Name: Pomiar obrzęku mózgu po udarze, strefy zawału i uszkodzenia bariery krew-mózg w jednym zestawie próbek mózgu gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną technikę okluzji tętnicy środkowej mózgu do pomiaru strefy zawału, obrzęku i przepuszczalności bariery krew-mózg w jednej próbce mózgu gryzoni. Ta metoda zwiększa efektywność etyczną i ekonomiczną badań udaru niedokrwiennego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Marynie Kuscheriawie, Maksymowi Krywonosovowi, Darynie Yakumenko i Evgenii Goncharyk z Wydziału Fizjologii Wydziału Biologii, Ekologii i Medycyny im. Olesa Honczara, Uniwersytetu Dniepr, Dniepr, Ukraina za ich wsparcie i pomocny wkład w nasze dyskusje. Uzyskane dane są częścią pracy doktorskiej Rusłana Kutsa.

Poniższe procedury zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Deklaracji Helsińskiej i Tokijskiej oraz Wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych Wspólnoty Europejskiej. Eksperymenty zostały również zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Ben-Guriona w Negev.
1. Przygotowanie szczurów do procedury eksperymentalnej
<ol>
	<li>Wybrać dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley bez widocznych patologii, o masie ciała od 300 do 350 g każdy.</li>
	<li>Utrzymywać wszystkie szczury w temperaturze pokojowej 22 °C, przy 12-godzinnym cyklu światła i ciemności przed eksperymentem.</li>
	<li>Zapewnić swobodny dostęp do pożywienia i wody (ad libitum).</li>
	<li>Wszystkie procedury przeprowadzać między godziną 6:00 a 14:00.</li>
</ol>
2. Przygotowanie szczurów do operacji
<ol>
	<li>Zanurz szczury w znieczuleniu przez 30 min za pomocą izofluranu (4% do indukcji i 2% do podtrzymania) oraz 24% tlenu (1,5 L/min).
	<ol>
		<li>Sprawdź poziom znieczulenia u szczurów, upewniając się, że nie wykazują one odruchu wycofania łapy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadź cewnik 24G do żyły ogonowej. 
	UWAGA: Nie stosuje się ogrzewania ogona w celu rozszerzenia naczyń krwionośnych.
	<ol>
		<li>Umieść szczury na stole w pozycji grzbietnej. Użyj taśmy medycznej, aby przymocować wszystkie cztery kończyny szczura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed operacją umieść sondę do pomiaru temperatury w odbytnicy szczura.</li>
	<li>W trakcie procedury stosuj płytę grzewczą, aby utrzymać temperaturę wewnętrzną ciała na poziomie 37 °C.</li>
	<li>W celu ochrony nanieś maść do obu oczu szczura.</li>
	<li>Wygole miejsce operacyjne i zdezynfekuj je, nakładając trzykrotnie 10% powidonu jodowego, a następnie 70% alkoholu izopropylowego.</li>
</ol>
3. Zamknięcie prawej tętnicy środkowej mózgu
UWAGA: MCAO wykonuje się zmodyfikowaną techniką, opisaną wcześniej16,22,23, przy użyciu instrumentów opisanych przez McGarry et al.24 oraz Uluç et al.25.
<ol>
	<li>Za pomocą pęsety chirurgicznej i nożyczek z zakrzywionymi ostrzami przeprowadźy rozcięcie skóry i powięzi powierzchownej w linii środkowej brzusznej szyi.</li>
	<li>Zidentyfikuj trójkąt mięśniowy, składający się z ICA, tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) i tętnicy szyjnej wspólnej (CCA).</li>
	<li>Ostrożnie oddziel prawą CCA i ICA od nerwu błędnego, używając mikropęsety do chirurgii naczyniowej.</li>
	<li>Odsłoń prawą CCA oraz ICA. Zablokuj przepływ krwi z CCA do ICA, używając mikroklipsów lub specjalnych staz do chirurgii naczyniowej. Wykonaj nacięcie (około 1 mm) na ICA za pomocą mikronożyczek do chirurgii naczyniowej.</li>
	<li>Wprowadź cewnik monofilamentowy (nylon 4-0) bezpośrednio przez ICA, około 18,5-19 mm od punktu rozgałęzienia prawej CCA do kręgu Willisa, aż do napotkania lekkiego oporu, aby zamknąć MCA26.</li>
	<li>Podwiąż ICA powyżej rozgałęzienia CCA.</li>
	<li>W przypadku grupy kontrolnej (sham), zamiast kroków 3.5 i 3.6, wykonaj wprowadzenie nici nylonowej16,22.</li>
	<li>Podaj 5 mL 0,9% chlorku sodu poprzez iniekcję doszpikową.</li>
	<li>Zamknij ranę szwem i przenieś szczura do strefy wybudzania. 
	UWAGA: Kilka minut po zakończeniu znieczulenia szczur obudzi się i będzie poruszać się samodzielnie po klatce.</li>
	<li>W 23 h po MCAO, wstrzyknij 2% błękitu Evansa w soli fizjologicznej (4 mL/kg)23,26 do żyły ogonowej obu grup operowanych za pomocą kaniuli27. 
	UWAGA: Substancja ta służy jako znacznik przepuszczalności bariery krew-mózg. Pozostaw do krążenia przez 60 minut.</li>
</ol>
4. Wyznaczenie strefy zawału
<ol>
	<li>Zmierz IZ w 24 h po MCAO zgodnie z wcześniejszym opisem9,15,18,19,26. 
	UWAGA: Szczury, które straciły więcej niż 20% masy ciała lub u których wystąpiły drgawki bądź hemiplegia, są wykluczane z eksperymentu.</li>
	<li>Uśmierć szczura, zastępując mieszaninę gazów wdychanych 20% tlenem i 80% dwutlenkiem węgla, aż do momentu ustania spontanicznego oddechu.</li>
	<li>Otwórz klatkę piersiową, wykonując cięcie boczne o długości 5-6 cm przez ścianę brzucha pod klatką piersiową za pomocą nożyczek i kleszczyków chirurgicznych.</li>
	<li>Wykonaj cięcie przepony wzdłuż całej długości klatki piersiowej za pomocą nożyczek i kleszczyków chirurgicznych.</li>
	<li>Ostrożnie odsuwając płuca, przetnij klatkę piersiową aż do obojczyka po stronie prawej i lewej28.</li>
	<li>Przeprowadź perfuzję 200 mL soli fizjologicznej przez lewą komorę serca.</li>
	<li>Nakłuj lub nacinaj prawy przedsionek serca nożyczkami.</li>
	<li>Wykonaj dekapitację za pomocą gilotyny i pobierz tkankę mózgową.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek irydologicznych przetnij od otworu wielkiego do dystalnej krawędzi tylnej powierzchni czaszki po obu stronach.</li>
	<li>Oddziel od mózgu cebulki węchowe oraz połączenia nerwowe wzdłuż brzusznej i grzbietowej powierzchni czaszki.</li>
	<li>Wyjmij mózg z głowy.</li>
	<li>Przygotuj 6 plastrów mózgu, wykonując poziome przekroje o grubości 2 mm za pomocą niepowlekanej, jednostronnie ostrzonej żyletki ze stali nierdzewnej o grubości .009".</li>
	<li>Inkubuj przez 30 min w temperaturze 37 °C w 0,05% TTC.</li>
	<li>Umieść tkankę mózgową na szkiełkach mikroskopowych i wykonaj skanowanie optyczne tych 6 plastrów mózgu z rozdzielczością 1600x1600 dpi (przykład znajduje się w Suplemencie 1).</li>
	<li>Dodaj filtr niebieski w edytorze zdjęć (np. Adobe Photoshop CS2) korzystając z funkcji Mikser kanałów (Obraz &gt; Regulacje &gt; Mikser kanałów) i zapisz obraz w formacie JPEG. 
	UWAGA: Po zastosowaniu filtra niebieskiego obraz będzie widoczny w skali szarości.</li>
	<li>Otwórz zapisany obraz w programie ImageJ 1.37v29,30. 
	UWAGA: Program komputerowy ten wykorzystuje funkcję progu (threshold) do izolacji i obliczenia pikseli, które są albo czarne, albo białe (patrz Rysunek 1).</li>
	<li>Dla każdego z 6 plastrów mózgu na obrazie zaznacz i zapisz każdą półkulę (prawą uszkodzoną ipsilateralną i lewą nieuszkodzoną kontralateralną) jako osobny plik obrazu, korzystając z narzędzia „polygon selection” z menu głównego.</li>
	<li>Ustaw wartość odcięcia dla wyznaczenia IZ, korzystając z funkcji auto threshold z menu głównego oprogramowania ImageJ poprzez wybranie Image &gt; Adjust &gt; Threshold, a następnie zmierz liczbę pikseli w każdej półkuli jednego zestawu mózgów. 
	UWAGA: W tym kroku w oprogramowaniu ImageJ można zastosować makra (kod znajduje się w Suplemencie 2). Wartość odcięcia jest krytycznym parametrem określającym, które piksele zostaną zamienione na białe, a które na czarne w zależności od odcienia szarości (przykłady znajdują się w Suplemencie 3 i Suplemencie 4). Następnie ImageJ porównuje piksele białe i czarne, aby wyznaczyć IZ. W oparciu o protokół barwienia i ustawienia skanera zastosowaliśmy stałą wartość odcięcia 0,220.</li>
	<li>Wykonaj pomiar IZ z korektą o obrzęk tkanki, stosując metodę Ratios of Ipsilateral and Contralateral Cerebral Hemispheres (RICH)13,23 (przykład znajduje się w Suplemencie 5). 
	<img alt="Równanie skorygowanej wielkości zawału; formuła w badaniu neurologicznym; stosunek wielkości półkul." src="/files/ftp_upload/61309/61309equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	UWAGA: Wielkość zawału jest oceniana jako procent półkuli kontralateralnej.</li>
</ol>
5. Oznaczenie obrzęku mózgu31
UWAGA: Do pomiaru BE32,33 należy użyć programu ImageJ 1.37v.
<ol>
	<li>Zmierz BE 24 h po MCAO. Do obliczenia BE wykorzystaj dane dotyczące objętości lewej i prawej półkuli (w jednostkach).</li>
	<li>Wykonaj skanowanie optyczne z rozdzielczością 1600x1600 dpi (przykład znajduje się w Suplemencie 1).</li>
	<li>Wybierz półkule mózgu i ustaw próg wyznaczania BE w programie ImageJ 1.37v, zgodnie z opisem w sekcjach 4.17-4.19 powyżej.</li>
	<li>Wyraź powierzchnię BE jako procent standardowych powierzchni nieobjętej zmianami półkuli przeciwległej, obliczony metodą RICH przy użyciu następującego równania (przykład w Suplemencie 5)23,34. 
	<img alt="wzór na zakres obrzęku mózgu, stosunek objętości półkul mózgu, wyrażenie matematyczne" src="/files/ftp_upload/61309/61309equ02v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
	UWAGA: Zakres BE jest oceniany jako procent półkuli przeciwległej.</li>
</ol>
6. Określenie stopnia przerwania BHE
<ol>
	<li>Oceń stopień uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB) 24 h po MCAO.</li>
	<li>Podziel prawą i lewą półkulę na sześć plastrów i umieść każdy z nich w probówce do mikrocentryfugi.</li>
	<li>Zhomogenizuj każdy plaster tkanki mózgowej w kwasie trichloroctowym, przyjmując proporcję 1 g tkanki mózgowej na 4 mL 50% kwasu trichloroctowego.</li>
	<li>Wiruj przy 10,000 x g przez 20 min.</li>
	<li>Rozcieńcz nadsącz w stosunku 1:3 za pomocą 96% etanolu.</li>
	<li>Wykonaj spektrofotometrię luminescencyjną, korzystając z oprogramowania spektrofotometrycznego: zainstaluj płytkę i dokonaj odczytu próbek przy użyciu następujących parametrów: długość fali wzbudzenia fluorescencji 620 nm (szerokość pasma 10 nm) i długość fali emisji 680 nm (szerokość pasma 10 nm)23,35 ; Mod top; Number Flesh 25; Manual 100; Shaking 1 sec, 1 mm. 
	UWAGA: Należy zastosować długość fali wzbudzenia 620 nm (szerokość pasma 10 nm) oraz długość fali emisji 680 nm (szerokość pasma 10 nm).23,35</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Głównym celem niniejszego protokołu było wykazanie spójnych pomiarów trzech głównych parametrów uszkodzenia niedokrwiennego: przepuszczalności IZ, BE i BBB. Dotychczasowe badania w tej dziedzinie wykazały możliwość wykonania jednego lub dwóch z tych parametrów razem w tej samej próbie. Oprócz redukcji kosztów, jaką oferuje ta trzyczęściowa metoda, zapewnia ona również bardziej pożądany model bioetyczny, który ogranicza liczbę zwierząt, które muszą być operowane, a następnie poddawane eutanazji. Podobnie jak we wszystkich...

Jedną z najczęstszych przyczyn zachorowalności i śmiertelności na świecie jest udar mózgu. Na całym świecie udar niedokrwienny stanowi 68% wszystkich przypadków udaru, podczas gdy w Stanach Zjednoczonych udar niedokrwienny stanowi 87% przypadków udaru1,2. Szacuje się, że obciążenie ekonomiczne związane z udarem sięga 34 miliardów dolarów w Stanach Zjednoczonych2 i 45 miliardów euro w Unii Europejskiej3. Zwierzęce modele udaru mózgu są niezbędne do badania jego patofizjologii, opracowywania nowych metod oceny i proponowania nowych opcji terapeutycznych4.
Udar niedokrwienny występuje z niedrożnością głównej tętnicy mózgowej, zazwyczaj środkowej tętnicy mózgowej lub jednej z jej odgałęzień5. Tak więc modele udaru niedokrwiennego historycznie obejmowały niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Po MCAO, uraz neurologiczny jest najczęściej oceniany przez pomiar strefy zawału (IZ) przy użyciu metody barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC)13, obrzęk mózgu (BE) przy użyciu suszenia lub obliczania objętości półkuli14,15,16, oraz przepuszczalność bariery krew-mózg (BBB) za pomocą techniki spektrometrii z użyciem barwienia na niebiesko Evansa17,18,19.
Tradycyjna metoda MCAO wykorzystuje osobne zestawy mózgów dla każdego z trzech pomiarów mózgu. W przypadku dużej wielkości próby skutkuje to znaczną liczbą zwierząt poddanych eutanazji, z dodatkowymi względami etycznymi i finansowymi. Alternatywna metoda zmniejszenia tych kosztów polegałaby na pomiarach wszystkich trzech parametrów w jednym zestawie mózgów gryzoni po MCAO.
Poprzednie próby zmierzenia kombinacji parametrów w tej samej próbce mózgu. Równoczesne metody barwienia immunofluorescencyjnego20 oraz inne analizy molekularne i biochemiczne21 zostały opisane po barwieniu TTC w tej samej próbce mózgu. Wcześniej obliczyliśmy objętość półkul mózgowych, aby ocenić obrzęk mózgu i przeprowadziliśmy barwienie TTC, aby obliczyć strefę zawału w tym samym mózgu15.
W obecnym protokole prezentujemy zmodyfikowaną technikę MCAO, która mierzy niedokrwienne uszkodzenie mózgu poprzez określenie przepuszczalności IZ, BE i BBB w tym samym zestawie mózgów gryzoni. IZ mierzy się za pomocą barwienia TTC, BE określa się, obliczając objętość półkuli, a przepuszczalność BBB uzyskuje się metodami spektrometrycznymi19. W tym protokole zastosowaliśmy zmodyfikowany model MCAO, oparty na bezpośrednim wprowadzeniu i unieruchomieniu cewnika monofilamentowego do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) oraz dalszym blokowaniu przepływu krwi do tętnicy środkowej mózgu (MCA)22. Ta zmodyfikowana metoda wykazuje zmniejszony wskaźnik śmiertelności i zachorowalności w porównaniu z tradycyjną metodą MCAO16,22.
To nowe podejście zapewnia finansowo solidny i etyczny model pomiaru uszkodzeń neurologicznych po MCAO. Taka ocena głównych parametrów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu pomoże w kompleksowym zbadaniu jego patofizjologii.

<table><tbody><tr><td>2 ml Strzykawka</td><td>Braun</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>2% chlorheksydyna w 70% roztworze alkoholu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>500 cc</td><td>Zapewnia ogólną antyseptykę skóry w polu operacyjnym</td></tr><tr><td>Igła 27 G ze strzykawką</td><td>Braun</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Nici jedwabne</td><td>Henry Schein</td><td>1007842</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Szew nylonowy</td><td>4-00</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mózg & Matryce tkankowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15013</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula Venflon 22 G</td><td>KD-FIX</td><td></td><td></td></tr> 183603985447 <tr><td>Wirówka Sigma 2-16P</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma 2-16P</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowe wagi analityczne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HR-AZ/HR-A</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa waga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Rs 4,000</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td> <td>preparacyjnePipeta Sigma-Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Rurka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Probówka Eppendorf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030119460</td><td></td></tr><tr><td>Detektor fluorescencji</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf Szwajcaria</td><td>Model: Czytnik wielomodowy Infinite 200 PRO</td><td>Opcjonalnie.</td></tr><tr><td>Detektor fluorescencyjny</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>VWR kat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Instrument bazowy</td><td>Opcjonalnie.</td></tr><tr><td>Gąbki z gazy</td><td>Fisher</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>Grzałka z termometrem</td><td>Heatpad-1</td><td>Model: HEATPAD-1/2</td><td></td></tr><tr><td>Mikroklipsy hemostatyczne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horizon-XL</td><td>Mennen Medical Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mankiet infuzyjny</td><td>ABN</td><td>IC-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokleszcze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiset</td><td>Teva Medical</td><td>998702</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus BX 40</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze operacyjne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaner optyczny</td><td>Canon</td><td>Cano Scan 4200F</td><td>Rozdzielczość 3200 x 6400 dpi</td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>Purina Chow</td><td>Purina</td><td>5001</td><td>Karma laboratoryjna dla gryzoni podawana szczurom, myszom i chomikom to żywienie cyklu życia, które jest stosowane w badaniach biomedycznych od ponad 5 dekad. Podawany szczurom ad libitum w tym doświadczeniu.</td></tr><tr><td>Klatki dla szczurów</td><td>Techniplast</td><td>2000P</td><td>Konwencjonalne pomieszczenie dla gryzoni. Przez cały czas trwania eksperymentu do trzymania szczurów używano klatek</td></tr><tr><td>Ostrza skalpela #11</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS2 dla Windows</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.37v</td><td>NIH</td><td></td><td>Kod źródłowy jest ogólnodostępny. Autor, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), pracuje w Oddziale Usług Badawczych, Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego, Bethesda, Maryland, USA</td></tr><tr><td>SPSS Statistics 22</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Office 365 ProPlus</td><td></td> <td>Microsoft-Microsoft</td> <td>Office Excel</td></tr><tr><td>Windows 10</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>298-96-4</td><td></td></tr><tr><td>50% kwas trichlorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96 %</td><td>Romical</td><td></td><td>Ciecz łatwopalna</td></tr><tr><td>Evans niebieska 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>314-13-6</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran, USP 100%</td><td>Piramamal Critical Care, Inc</td><td>NDC 66794-017</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar obrzęku mózgu po udarze, strefy zawału i uszkodzenia bariery krew-mózg w jednym zestawie próbek mózgu gryzoni

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Jedną z najczęstszych przyczyn zachorowalności i śmiertelności na całym świecie jest udar niedokrwienny. Historycznie rzecz biorąc, model zwierzęcy stosowany do stymulacji udaru niedokrwiennego obejmuje niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCAO). Strefa zawału, obrzęk mózgu i rozpad bariery krew-mózg (BBB) są mierzone jako parametry, które odzwierciedlają zakres uszkodzenia mózgu po MCAO. Istotnym ograniczeniem tej metody jest to, że pomiary te są zwykle uzyskiwane w różnych próbkach mózgu szczurów, co prowadzi do obciążeń etycznych i finansowych ze względu na dużą liczbę szczurów, które muszą zostać poddane eutanazji w celu uzyskania odpowiedniej wielkości próby. W tym miejscu przedstawiamy metodę dokładnej oceny uszkodzenia mózgu po MCAO poprzez pomiar strefy zawału, obrzęku mózgu i przepuszczalności BBB w tym samym zestawie mózgów szczurów. Ta nowatorska technika zapewnia bardziej efektywny sposób oceny patofizjologii udaru.

Pomiar strefy zawału
Test t dla prób niezależnych wykazał, że u 19 szczurów, którym przeprowadzono trwałe MCAO, odnotowano istotny wzrost objętości zawału mózgu w porównaniu z 16 szczurami z grupy operacji pozorowanej (MCAO=7.49% ± 3.57 vs. Sham = 0.31% ± 1.9, t(28.49) = 7.56, p &lt; 0.01 (patrz Rysunek 2A)). Dane przedstawiono jako średni procent objętości przeciwległej półkuli ± SD.
Pomiar ob...

Ten protokół opisuje nowatorską technikę pomiaru trzech najważniejszych parametrów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu na tym samym zestawie próbek mózgu gryzoni. Wykorzystanie tylko jednej próbki mózgu jest bardzo korzystne pod względem kosztów etycznych i ekonomicznych.

Pomiar obrzęku mózgu po udarze, strefy zawału i uszkodzenia bariery krew-mózg w jednym zestawie próbek mózgu gryzoni

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

W niniejszym protokole przedstawiamy zmodyfikowaną technikę niedrożności tętnicy środkowej mózgu, która mierzy niedokrwienne uszkodzenie mózgu w celu określenia strefy zawału, obrzęku mózgu i przepuszczalności BBB w tym samym zestawie mózgów gryzoni. Pod względem kosztów etycznych i ekonomicznych główną zaletą tej techniki jest to, że do wszystkich trzech pomiarów wymagana jest tylko jedna próbka mózgu. Taka ocena głównych parametrów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu pomoże w kompleksowym zbadaniu patofizjologii udaru niedokrwiennego mózgu.Aby rozpocząć, usuń mózg szczura i wytnij poziome odcinki o grubości 2 milimetrów za pomocą niepowlekanej, jednokrawędziowej żyletki ze stali nierdzewnej o grubości 0,009 cala. Umieść skrawki w 0,005% TTC i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie umieść tkankę mózgową na szkiełkach mikroskopowych i wykonaj skanowanie optyczne sześciu wycinków mózgu w rozdzielczości 1600 x 1600 DPI. Użyj edytora zdjęć, aby dodać niebieski filtr do obrazów.Po otwarciu oprogramowania przejdź do obrazu, regulacji i miksera kanałów. Wybierz niebieski jako kanał wyjściowy i zaznacz opcję monochromatyczny, a następnie kliknij OK. Zapisz obraz w formacie pliku JPEG.Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów w ImageJ w wersji 1.37, aby zaznaczyć każdą półkulę każdego z sześciu wycinków mózgu i zapisać ją jako osobny plik obrazu. Aby obliczyć objętość zawału i obrzęk mózgu, użyj makra, aby przekonwertować piksele na obrazie na biały lub na podstawie progu. Następnie zamknij wszystkie pliki i użyj drugiego makra, aby porównać liczbę białych i czarnych pikseli, aby określić objętość zawału i obrzęk mózgu.Skopiuj nieprzetworzone dane do arkusza kalkulacyjnego. Obliczając objętość zawału, skoryguj obrzęk tkanek, używając proporcji ipsilateralnych i przeciwległych półkul mózgowych. Wyraź obszary obrzęku mózgu jako procent standardowych obszarów niedotkniętej półkuli przeciwległej.Określ przerwanie bariery krew-mózg 24 godziny po okluzji. Podziel prawą i lewą półkulę na sześć plasterków i włóż każdy plasterek do probówki do mikrowirówki. Homogenizuj każdy plasterek tkanki mózgowej w kwasie trójchlorooctowym, używając 4 mililitrów 50% kwasu trichlorooctowego na gram tkanki mózgowej.Odwirować próbki w temperaturze 10 000 razy G przez 20 minut, a następnie przenieść supernatant do świeżej probówki i rozcieńczyć go w stosunku 1:3 96% etanolem. Wykonać spektrofotometrię luminescencyjną za pomocą czytnika płytek. Test t przeprowadzony na niezależnej próbie wykazał, że 19 szczurów, które przeszły trwałą niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCAO), wykazało znaczny wzrost objętości zawału mózgu w porównaniu z 16 szczurami operowanymi pozorowanymi.Szczury, które przeszły stałe MCAO, wykazały również znaczny wzrost zakresu obrzęku mózgu i złamania bariery krew-mózg po 24 godzinach, w porównaniu ze zwierzętami operowanymi pozorowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że stężenie chemiczne jest zgodne z protokołem. Protokół ten umożliwia ocenę wszystkich trzech parametrów uszkodzenia niedokrwiennego w jednej próbce mózgu.

measuring-post-stroke-cerebral-edema-infarct-zone-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film pokazuje ocenę strefy zawału i obrzęku mózgu w wycinkach mózgu szczurów poddanych niedrożności tętnicy środkowej mózgu. Obszary po zawale są identyfikowane za pomocą barwienia redoks, podczas gdy niebieski filtr i funkcja progowa w oprogramowaniu do analizy obrazu określają ilościowo strefę zawału i obrzęk w dotkniętej półkuli.

Pomiar strefy zawału i obrzęku mózgu w mózgu szczura po niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Źródło: Zeynalov, E. et al., Ciągły wlew dożylny jest wybraną drogą leczenia blokera receptora argininy-wazopresyny koniwaptanu u myszy w celu zbadania obrzęku mózgu wywołanego udarem. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje dożylne podawanie antagonisty receptora argininy-wazopresyny (AVP) w modelu mysim. Przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu wywołuje obrzęk mózgu. Antagonista receptora AVP jest podawany przez cewnik w lewej żyle szyjnej, łagodząc obrzęk.

Dożylne podawanie blokerów receptorów w celu zmniejszenia obrzęku mózgu w modelu mysim

Wykazano, że monitorowanie perfuzji mózgowej poprawia dokładność modeli udaru niedokrwiennego. Trudności techniczne często ograniczają wykorzystanie tego niezbędnego narzędzia do badań naczyń mózgowych. W tym filmie pokazano zoptymalizowany system do uzyskania jedno- lub wielomiejscowego monitorowania hemodynamicznego podczas śródświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczurów.

Zoptymalizowany system do monitorowania perfuzji mózgowej w modelu udaru szczura wewnątrzświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Charakterystyka komórek szpikowych mózgu po udarze może być przeprowadzona za pomocą metody frakcjonowania optycznego lub za pomocą analizy cytometrycznej zawiesin leukocytów mózgu. Obie są użytecznymi technikami do przeprowadzenia dokładnego fenotypowego rozróżnienia głównych podzbiorów komórek szpikowych znajdujących się w niedokrwionym mózgu.

Charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu

Ten protokół opisuje powtarzające się wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, czyli krótkie ekspozycje na niedotlenienie ogólnoustrojowe, które zmniejszają objętość zawału i zaburzenie bariery krew-mózg po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy. Szczegółowo opisano również podwójną kwantyfikację objętości zawału i przerwania bariery krew-mózg po udarze, aby ocenić skuteczność ochrony nerwowo-naczyniowej.

Kwantyfikacja ochrony nerwowo-naczyniowej po powtarzającym się kondycjonowaniu wstępnym hipoksyjnym i przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy

Opisujemy mysi model udaru wywołanego przez zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej za pomocą szwu pokrytego silikonem. Protokół może być stosowany w celu wywołania trwałej okluzji lub tymczasowego niedokrwienia, a następnie reperfuzji.

Indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie wysoce powtarzalnej techniki oceny in vivo naruszenia bariery krew-mózg w szczurzych modelach udaru niedokrwiennego.

Ocena in vivo przerwania bariery krew-mózg w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Tutaj prezentujemy protokół wywoływania depresji poudarowej u szczurów poprzez zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej przez tętnicę szyjną wewnętrzną. Używamy testu wymuszonego pływania Porsolt i testu preferencji sacharozy, aby potwierdzić i ocenić indukowane nastroje depresyjne.

Technika niedrożności tętnicy środkowej mózgu do wywoływania depresji poudarowej u szczurów

Celem tego badania jest stworzenie i walidacja modelu zwierzęcego do badań w fazach odzyskiwania i następstwa niedokrwienia mózgu poprzez testowanie zawału mózgu i funkcji sensomotorycznych po okluzji/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R) po 1-90 dniach u szczurów.

Model przedkliniczny do oceny regeneracji mózgu po ostrym udarze mózgu u szczurów

Przedstawiony tutaj protokół pokazuje technikę tworzenia modelu uszkodzenia mózgu u gryzoni. Opisana tutaj metoda wykorzystuje promieniowanie laserowe i celuje w korę ruchową.

Laserowe uszkodzenie mózgu w korze ruchowej szczurów

Poznaj zmodyfikowaną technikę okluzji tętnicy środkowej mózgu do pomiaru strefy zawału, obrzęku i przepuszczalności bariery krew-mózg w jednej próbce mózgu gryzoni. Ta metoda zwiększa efektywność etyczną i ekonomiczną badań udaru niedokrwiennego.

Pomiar obrzęku mózgu po udarze, strefy zawału i uszkodzenia bariery krew-mózg w jednym zestawie próbek mózgu gryzoni

Przeglądaj więcej filmów