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>stosować w 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 (mysz) wtórny</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td>używać w 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (świnka morska) wtórna</td><td>Invitrogen</td><td>A-21450</td><td>używać w 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (szczur) wtórny</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td>używać w 1:500</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne - #5</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne - #55</td><td>Dumont</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie preparacyjne</td><td>Corning</td><td>722085</td><td></td></tr><tr><td>Suche chusteczki</td><td>Kimbery Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Pierwszorzędowe przeciwciało anty-Bgal kozie</td> zastosowanie <td>biogenezy</td><td></td><td>w 1:1000</td></tr><tr><td>Pierwszorzędowe przeciwciało anty-Bsh świnki morskiej</td><td>Prezent od Claude'a Desplana</td><td></td><td>zastosowanie w 1:500</td></tr><tr><td>Pierwszorzędowe przeciwciało anty-Vsx1 świnki morskiej</td><td>Erclik i in. 2008</td><td></td><td>zastosowanie w 1:1000</td></tr><tr><td>Folia laboratoryjna</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Probówki</td> <td>do mikrowirówekSarstedt</td><td>72.706.600</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>CA4823-180</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało pierwotne anty-dac</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank (DSHB)</td> <td>mabdac2-3</td><td>zastosowanie w 1:20</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty-eya</td><td>DSHB</td><td>eya10H6</td><td>użycie w 1:20</td></tr><tr><td>Mysz przeciwciało pierwszorzędowe anty-nc82</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td>użycie w 1:50</td></tr><tr><td>Mysz przeciwciało pierwszorzędowe anty-SVP</td><td>DSHB</td><td>Stosowanie siedmiokrotnego 2D3</td><td>w stosunku 1:100</td></tr><tr><td>Glina polimerowa</td><td>Można użyć</td><td></td><td></td>dowolnego rodzaju gliny</tr><tr><td>Królik anty-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A-11122</td><td>stosować w stosunku 1:1000</td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciało pierwszorzędowe anty-DE-Kadheryna</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td>stosować w 1:20</td></tr><tr><td>Medium montażowe Slowfade</td><td>Invitrogen</td><td>S36967</td><td>Można również użyć podłoża montażowego Vectashield (cat# H-1000)</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td></td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

Płat wzrokowy Drosophila, składający się z czterech neuropils: blaszki, rdzenia, zrazika i płytki zrazikowej, jest doskonałym systemem modelowym do badania mechanizmów rozwojowych, które generują różnorodność neuronów i napędzają tworzenie obwodów. Biorąc pod uwagę jego złożoną trójwymiarową organizację, analiza płata wzrokowego wymaga zrozumienia, w jaki sposób jego dorosłe neuropils i larwalne przodki są ustawione względem siebie i centralnego mózgu. W tym miejscu opisujemy protokół preparacji, barwienia immunologicznego i montowania mózgów larw i dorosłych do obrazowania płata nerwu wzrokowego. Szczególny nacisk położono na zależność między orientacją montażu a organizacją przestrzenną płata optycznego. Opisujemy trzy strategie montażu u larwy (przednia, tylna i boczna) oraz trzy u dorosłego (przednia, tylna i pozioma), z których każda zapewnia idealny kąt obrazowania dla odrębnej struktury płata wzrokowego.

Obrazy konfokalne płatów optycznych larw i osobników dorosłych, zamontowanych w orientacjach opisanych w protokole, przedstawiono na Rysunku 1 i Rysunku 2.
Rycina 1 przedstawia schematy i reprezentatywne przekroje konfokalne mózgów larwalnych ustawionych w orientacji przedniej, tylnej i bocznej. W orientacji montażu przedniego nabłonek OPC (DE-Cadherin), neuroblasty meduły (beznamiętny&gt;βgal) o...

Ten protokół opisuje trzy kroki przygotowania płatów wzrokowych larw i dorosłych Drosophila do obrazowania: 1) preparacje mózgu, 2) immunohistochemia i 3) montaż. Nacisk położono na krok 3, ponieważ do wizualizacji określonych struktur płatów optycznych wymagane są różne orientacje montażowe.

Rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Opisujemy protokół preparacji, barwienia immunologicznego i montowania mózgów larw i dorosłych Drosophila, ze szczególnym naciskiem na płaty wzrokowe. Biorąc pod uwagę złożoną trójwymiarową organizację płata wzrokowego, oczekuje się, że opisany tutaj protokół zapewni naukowcom lepsze zrozumienie związku między orientacją montażu a wizualizowanymi strukturami płata wzrokowego. Protokół ten opisuje trzy strategie montażu zarówno dla larw, jak i dorosłych płatów wzrokowych, z których każda zapewnia optymalny kąt do wizualizacji określonej struktury płata wzrokowego podczas obrazowania.Przed rozpoczęciem sekcji napełnij wszystkie studzienki płytki trzydołkowej 400 mikrolitrami PBS na studzienkę i za pomocą kleszczy delikatnie wybierz 15 wędrujących larw trzeciego stadium rozwojowego pełzających po wnętrzu fiolki lub butelki z suszykiem. Umieść wszystkie larwy w pierwszym dołku płytki z trzema dołkami i przenieś jedną larwę do środkowej studzienki płytki. Używając ręki niedominującej, przytrzymuj ciało larwy u podstawy studni i użyj ręki dominującej, aby delikatnie chwycić haczyk do ust larwy.Odciągnij haczyk do ust od ciała, aby usunąć mózg. Następnie usuń tkanki dodatkowe, w tym wyima

dissection-immunohistochemistry-mounting-larval-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Siatkówka Drosophila stanowi krystaliczną sieć złożoną z niewielkiej liczby typów komórek, które są generowane w sposób stereotypowy 1. Jej podatność na zaawansowane analizy genetyczne umożliwia badanie złożonych programów rozwojowych. Niniejszy protokół opisuje preparowanie oraz immunohistochemię siatkówek na trzech odrębnych etapach rozwoju, ze szczególnym uwzględnieniem różnicowania fotoreceptorów.

Disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych Drosophila

Ten film opisuje metodę montażu nienaruszonych mózgów dorosłych much pod zjeżdżalnią mostkową i pokazuje protokół wykonywany na immunologicznie barwionych mózgach do mikroskopii fluorescencyjnej.

Montowanie mózgów dorosłych Drosophila: metoda przygotowania szkiełek do obrazowania konfokalnego

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Mózg dorosłego Drosophila jest cennym systemem do badania obwodów neuronalnych, wyższych funkcji mózgu i złożonych zaburzeń. Skuteczna metoda wycinania całej tkanki mózgowej z małej głowy muchy ułatwi badania oparte na mózgu. Tutaj opisujemy prosty, jednoetapowy protokół preparacji dorosłych mózgów o dobrze zachowanej morfologii.

Prosty, jednoetapowy protokół preparacyjny do przygotowania mózgów dorosłych osobników Drosophila

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

To badanie przedstawia uproszczony protokół przetwarzania tkanek obejmujący dekapitację, fiksację, kriosekcję, barwienie fluorescencyjne, barwienie immunologiczne i obrazowanie, który może być rozszerzony na obrazowanie konfokalne i wielofotonowe. Metoda zachowuje skuteczność porównywalną ze skomplikowanymi sekcjami, omijając potrzebę zaawansowanych umiejętności motorycznych. Ilościowa analiza obrazu daje szeroki potencjał badawczy.

Bezpośrednia kriosekcja głów Drosophila w celu wzmocnienia barwienia fluorescencyjnego mózgu i barwienia immunologicznego

Poznaj metodę rozwarstwienia, immunohistochemii i montażu mózgów larwalnych i dorosłych Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego. Trzy strategie montażu umożliwiają optymalne obrazowanie struktur nerwowych.

Rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego

Przeglądaj więcej filmów