Name: Wytwarzanie biomimetycznej nano-matrycy z nanorurkami na bazie janusa i fibronektyną do adhezji komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania biomimetycznej nano-matrycy z nanorurkami Janusa i fibronektyną do adhezji ludzkich komórek macierzystych mezenchymalnych. Ta technika ma potencjał w inżynierii tkanek i naprawie złamań kości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana finansowo przez NIH (Granty 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) oraz University of Connecticut.

1. Synteza JBNT
UWAGA: Monomer JBNT został przygotowany zgodnie z wcześniejszymi publikacjami11.
<ol>
	<li>Synteza związku A1
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór zawierający 8,50 g kwasu 2-cyjanooctowego i 9,80 g etylokarbaminianu w 25 ml toluenu i 2,5 ml N,N-dimetyloformamidu. Dodawać kroplami 4,90 ml chlorku fosforylu. Następnie podgrzej mieszaninę do temperatury 70 °C i mieszaj przez 1,5 godziny.</li>
		<li>Schłodzić mieszaninę reakcyjną do temperatury pokojowej i wlać 100 g lodowatej wody. Ekstrahować warstwę wodną octanem etylu (3 x 250 ml) i przemyć 100 ml solanki. Wysuszyć warstwę organiczną na bezwodnym siarczanie sodu, przefiltrować i odparować substancje lotne w próżni, aby uzyskać bladożółte ciało stałe.</li>
		<li>Poddać żółte ciało stałe chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym (3% metanol/dichlorometan), aby otrzymać 15,61 g związku A1 w postaci białego proszku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza związku A2
	<ol>
		<li>Wymieszaj 3,12 g związku A1 i 2,75 g węglanu potasu w 50 ml N, N-dimetyloformamidu. Mieszać w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
		<li>Dodać 2,6 ml dwusiarczku węgla do zawiesiny reakcyjnej. Mieszaj przez 4 godziny.</li>
		<li>Dodać bezwzględny etanol do mieszaniny reakcyjnej w temperaturze 0 °C. Odfiltrować żółty osad i przemyć eterem dietylowym. Suszyć w próżni przez noc, aby uzyskać 6,18 g związku A2 w postaci bladożółtego ciała stałego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza związku A3
	<ol>
		<li>Dodaj 2,7 ml jodku metylu do 15 ml acetonitrylu. Oddzielnie przygotuj również roztwór związku A2, dodając 6,18 g A2 do 80 ml wody/acetonitrylu (w stosunku 7:3). Wymieszaj oba roztwory i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Podgrzać mieszaninę reakcyjną do temperatury 95 °C i mieszać przez 3 godziny.</li>
		<li>Schłodzić mieszaninę reakcyjną do temperatury pokojowej, a następnie odparować substancje lotne w próżni.</li>
		<li>Ekstrahować pozostałość 3x 100 ml octanu etylu i przemyć solanką. Wysuszyć warstwę organiczną na bezwodnym siarczanie sodu, przefiltrować i odparować substancje lotne w próżni, aby uzyskać żółte ciało stałe.</li>
		<li>Poddać żółte ciało stałe chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym (30% octanu etylu/heksanów) w celu uzyskania 4,52 g związku A3 w postaci jasnożółtego ciała stałego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza związku A4
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór alliloaminy, dodając 925 μl alliloaminy do 20 ml etanolu. Dodawać ten roztwór kroplami do roztworu związku A3, przygotowanego przez dodanie 3,14 g A3 w 75 ml absolutnego alkoholu etylowego, przez 30 minut. Następnie podgrzej mieszaninę reakcyjną do refluksu przez 16 godzin.</li>
		<li>Schłodzić mieszaninę reakcyjną do temperatury pokojowej i odparować substancje lotne, aby uzyskać żółte ciało stałe.</li>
		<li>Poddać żółte ciało stałe chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym (50% octanu etylu/heksanów do 2% metanolu/dichlorometanu), aby otrzymać 1,80 g związku A4 w postaci białego kryształu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza związku A5
	<ol>
		<li>Dodać 2,05 g chlorowodorku guanidyny i 7,8 ml etlenku sodu (21% wag. w etanolu) w 14 ml absolutnego alkoholu etylowego. Podgrzewać mieszaninę do temperatury 45 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Odfiltrować nierozpuszczalny materiał i dodać filtrat bezpośrednio do roztworu związku A4, przygotowanego przez dodanie 2,70 g A4 do 40 ml absolutnego alkoholu etylowego. Podgrzewać mieszaninę reakcyjną do refluksu przez 16 godzin.</li>
		<li>Odfiltrować osad, aby uzyskać 2,65 g związku A5 w postaci białawego ciała stałego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza związku A6
	<ol>
		<li>Powoli dodać 24,9 ml trietyloaminy do mieszaniny zawiesiny otrzymanej przez dodanie 2,11 g związku A5 i 1,10 g 4-dimetyloaminopirydyny w 120 ml tetrahydrofuranu przez 1 minutę. Mieszać w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
		<li>Dodać kroplami 20,7 ml diwęglanu di-tert-butylu do mieszaniny reakcyjnej i mieszać w temperaturze pokojowej przez 40 godzin.</li>
		<li>Dodaj 20 ml wody, aby wygasić reakcję. Odparować substancje lotne w próżni.</li>
		<li>Ekstrahować czerwoną lepką pozostałość za pomocą 500 ml octanu etylu. Następnie umyj go 250 ml wody, 75 ml 10% kwasu cytrynowego, 2x 200 ml wody, 200 ml nasyconego wodorowęglanu sodu i 200 ml solanki. Wysuszyć warstwę organiczną na bezwodnym siarczanie sodu, przefiltrować i odparować substancje lotne w próżni, aby uzyskać czerwono-pomarańczowe ciało stałe.</li>
		<li>Poddać ciało stałe chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym (0-20% octanu etylu/heksanów), aby otrzymać 3,87 g związku A6 w postaci białej piany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza związku A7
	<ol>
		<li>Dodać kroplami N-tlenek N-metylomitymorfoliny (50% wag. w wodzie, 1,64 ml) do roztworu związku A6 (2,93 g) w acetonie/wodzie (8:1, 58,5 ml) i mieszać w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
		<li>Dodawać kroplami tetratlenek osmu (4% roztwór wodny) do mieszaniny przez okres 3 minut i mieszać w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.</li>
		<li>Ugasić reakcję 1,0 M wodnym roztworem siarczynu sodu, aż roztwór stanie się bezbarwny. Usuń substancje lotne pod próżnią, aby uzyskać białą zawiesinę w wodzie. Ekstrahować pozostałość 350 ml dichlorometanu, a następnie przemyć 150 ml wody, a następnie przemyć 150 ml solanki.</li>
		<li>Wysuszyć warstwę organiczną na bezwodnym siarczanie sodu, przefiltrować i odparować substancje lotne w próżni, aby otrzymać 2,45 g związku A7 w postaci białego ciała stałego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza związku A8
	<ol>
		<li>Dodać 760 g periodku sodu do mieszaniny 1,36 g związku A7 w 35 ml dichlorometanu/wody (6:1, 35 ml) i mieszać w temperaturze pokojowej przez 42 godziny.</li>
		<li>Odfiltrować nierozpuszczalny materiał i zagęścić filtrat w próżni. Powstałą pozostałość ekstrahować 250 ml dichlorometanu, a następnie przemyć 100 ml wody i 100 ml solanki. Wysuszyć warstwę organiczną na bezwodnym siarczanie sodu, przefiltrować i odparować substancje lotne w próżni, aby uzyskać produkt surowy.</li>
		<li>Poddać surowy produkt chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym (5-40% octan etylu/heksany, a następnie 5% metanol/dichlorometan) w celu uzyskania 1,08 g związku A8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza związku A9
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór 830 mg związku A8 w 15 ml 1,2-dichloroetanu. Dodać roztwór kropli do mieszaniny estru trimetylosililoetylowego kwasu 6-benzyloksykarbonyloamino-2-L-amino-heksanowego (649,5 mg) i N,N-diizopropyloetyloaminy (591 μl) w 24 ml 1,2-dichloroetanu przez 3 minuty i mieszać w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Dodać 360,3 mg triacetoksyborowodorku sodu do roztworu i mieszać w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.</li>
		<li>Mieszaninę reakcyjną ugasić 6 ml wody. Ekstrahować mieszaninę reakcyjną 3x 200 ml dichlorometanu i przemyć 200 ml 10% kwasu cytrynowego w wodzie, 2x 200 ml wody, 200 ml nasyconego wodorowęglanu sodu i 200 ml solanki w tej kolejności. Wysuszyć warstwę organiczną na bezwodnym siarczanie sodu, przefiltrować i odparować substancje lotne w próżni w celu uzyskania produktu surowego.</li>
		<li>Poddać surowy produkt chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym (5-30% octanu etylu/heksanów) w celu uzyskania 885 mg związku A9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza monomeru JBNT
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,54 g związku A9 (0,54 g) w 10 ml 94% roztworu kwasu trifluorooctowego/tioanizolu i mieszać w temperaturze pokojowej przez 72 godziny.</li>
		<li>Dodać eter dietylowy (80 ml) do mieszaniny reakcyjnej i odwirować osad. Wylać klarowny kwas trifluorooctowy zawierający supernatant i przepłukać biały osad eterem dietylowym i metanolem do uzyskania 168,6 mg surowego monomeru JBNT (plik uzupełniający 1).</li>
		<li>Oczyszczać surowy monomer JBNT za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z kolumną z odwróconymi fazami. Program izolacji jest wymieniony poniżej: Rozpuszczalnik A: 100% woda; rozpuszczalnik B: 100% acetonitryl; rozpuszczalnik C: pH = 1 HCl roztwór wodny; natężenie przepływu: 3 ml/min (patrz tabela 1).</li>
		<li>Zbierz największy pik po około 7,2 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Produkcja dla JBNT/FN
<ol>
	<li>Dodać 80 μl 1 mg/ml roztworu wodnego JBNT do 40 μl 1 mg/ml roztworu wodnego FN i kilkakrotnie odpipetować.</li>
	<li>Sprawdzić, czy po pipetowaniu przez około 10 s. nie ma białej, stałej zawiesiny.
	UWAGA: Nakręcono film, aby uchwycić proces samomontażu NM (Plik uzupełniający 2).</li>
</ol>
3. Obserwacja próbek liofilizowanych
UWAGA: Ten krok jest wykonywany, aby pokazać strukturę rusztowania NM wykonaną z JBNT i FN.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów FN, JBNT i FN/JBNT NM do obserwacji materiałów liofilizowanych. Rozcieńczyć 10 μl ze 100 μg/ml FN 40 μl wody destylowanej, aby uzyskać roztwór FN o stężeniu 20 μg/mL.</li>
	<li>Przygotować 100 mg/ml roztwór JBNT, rozcieńczając 5 μl 1 mg/ml JBNT w 45 μl wody DI.</li>
	<li>Zmieszać 10 μl 100 μg/ml FN i 5 μl 1 mg/ml JBNT w 35 μl wody DI, aby uzyskać roztwór NM.</li>
	<li>Pokryj trzy dołki 96-dołkowymi przezroczystymi mikropłytkami z okrągłym dnem odpowiednio roztworem FN, JBNT i roztworem NM. Do każdej studzienki otrzymuje 50 μl roztworu.</li>
	<li>Wykonaj liofilizację, jak opisano poniżej, aby uwidocznić strukturę rusztowania NM.
	<ol>
		<li>Zamrozić płytkę w temperaturze -80 °C przez noc.</li>
		<li>Włącz liofilizowany instrument i pompę próżniową.</li>
		<li>Naciśnij przycisk schładzania, aby obniżyć temperaturę systemu do -50 °C.</li>
		<li>Włóż zamrożoną płytkę do liofilizowanego instrumentu i zamknij wszystkie otwory narzędzi.</li>
		<li>Kliknij przycisk start, aby zmniejszyć ciśnienie w układzie do 0,9 mbar.</li>
		<li>Po 4 godzinach naciśnij przycisk napowietrzania i otwórz zawór, aby zwiększyć ciśnienie w układzie do ciśnienia atmosferycznego.</li>
		<li>Wyjmij płytkę z liofilizowanego instrumentu.</li>
		<li>Użyj mikroskopu, aby obserwować FN, JBNT i powstały samoorganizujący się NM. Zrób kilka zdjęć aparatem fotograficznym do materiałów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiar widm absorpcyjnych
UWAGA: Użyj zmiany widm dla FN i JBNT, aby zaprezentować samodzielnie zmontowany JBNT/FN NM12.
<ol>
	<li>Zmieszać 30 μl 100 μg/ml FN z 15 μl wody destylowanej i 5 μl 1 mg/ml JBNT, aby przygotować roztwór JBNT/FN NM. Po kilkukrotnym odpipetowaniu roztworu można zobaczyć białą, stałą zawiesinę. 
	UWAGA: Końcowe stężenia JBNT i FN w roztworze wynoszą odpowiednio 100 μg/ml i 60 μg/ml. Jako roztwory kontrolne przygotowano również roztwory JBNT i FN o tym samym stężeniu, co zastosowane w roztworze NM.</li>
	<li>Rozcieńczyć 5 μl z 1 mg/ml JBNT 45 μl wody destylowanej w celu przygotowania roztworu kontrolnego JBNT.</li>
	<li>Rozcieńczyć 30 μl 100 μg/ml FN w 20 μl wody destylowanej w celu przygotowania roztworu kontrolnego FN.</li>
	<li>Zmierzyć widma absorpcyjne UV-vis roztworów FN, JBNT i JBNT/FN NM za pomocą spektrofotometru (patrz Tabela materiałów), aby scharakteryzować montaż NM.
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk UV-Vis. Oczyść powierzchnię testową spektrofotometru i upuść na nią 2 μl wody destylowanej. Zmierz go jako ślepą próbę od 190-850 nm.</li>
		<li>Oczyść powierzchnię testową spektrofotometru i upuść na nią 2 μl roztworu FN. Zmierzyć widma absorpcyjne UV-Vis roztworu FN od 190 nm do 850 nm.</li>
		<li>Oczyść powierzchnię testową spektrofotometru i upuść na nią 2 μl roztworu JBNT. Zmierzyć widma absorpcyjne roztworu JBNT od 190 nm do 850 nm.</li>
		<li>Oczyść powierzchnię testową spektrofotometru i upuść na nią 2 μl roztworu JBNT/FN NM. Zmierzyć widma absorpcyjne roztworu JBNT/FN NM od 190 nm do 850 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie JBNT/FN NM do transmisyjnej mikroskopii elektronicznej (TEM)
<ol>
	<li>Wyczyść kilka siatek przed barwieniem ujemnym za pomocą podstawowego środka do czyszczenia plazmowego (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wykonaj barwienie ujemne dla próbek, postępując zgodnie z dwoma różnymi procesami.
	<ol>
		<li>Upuść 3 μl z 1 mg/ml roztworu wodnego JBNT i 3 μl roztworu JBNT/FN NM na oddzielone kratki i pozostaw na 2 minuty. Następnie przepłukać każdą siatkę 100 μl 0,5% roztworu octanu uranylu (UA). Odcedź nadmiar roztworu bibułą filtracyjną i wysusz kratki na powietrzu.</li>
		<li>Zmieszać 9 μl roztworu JBNT/FN NM z 3 μl 2,0% roztworu UA i kilkakrotnie odpipetować. Odpipetować wymieszany roztwór na rusztach i trzymać go na rusztach przez 2 minuty. Użyj bibuły filtracyjnej, aby usunąć zmieszany roztwór z kratek i wysuszyć kratki w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na koniec scharakteryzować próbkę pod kątem JBNT, JBNT/FN NM wybarwioną krokiem 5.2.1 i JBNT/FN NM wybarwioną krokiem 5.2.2 za pomocą TEM.</li>
</ol>
6. Test funkcji biologicznej in vitro
<ol>
	<li>Dodać 200 μl roztworów kontroli ujemnych (NC, PBS), JBNT, FN i JBNT/FN NM odpowiednio do jednego dołka 8-dołkowego szkiełka podstawowego.</li>
	<li>Liofilizować szkło nakrywkowe z 8-dołkową komorą za pomocą liofilizowanego instrumentu, aby pokryć materiały na dnie studzienek. Protokół liofilizacji jest taki sam jak w kroku 3.5.</li>
	<li>Następnie dodać 10 000 komórek/studzienek hMSC (pasaż 3) do studzienek i inkubować je przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Po inkubacji odpipetować pożywkę do hodowli komórkowych z dołków i przepłukać kulturę 1x roztworem PBS.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu utrwalającego do każdej studzienki z komórkami i pozostawić na 5 minut. Delikatnie spłukać komórki dwukrotnie 1x PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć 1% Triton-X 100 do 0,1%. Dodać 100 μl 0,1% Triton-X 100 do każdego dołka z komórkami i pozostawić na 10 minut. Delikatnie przepłucz komórki dwukrotnie 1x PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć falloidynę rodaminy do 1,65 μM. Dodać 100 μl falloidyny rodaminy do każdej studzienki z komórkami i inkubować szkło nakrywkowe w komorze, trzymając z dala od światła w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Delikatnie przepłukać komórki dwukrotnie 1x PBS.</li>
	<li>Uchwyć obrazy komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Policz numery komórek na obrazach fluorescencyjnych dla każdej grupy. Oblicz gęstość adhezji komórek, uśredniając trzy losowe obszary w każdym dołku.</li>
	<li>Przedstaw wszystkie dane jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Wykonaj analizy statystyczne przy użyciu jednostronnego testu t, a następnie analizy wariancji (ANOVA) z p<0,05, która jest uważana za statystycznie istotną.</li>
</ol>

<ol><li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li>
<li>Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+vitronectin+and+collagen+I+promotes+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).</li>
<li>Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+convergence+of+fracture+repair+and+stem+cells%3A+interplay+of+genes%2C+aging%2C+environmental+factors+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).</li>
<li>De Becker, A., Riet, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+migration+of+mesenchymal+stromal+cells%3A+How+to+improve+the+efficacy+of+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy.</a> World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).</li>
<li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li>
<li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li>
<li>Fenniri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+Rosette+Nanotubes%3A+Design%2C+Self-Assembly%2C+and+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+rosette+nanotube%2Fhydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li>
<li>Van den Bogaerdt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+cross-linking+by+adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+and+scar-derived+mesenchymal+cells%3A+Are+mesenchymal+stromal+cells+involved+in+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).</li>
<li>Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+molecule+visualized+in+electron+microscopy%3A+a+long%2C+thin%2C+flexible+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand.</a> Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).</li>
<li>Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+Anchorage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+and+Research%22%5BJournal%5D)">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).</li>
<li>Jones, M., Leroux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles+-+a+new+generation+of+colloidal+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).</li>
<li>Singh, P., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+and+stem+cell+differentiation+-+lessons+from+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).</li>
<li>Martino, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+integrin+specificity+and+stem+cell+differentiation+in+2D+and+3D+environments+through+regulation+of+fibronectin+domain+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability.</a> Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).</li>
<li>Somaiah, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+promotes+higher+adhesion%2C+survival+and+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 10 (12), 0145068(2015).</li>
<li>Ogura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+the+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow+and+enhancement+of+cell+attachment+by+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin.</a> Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).</li>
<li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li>
<li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Material%22%5BJournal%5D)">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089(2017).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li>
</ol>

Dr Yupeng Chen jest współzałożycielem firmy NanoDe Therapeutics, Inc.

W tym badaniu opracowaliśmy samoorganizujący się biomimetyczny NM, który został utworzony z inspirowanych DNA JBNT i FN. Podczas przygotowywania roztworu JBNT, liofilizowany proszek JBNT należy rozpuścić w wodzie zamiast PBS, ponieważ PBS spowoduje aglomerację JBNT, co hamuje ich składanie. Co więcej, NM powinien być również złożony w wodzie, jeśli chcemy obserwować struktury nanofibrylne NM, ponieważ sól w PBS będzie wiązać się z włóknami NM, co może znacznie obniżyć rozdzielczość obrazów.
NM...

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) wykazały potencjał do samoodnawiania i różnicowania się wzdłuż różnych linii mezenchymalnych, co pomaga w regeneracji i utrzymaniu tkanek1. Na podstawie potencjału różnicowania, hMSC są uważane za kandydatów do leczenia mezenchymalnych uszkodzeń tkanek i zaburzeń krwiotwórczych2. hMSC wykazały zdolność do wspomagania gojenia się ran poprzez zwiększenie naprawy tkanek, angiogenezy i zmniejszenie stanu zapalnego3. Jednak bez pomocy biochemicznej lub biomateriałowej skuteczność dotarcia hMSC do tkanki docelowej i funkcjonowania w pożądanym miejscu jest niska4. Chociaż zastosowano różne rusztowania inżynieryjne, aby przyciągnąć hMSC do przylegania do zmian, niektóre miejsca, takie jak złamanie płytki wzrostowej w środku kości długiej, nie są łatwo dostępne dla konwencjonalnych prefabrykowanych rusztowań, które mogą nie pasować idealnie do urazu o nieregularnym kształcie.
Tutaj opracowaliśmy biomimetyczny nanomateriał, który może samoorganizować się in situ i być wstrzykiwany do trudno dostępnego obszaru docelowego. Wstrzykiwalne biorusztowanie NM składa się z nanorurek podstawy Janusa (JBNT) i fibronektyny (FN). JBNT, znane również jako nanorurki rozety (RNT), pochodzą z par zasad DNA, w szczególności tyminy i adeniny, tutaj5,6,7. Jak widać na rysunku Rysunek 1, nanorurki powstają, gdy sześć cząsteczek pochodnych par zasad DNA samoorganizuje się za pomocą wiązań wodorowych, tworząc płaszczyznę6. Sześć cząsteczek jest następnie układanych jedna na drugiej w płaszczyźnie za pomocą silnej interakcji pi-stacking7, która może mieć długość do 200-300 μm. JBNT są zaprojektowane tak, aby morfologicznie naśladować włókna kolagenowe, tak aby FN mógł z nimi reagować.
FN to adhezyjna glikoproteina o wysokiej masie cząsteczkowej, którą można znaleźć w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)9. Mogą one pośredniczyć w przyłączaniu się komórek macierzystych do innych składników ECM, w szczególności collagen10. Zaprojektowaliśmy JBNT tak, aby morfologicznie naśladowały włókna kolagenowe, dzięki czemu FN może z nimi reagować, tworząc NM w ciągu kilku sekund poprzez wiązanie niekowalencyjne. W związku z tym NM jest obiecującym rusztowaniem biologicznym, które można wstrzyknąć w miejsce złamania kości, które nie może być dostępne za pomocą konwencjonalnie wytwarzanych rusztowań. W tym przypadku wstrzykiwany NM wykazuje doskonałą zdolność do wzmacniania zakotwiczenia hMSC in vitro, wykazując swój potencjał do służenia jako rusztowanie do regeneracji tkanek.

<table><tbody><tr><td>1,2-dichloroetan</td><td>Alfa Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-cyjanooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-dimetyloaminopirydyna</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowa komorowa szklana nakrywka</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>absolutny</td> <td>etanolThermo Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>alliloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy środek do czyszczenia plazmy</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC32G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>skoncentrowany kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td>Thermo Fisher</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>dichlorometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>eter dietylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Diwęglan tert-butylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>octan etylu</td><td>Sigma-Aldrich 319902</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etylokarbaminian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór utrwalający (4 % formaldehydu przygotowany w PBS)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek guanidyny</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>heksany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>Human mezenchymalne komórki macierzyste</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>jodek metylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diizopropyloetyloamina</td><td>Alfa</td><td>Aesar A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-tlenek metylomorfoliny</td><td>Alfa Aesar</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>Alfa Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforu fosforanowego</td><td>Thermo Fisher</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>chlorek fosforylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>węglan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>kolumna z odwróconymi fazami</td><td>Thermo Fisher</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina Phalloidyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>żel krzemionkowy</td><td>TCI America</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>ettlenek sodu</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>periodek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>siarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>siarczyn sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>triacetoksyborowodorek sodu</td> Spektrofotometr <td>Alfa Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>(NanoDrop One/Onec UV-Vis)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek macierzystych BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>tioanizol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T28002</td><td></td></tr><tr><td>toluen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>trietyloamina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>kwas trifluorooctowy</td><td>Alfa</td><td>Aesar A12198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie biomimetycznej nano-matrycy z nanorurkami na bazie janusa i fibronektyną do adhezji komórek macierzystych

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Biomimetyczny NM został opracowany, aby służyć jako biologiczne rusztowanie inżynierii tkankowej, które może poprawić zakotwiczenie komórek macierzystych. Biomimetyczny NM powstaje z JBNT i FN poprzez samoorganizację w roztworze wodnym. JBNT mierzą długość 200-300 μm z wewnętrznymi hydrofobowymi pustymi kanałami i zewnętrznymi powierzchniami hydrofilowymi. JBNT są naładowane dodatnio, a FN są naładowane ujemnie. Dlatego po wstrzyknięciu do obojętnego roztworu wodnego są one łączone ze sobą za pomocą wiązania niekowalencyjnego, tworząc wiązki NM. Proces samomontażu odbywa się w ciągu kilku sekund bez żadnych inicjatorów chemicznych, źródła ciepła lub światła UV. Gdy pH roztworu NM jest niższe niż punkt izoelektryczny FN (pI 5,5-6,0), wiązki NM ulegną samoczynnemu uwolnieniu z powodu obecności dodatnio naładowanego FN.
NM jest znany z morfologicznego naśladowania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i dlatego może być używany jako rusztowanie do wstrzykiwań, co stanowi doskonałą platformę do zwiększenia adhezji hMSC. Analiza gęstości komórek i eksperymenty obrazowania fluorescencyjnego wykazały, że NM znacznie zwiększyły zakotwiczenie hMSC w porównaniu z kontrolą negatywną.

Nasze badania wykazały, że formowanie NM z JBNTs i FN przebiega szybko i następuje w ciągu 10 sekund. Jak pokazano na Rysunku 2, po zmieszaniu roztworu JBNT z roztworem FN i kilkukrotnym pipetowaniu uzyskano białe kłaczkowate osady. Proces tworzenia NM jest całkowicie biomimetyczny. Nie są wymagane żadne bodźce zewnętrzne. Proces wytwarzania jest znacznie prostszy niż w przypadku niektórych nowoczesnych biomateriałów, których sieciowanie opiera się na świetle ultrafioletowym lub inicjatorach...

Celem tego protokołu jest pokazanie montażu biomimetycznej nanomatrycy (NM) z nanorurkami o zasadzie Janusa (JBNT) i fibronektyną (FN). W przypadku jednoczesnej hodowli z ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi (hMSC), NM wykazują doskonałą bioaktywność w zachęcaniu do adhezji hMSC.

Wytwarzanie biomimetycznej nano-matrycy z nanorurkami na bazie janusa i fibronektyną do adhezji komórek macierzystych

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

Opracowaliśmy biomimetyczną nanomatrycę, która jest bardzo obiecująca, aby służyć jako rusztowanie inżynierii tkankowej. Ten protokół pokazuje, jak złożyć nano-matrycę z nanorurek na zasadzie janusa zsyntetyzowanych w moim laboratorium, a także białka fibronektyny. Ta nano-matryca może się samozorganizować w ciągu kilku sekund bez korzystania z dodatkowej pomocy.W przypadku jednoczesnej hodowli z ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi, nanomatryca wykazała się doskonałą bioaktywnością w pobudzaniu adhezji komórek. Nano-macierz naśladuje morfologicznie macierz zewnątrzkomórkową. W związku z tym, ma potencjał, aby służyć jako rusztowanie do wstrzykiwań do naprawy złamań kości poprzez promowanie adhezji i funkcji komórek w miejscu docelowym.Zacznij od wytworzenia nano-matrycy. Dodaj 80 mikrolitrów nanorurek Janusa o miligramie na mililitr do 40 mikrolitrów fibronektyny o miligramie na mililitr i kilkakrotnie delikatnie i powoli pipetuj mieszaninę. Po 10 sekundach sprawdź wzrokowo rurkę pod kątem obecności białej, stałej zawiesiny.Następnie przygotuj roztwory nanomatryc fibronektyny, JBNT i Fibronectin/JBNT do obserwacji materiałów liofilizowanych zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Pokryj trzy dołki 96-dołkowej, przezroczystej, okrągłodennej mikropłytki roztworami, dodając 50 mikrolitrów do każdej studzienki. Zamrozić talerz w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia włącz liofilizowany instrument i pompę próżniową, a następnie naciśnij przycisk schładzania, aby obniżyć temperaturę systemu do minus 50 stopni Celsjusza. Włóż zamrożoną płytkę do instrumentu i zamknij wszystkie otwory. Kliknij przycisk Start, aby zmniejszyć ciśnienie w układzie do 0,9 milibara.Po czterech godzinach naciśnij przycisk napowietrzania i otwórz zawór, aby zwiększyć ciśnienie w układzie do ciśnienia atmosferycznego. Następnie wyjmij płytkę z liofilizowanego instrumentu. Przygotować roztwór nanomatrycy JBNT/fibronektyny zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i rozcieńczyć roztwory JBNT i fibronektyny wodą destylowaną, aby uzyskać roztwory kontrolne.Zmierzyć widma absorpcyjne roztworów za pomocą spektrofotometru, aby scharakteryzować składanie nanomatryc. Kliknij przycisk UV-vis. Następnie oczyść powierzchnię testową spektrofotometru i upuść na nią dwa mikrolitry wody destylowanej.Zmierz wodę jako ślepą próbę od 190 do 850 nanometrów. Dla każdej próbki oczyść powierzchnię testową i upuść na nią dwa mikrolitry roztworu. Następnie zmierz widma absorpcyjne UV-vis od 190 do 850 nanometrów.Dodaj 200 mikrolitrów kontroli ujemnych, JBNT, fibronektyny i roztworów nano-matrycy do studzienek szkiełka z ośmioma komorami. Liofilizować szkło nakrywkowe z ośmioma dołkami za pomocą liofilizowanego instrumentu, aby pokryć materiały na dnie studzienek. Następnie dodaj 10 000 ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do każdej studzienki szkła nakrywkowego i inkubuj je przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Po inkubacji wyjąć pożywkę do hodowli komórkowych z dołków i przepłukać je PBS. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego do każdej studzienki i pozostaw na pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie delikatnie przepłucz komórki dwukrotnie PBS i dodaj 100 mikrolitrów 0,1% Triton X-100 do każdego dołka.Po 10 minutach powtórz płukanie PBS. Dodaj 100 mikrolitrów falloidyny rodaminy do każdej studzienki i inkubuj szkło nakrywkowe w komorze przez 30 minut, chroniąc je przed światłem. Przepłucz komórki dwukrotnie PBS i zobrazuj je za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Tworzenie nanomatryc jest szybkie i całkowicie biomimetyczne. Biała kłaczka była widoczna 10 sekund po zmieszaniu roztworu JBNT z roztworem fibronektyny. Obrazy z kamer fibronektyny, JBNT i nano-matrycy zostały przechwycone i przeanalizowane.W grupie fibronektyny nie zaobserwowano długich włókien, co wskazuje, że struktura rusztowania nie może powstać bez JBNT. JBNT pojawiają się jako długie i cienkie włókna. Po usieciowaniu fibronektyną włókno nano-matrycy może dorastać do kilku centymetrów długości.Montaż nanomatrycy został również potwierdzony poprzez uzyskanie widm UV-vis. Dwa piki absorpcyjne samych JBNT zmniejszają się po utworzeniu nanomatrycy. Do scharakteryzowania morfologii JBNT i nanomatryc wykorzystano transmisyjną mikroskopię elektronową.JBNT to smukłe rurki o jednakowych średnicach. Po zmieszaniu z fibronektyną tworzą długą nano-matrycę mięśniaków poprzez interakcje ładunków. Gdy pH jest niższe niż punkt izoelektryczny fibronektyny, wiązki nano-matrycy uwalniają się samoczynnie dzięki dodatnio naładowanej fibronektynie.Zbadano również wpływ nanomatrycy JBNT / fibronektyny na adhezję komórek. Ponieważ nanomatryce są zaprojektowane tak, aby morfologicznie naśladować macierz zewnątrzkomórkową, stanowią rusztowanie i zwiększają adhezję komórek. Mikroskopia fluorescencyjna potwierdziła, że inkubacja z nanomatrycami zwiększa adhezję komórek.W poniższej procedurze można wykazać migrację komórek, różnicowanie i długoterminową funkcję, aby dokładniej zbadać wpływ nano-matrycy na wzrost i funkcje ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych.

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym protokole demonstrujemy wytwarzanie biomimetycznych substratów do hodowli komórek serca wykonanych z dwóch różnych materiałów polimerowych za pomocą litografii kapilarnej.  Opisane metody zapewniają skalowalną, opłacalną technikę inżynierii struktury i funkcji makroskopowych tkanek serca do zastosowań in vitro i in vivo.

Litografia sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca

Opisano metodę otrzymywania nanowłókien i złożonych nanostruktur z pojedynczych lub wielu białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje interakcje białko-powierzchnia do tworzenia wolnostojących materiałów na bazie białek o przestrajalnym składzie i architekturze do wykorzystania w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej i biotechnologii.

Nanowłókna i nanostruktury białkowe ECM zaprojektowane przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania elektroprzędzonych rusztowań z nanowłókien o stopniowanej organizacji włókien i badamy ich zastosowania w regulacji morfologii/orientacji komórek. Gradienty w odniesieniu do właściwości fizycznych i chemicznych rusztowań z nanowłókien oferują szeroką gamę zastosowań w dziedzinie biomedycyny.

Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

Przedstawiono protokół wytwarzania dużego obszaru nanowzorzystego podłoża z małych form o nanowzorze do badania nanotopograficznej modulacji zachowania komórek.

Ekspandowanie nanowzorzystych substratów przy użyciu techniki ściegu do nanotopograficznej modulacji zachowania komórek

Opisano metodę uzyskiwania nierównych nanowzorów na bazie dendrymerów, które pozwalają na nanoskalową kontrolę lokalnej gęstości powierzchni kwasu arginina-glicyna-asparaginowa (RGD) i zastosowano ją do badania adhezji komórek i różnicowania chondrogennego.

Nierówne nanowzorce na bazie dendrymerów do lokalnej kontroli adhezji powierzchni: metoda kierowania różnicowaniem chondrogennym

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania gradientowych płytek nanowzorcowych za pomocą termicznego nanoimprintingu oraz metodę przesiewowego wykrywania odpowiedzi ludzkich komórek progenitorowych śródbłonka na nanostruktury. Dzięki zastosowaniu opisanej technologii możliwe jest wytworzenie rusztowania, które może manipulować zachowaniem komórki za pomocą bodźców fizycznych.

Wytwarzanie gradientowego nanowzoru za pomocą techniki nanoimprintingu termicznego i badanie przesiewowe odpowiedzi komórek tworzących kolonie śródbłonka

Ten protokół opisuje kolejno składanie rusztowania nano-matrycy podstawy Janusa (JBNm) warstwa po warstwie poprzez dodawanie nanorurek o zasadzie Janusa (JBNts), matriliny-3 i transformującego czynnika wzrostu beta-1 (TGF-β1). JBNm został wyprodukowany i scharakteryzowany; Dodatkowo wykazywał doskonałą bioaktywność, wspierając funkcje komórek, takie jak adhezja, proliferacja i różnicowanie.

Wytwarzanie i charakterystyka nanomatrycy janus base warstwa po warstwie w celu wspomagania regeneracji chrząstki

Wkładki do hodowli tkankowych z plastikowymi membranami są złotym standardem w laboratoriach hodowli komórkowych jako przepuszczalne nośniki do tworzenia warstw komórkowych i modeli tkanek barierowych. W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodę zastąpienia plastikowej membrany bardziej biologicznie istotną membraną wykonaną z rekombinowanego funkcjonalizowanego białka pajęczej nici.

Nanowłóknista błona podstawna naśladująca wykonana z rekombinowanej, funkcjonalizowanej nici pajęczej w niestandardowych wkładkach do hodowli tkankowych

Poniższy protokół przedstawia metodę wytłaczania opartą na ścinaniu do produkcji hydrożeli kolagenowych z nanoskalowymi wzorzystymi włókienkami, które mogą być stosowane w szerokim zakresie zastosowań inżynierii tkankowej.

Produkcja kolagenu o wzorzystym kształcie nanofibrylarnym dla inżynierii tkankowej

Poznaj metodę wytwarzania biomimetycznej nano-matrycy z nanorurkami Janusa i fibronektyną do adhezji ludzkich komórek macierzystych mezenchymalnych. Ta technika ma potencjał w inżynierii tkanek i naprawie złamań kości.

Wytwarzanie biomimetycznej nano-matrycy z nanorurkami na bazie janusa i fibronektyną do adhezji komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów