Name: Przygotowanie fałdu głosowego szczura do analiz nerwowo-mięśniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj metodę przygotowania fałdu głosowego szczura do analiz nerwowo-mięśniowych z wykorzystaniem kriosekcjonowania. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie struktur mięśniowych krtani.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez granty F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) i K23DC014517 (Johnson, PI) z National Institute on Deafness and other Communication Disorders of the National Institutes of Health.

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szkoły Medycznej Uniwersytetu Nowojorskiego.
1. Wypreparuj krtań szczura
<ol>
	<li>Poddaj szczura eutanazji zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem. Ogolić brzuszną szyję od żuchwy do manubrii i przetrzeć alkoholem, aby zapobiec zanieczyszczeniu futra w próbkach tkanek.</li>
	<li>Pod lunetą sekcyjną z 10-krotnym powiększeniem wyciąć całą krtań, tworząc skalpelem nacięcie szyi w linii środkowej, aż do odsłonięcia tchawicy.</li>
	<li>Oddziel brzuszne zewnętrzne mięśnie krtani w linii środkowej, aby odsłonić krtań za pomocą kleszczy i nożyczek preparacyjnych lub skalpela.</li>
	<li>Odetnij tchawicę ogonową do trzeciego pierścienia tchawicy i wykonaj nacięcie rostralne do kości gnykowej, aby wyciąć całą krtań za pomocą nożyczek preparacyjnych.</li>
	<li>Usuń zewnętrzne tkanki krtani (przełyk, tarczyca i zewnętrzne mięśnie krtani) z krtani za pomocą narzędzi do mikrodysekcji (pęsety, szpilek i mikronożyczek) w powiększeniu.</li>
	<li>Za pomocą mikronożyczek przetnij krtań grzbietowo między arytenoidami, używając linii środkowej między tylnymi mięśniami pierściennymi jako punktu orientacyjnego. Przygnij boczne ściany krtani, aby odsłonić fałdy głosowe, a następnie przeciąć brzusznie przez linię środkową chrząstki tarczycy między przednim spoidłem fałdów głosowych za pomocą mikronożyczek (<silna klasa = "xfig">Rycina 1). 
	UWAGA: Ten krok może być opcjonalny; Można go pominąć, aby utrzymać krtań w całości. Bisekcja krtani umożliwia wiele technik barwienia immunologicznego poprzez oddzielne użycie prawej i lewej strony tej samej krtani.</li>
	<li>Opłucz każdą półkrtań w roztworze buforowym fosforanowym (PBS) przez ~10 s i delikatnie osusz wycieraczką zadaniową, aby ograniczyć tworzenie się kryształków lodu podczas zamrażania.</li>
</ol>
2. Naprawa i/lub błyskawiczne zamrażanie tkanki krtaniowej
UWAGA: Fiksacja może nie być idealna dla wszystkich protokołów barwienia immunologicznego. Często tkanki krtani są błyskawicznie zamrażane na świeżo bezpośrednio po sekcji. Pomiń krok 2.1, aby błyskawicznie zamrozić tkankę krtani bez fiksacji.
<ol>
	<li>Aby utrwalić półkrtań, umieść tkanki w probówce wirówkowej wypełnionej 4% formaldehydem w PBS na 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 70 obr./min. Przenieś chusteczki do czystej probówki wirówkowej i płucz 3x przez 20 minut w PBS. Następnie przenieść do czystej probówki wirówkowej i zanurzyć w 20% roztworze sacharozy/5% glicerolu (~18 godzin lub do momentu, gdy tkanka opadnie) w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Formaldehyd jest niebezpieczny i powinien być stosowany w dygestorium wraz z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.</li>
	<li>Umieść wszystkie półkrzmieni w jednolitej pozycji w krioformie wypełnionej związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). W przypadku półkrtani należy umieścić tkankę tak, aby przyśrodkowa powierzchnia fałdu głosowego była skierowana w stronę dolnej części kriomoldu, a podłużna część fałdu głosowego była równoległa do dolnej krawędzi otworu kriomoldu. W przypadku całych krtani należy umieścić tkankę tak, aby tylne cricoarytenoidy były skierowane do dna kriofordu, a podłużna część fałdu głosowego równolegle do dolnej krawędzi otworu kriomaldu. 
	UWAGA: Spójna orientacja krtani w obrębie związku OCT ma kluczowe znaczenie dla kriosekcji fałdu głosowego szczura. Po osadzeniu i zamrożeniu półkrtani należy ją rozmrozić, aby zmienić jej orientację, co stwarza ryzyko uszkodzenia tkanek w wyniku wielu cykli rozmrażania-zamrażania.</li>
	<li>Błyskawiczne zamrażanie tkanek przy użyciu izopentanu (2-metylobutanu) schłodzonego w stalowej zlewce otoczonej ciekłym azotem. 
	UWAGA: Izopentan osiąga optymalną temperaturę do zamrażania tkanek, gdy białe osady zaczynają tworzyć się po bokach i na dnie zlewki13. Izopentan jest stosowany, ponieważ ma wyższą przewodność cieplną niż ciekły azot, co pomaga zapobiegać pękaniu bloku tkankowego podczas szybkiego zamrażania. Bardziej szczegółowy opis zamrażania tkanek w OTC można znaleźć w Kumar et al.13.</li>
	<li>Zawiń każdą formę we wstępnie oznaczoną folię i umieść w indywidualnej torbie do zamrażania, aby zapobiec odwodnieniu, i natychmiast przechowuj na suchym lodzie do momentu przekazania do przechowywania w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Kriosekcja hemilarynx w płaszczyźnie przekroju poprzecznego
<ol>
	<li>Ustaw temperaturę komory w kriostacie na -20 °C, czyli w środku zakresu temperatur (15−25 °C) zalecanego do cięcia tkanki mięśniowej przez instrukcję producenta.</li>
	<li>Ustaw grubość przekroju kriostatu na odcinek o grubości 10 μm. 
	UWAGA: W przypadku analizy przekroju poprzecznego włókien mięśniowych optymalne są odcinki o grubości 10 μm, aby umożliwić całkowite barwienie i solidną intensywność obrazowania znakowanych włókien mięśniowych do analizy typowania włókien14,15,16. Niektóre protokoły mogą wymagać różnej grubości przekroju w zależności od celów nerwowo-mięśniowych.</li>
	<li>Przenieś tkanki do komory kriostatu, dodaj jednolitą warstwę związku OCT na krążku próbki kriostatu (uchwyt) i umieść osadzony blok tkanki na wierzchu związku OCT na dysku próbki. Aby uzyskać przekroje poprzeczne fałdu głosowego do analizy włókien mięśniowych tarczycy (TA), należy przymocować próbkę do uchwytu tak, aby brzuszna chrząstka tarczycy była skierowana w stronę ostrza kriostatu, a chrząstka arytenoidalna była skierowana w stronę dysku próbki. 
	UWAGA: Należy zauważyć, że te punkty orientacyjne nie są widoczne na tym etapie, ze względu na to, że związek OCT staje się biały i nieprzezroczysty po zamrożeniu. Ten brak widoczności jest powodem, dla którego tak ważne jest, aby zwrócić uwagę na orientację półkrtani podczas fazy błyskawicznego zamarzania.</li>
	<li>Przyciąć związek OCT, przesuwając głowę próbki o 100 μm, aż pojawi się brzuszna część chrząstki tarczycy.</li>
	<li>Następnie przyciąć i śledzić odcinki 30 μm od początku chrząstki tarczycy do odsłonięcia blaszki właściwej, przyśrodkowych mięśni TA i bocznych mięśni TA. 
	UWAGA: Punkty orientacyjne krtani należy śledzić i notować od początku chrząstki tarczycy co 100 μm, aby upewnić się, że kąt przekroju nie jest ukośny. Rysunek 2 przedstawia dwa zestawy punktów orientacyjnych krtani w płaszczyźnie przekroju poprzecznego w powiększeniu 10x.</li>
	<li>Po osiągnięciu docelowego mięśnia TA należy zebrać skrawki na dodatnio naładowanych szkiełkach o wielkości 10 μm.</li>
	<li>Przechowywać skrawki w PBS w temperaturze 4 °C, aby zatrzymać wilgoć do czasu, gdy będą gotowe do barwienia. 
	UWAGA: Utrwalona tkanka może być przechowywana w PBS do jednego tygodnia, w zależności od celu IHC, podczas gdy nieutrwalona tkanka powinna być natychmiast przetworzona.</li>
</ol>
4. Kriosekcja hemilarynx w płaszczyźnie podłużnej
<ol>
	<li>Gdy komora kriostatu jest ponownie ustawiona na -20 °C, zmień grubość przekroju na 30 μm. 
	UWAGA: Do analizy NMJ można użyć grubości tkanki w zakresie 30-60 μm do uchwycenia kilku kompletnych NMJ w mięśniach krtani bez fragmentacji zakończenia nerwowego lub płytki końcowej motorycznej11,12,17.</li>
	<li>Aby uzyskać podłużne odcinki fałdów głosowych do analizy NMJ mięśnia TA, należy przymocować próbki do uchwytu tak, aby nagłośnia była skierowana w stronę ostrza kriostatu, a światło tchawicy skierowane w dół w kierunku krążka próbki.</li>
	<li>Przyciąć związek OCT, przesuwając główkę próbki o 100 μm, aż pojawi się chrząstka tarczycy.</li>
	<li>Przycinaj i śledź odcinki o wielkości 30 μm od początku tarczycy do odsłonięcia blaszki właściwej oraz przyśrodkowych i bocznych podziałów mięśnia TA. 
	UWAGA: Zaleca się pięć zestawów punktów orientacyjnych krtani w płaszczyźnie podłużnej, aby śledzić postęp głębokości tkanki w kierunku docelowego mięśnia TA. <silna klasa="xfig">Rysunek 3 przedstawia punkty orientacyjne krtani w płaszczyźnie podłużnej w powiększeniu 10x.</li>
	<li>Po osiągnięciu docelowego mięśnia TA należy zebrać skrawki na dodatnio naładowanych szkiełkach pod prędkością 30 μm.</li>
	<li>Przechowywać skrawki w PBS w temperaturze 4 °C, aby zatrzymać wilgoć do czasu, gdy będą gotowe do barwienia.</li>
</ol>

<ol><li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962(2002).</li>
<li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging%3A+Relevance+to+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li>
<li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations%3A+effects+of+amphetamine+and+social+context%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li>
<li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li>
<li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+dopamine+synaptic+activity%3A+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li>
<li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Communication+Disorders%22%5BJournal%5D)">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li>
<li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li>
<li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+intravenous+cocaine+experience%3A+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li>
<li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anatomic+study+of+the+rat+larynx%3A+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology+and+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li>
<li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Speech%2C+Language%2C+and+Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793(2015).</li>
<li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li>
<li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Speech%2C+Language%2C+and+Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li>
<li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li>
<li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li>
<li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przygotowanie fałdów głosowych szczurów do analizy nerwowo-mięśniowej może wiązać się z różnymi wyzwaniami. Mięśnie krtani są nie tylko małe i otoczone chrząstką, co utrudnia bezpośrednią ekstrakcję mięśnia docelowego, ale stwierdzono również dużą zmienność między zwierzętami w głębokości anatomicznych punktów orientacyjnych krtani. W przypadku mięśni protokół płaszczyzny przekroju poprzecznego, pełne odcinki fałdów głosowych pojawiły się między 21−85 sekcjami (10 μm na sekcję) po początkowym pojawieniu się brzusznej chr...

Krtań szczura jest dobrze znanym modelem do badania strukturalnych i funkcjonalnych adaptacji nerwowo-mięśniowej krtani do rozwoju, starzenia się, chorób i czynników farmakologicznych1,2,3,4,5. Spójność metod histologicznych ma kluczowe znaczenie dla tej branży, ponieważ istnieje wiele zawiłości związanych z przygotowaniem i analizą mięśni, a także wyzwania związane z rozmiarem, kształtem i topografią krtani mięśni zamkniętych w chrząstkach krtaniowych1,6,7,8,9,10,11. Ze względu na niewielki rozmiar wewnętrznych mięśni krtani szczura, systematyczne osadzanie, zamrażanie i kriosekcja mają kluczowe znaczenie dla osiągnięcia spójnych i dokładnych wyników. Na przykład, podczas cięcia fałdu głosowego szczura w płaszczyźnie koronalnej, połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ) czterech wewnętrznych mięśni krtani znajdują się w odległości mniejszej niż 1,8 mm od głębokości tkanki11. Dlatego precyzyjne monitorowanie anatomii mięśni krtani podczas kriosekcji jest niezbędne, aby dokładnie zidentyfikować interesujący fragment (sekcje) i zapobiec nadmiernemu cięciu tkanki. Przecięcie mięśnia docelowego może skutkować niedokładną identyfikacją liczby i topografii NMJs11 lub może spowodować ogólne zmniejszenie wielkości próby, jeśli mięsień docelowy zostanie odrzucony z powodu zamieszania związanego z orientacją punktu orientacyjnego12. W miarę opracowywania nowych modeli do badania mięśni krtani i ich odpowiednich adaptacji, standardowe procedury operacyjne są niezbędne, aby zapewnić precyzję, wiarygodność i powtarzalność wyników we wszystkich badaniach.
Celem tego artykułu jest szczegółowe przygotowanie fałdu głosowego szczura do optymalnej analizy podłużnej i przekrojowej. Opisano szczegółowe metody stosowane regularnie w naszym laboratorium w celu identyfikacji docelowych punktów orientacyjnych mięśni podczas kriosekcji. Chociaż podobne metody są stosowane w kilku laboratoriach, tutaj podano więcej szczegółów niż w literaturze, aby zapewnić wiarygodną i dokładną replikację, gdy są wdrażane przez początkujących badaczy. Celem tego samouczka jest przedstawienie standardowej metodologii oceny immunohistochemicznej (IHC) fałdu głosowego szczura w celu poprawy spójności między laboratoriami i badaniami.

<table><tbody><tr><td>Certyfikowana 2-metylobutanowa</td> folia aluminiowa <td>Fisher Chemical</td><td>35514</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>1213101</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce kriogeniczne SS</td><td>Thermo Scientific</td><td>11679123</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza kriostatu</td><td>CL Sturkey D554X50</td><td>22-210-045</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe formy bazowe 15mm x 15mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>41-741</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe podkładki</td><td>Medline</td><td>23-666-062</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw preparacyjny</td><td>Thermo Scientific</td><td>9996969</td><td></td></tr><tr><td>DPBS - Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>sekcja mrożona Medium</td><td>Fisher Healthcare</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>Bel-Art</td><td></td><td></td>11999054</tr><tr><td>Komora wilgotnościowa Immunostain</td><td>Ted Pella Inc</td><td>NC9425474</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty na igły</td><td>Assi</td><td>ASSI. B148</td><td></td></tr><tr><td>Gąbki włókninowe, 4-warstwowe</td><td>Quick Medical</td><td>9023</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Troemner</td><td>02-217-987</td><td></td></tr><tr><td>Długopis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehydowy, 16% w/v aq. soln., bez metanolu</td> Probówki do mikrowirówek <td>Alfa Aesar</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium</td><td>Fisherbrand</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Przechowywanie próbek Worki</td><td>Fisherbrand</td><td>19240093</td><td></td></tr><tr><td>Miara z podziałką ze stali nierdzewnej 32 uncje/100 ml</td><td>Polar Ware</td><td>114231B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Wycieraczka zadaniowa</td><td>Kimberly-Clark Professional&trade; 34155</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisherbrand</td><td>2261840</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Wzór Nożyczki</td><td>Assi</td><td>ASSI. </td><td></td></tr><tr><td>SAS15RV UWAGA: W przypadku wszystkich materiałów eksploatacyjnych są to przykłady wyposażenia do zakupu. Dokładny model nie jest konieczny do ukończenia naszych metod.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie fałdu głosowego szczura do analiz nerwowo-mięśniowych

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Celem tego samouczka jest opisanie przygotowania fałdu głosowego szczura do histochemicznego badania nerwowo-mięśniowego. Protokół ten określa procedury rozwarstwiania krtani u szczurów, błyskawicznego zamrażania i kriosekcji fałdów głosowych. W pracy opisano sposób kriosekcji fałdów głosowych zarówno w płaszczyźnie podłużnej, jak i przekroju poprzecznego. Nowością tego protokołu jest śledzenie krtani podczas kriosekcji, które zapewnia dokładną identyfikację wewnętrznych mięśni krtani i zmniejsza ryzyko utraty tkanki. Rysunki pokazują postępującą kriosekcję w obu płaszczyznach. Dwadzieścia dziewięć półkrtani szczurów poddano kriosekcji i śledzono od pojawienia się chrząstki tarczycy do pojawienia się pierwszej sekcji, która obejmowała pełny fałd głosowy. Pełny fałd głosowy został zobrazowany dla wszystkich zwierząt w obu płaszczyznach. Stwierdzono dużą zmienność odległości od pojawienia się chrząstki tarczycy do pojawienia się pełnego fałdu głosowego w obu płaszczyznach. Waga nie była skorelowana z głębokością punktów orientacyjnych krtani, co sugeruje, że indywidualna zmienność i inne czynniki związane z przygotowaniem tkanek mogą być odpowiedzialne za dużą zmienność w wyglądzie punktów orientacyjnych podczas sekcji. W badaniu tym szczegółowo opisano metodologię i przedstawiono dane morfologiczne dotyczące przygotowania fałdu głosowego szczura do histochemicznego badania nerwowo-mięśniowego. Ze względu na dużą zmienność osobniczą, punkty orientacyjne krtani powinny być ściśle śledzone podczas kriosekcji, aby zapobiec nadmiernemu cięciu tkanki i utracie tkanek. Zastosowanie spójnej metodologii, w tym odpowiednie przygotowanie tkanek i świadomość punktów orientacyjnych w krtani szczura, pomoże w uzyskaniu spójnych wyników we wszystkich badaniach i pomoże nowym badaczom zainteresowanym wykorzystaniem fałdu głosowego szczura jako modelu do badania mechanizmów nerwowo-mięśniowych krtani.

Reprezentatywne wyniki były częścią trwającego badania nad wpływem ćwiczeń głosowych na krtaniowy układ nerwowo-mięśniowy. Dwadzieścia dziewięć samców szczurów Fischer 344/brown Norway (12 w wieku 9 miesięcy, 17 w wieku 24 miesięcy) zważono i poddano eutanazji poprzez inhalację CO2, a następnie wykonano obustronną torakotomię.
Procedury przeprowadzono zgodnie z opisanym protokołem w celu znakowania NMJ oraz pomiaru wielkości włókien bocznego i przyśrodkowego mięśnia TA. Odległość mi...

Ten protokół opisuje metody używane do przygotowania fałdów głosowych szczurów do histochemicznego badania nerwowo-mięśniowego.

Przygotowanie fałdu głosowego szczura do analiz nerwowo-mięśniowych

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Protokół ten ułatwia przygotowanie fałdu głosowego szczura do optymalnej analizy podłużnej i przekrojowej. Protokół wykorzystuje śledzenie krtani podczas kriosekcji, aby zapewnić dokładną identyfikację wewnętrznych mięśni krtani i zmniejszyć ryzyko utraty tkanki. Krtań rantowa jest dobrze ugruntowanym modelem do badania strukturalnych i funkcjonalnych adaptacji nerwowo-mięśniowych krtani w odpowiedzi na rozwój, starzenie się, choroby i czynniki farmakologiczne.Chociaż demonstracja ta koncentruje się na mięśniu tarczycowym fałdu głosowego, metodologia ma również zastosowanie do innych wewnętrznych mięśni krtani. W celu wypreparowania krtani szczura należy ogolić brzuszną szyję od żuchwy do manubrium i przetrzyj odsłonięty obszar alkoholem, aby zapobiec zanieczyszczeniu futra próbek tkanek. Umieść szczura pod mikroskopem preparacyjnym z 10-krotnym powiększeniem i za pomocą skalpela wykonaj nacięcie szyi w linii środkowej, aż tchawica zostanie odsłonięta.Użyj kleszczy i ostrego narzędzia, aby oddzielić brzuszne zewnętrzne mięśnie krtani w linii środkowej i odciąć tchawicę ogonową do trzeciego pierścienia tchawicy. Aby wyciąć krtań, użyj nożyczek preparacyjnych, aby wykonać nacięcie og

preparation-of-the-rat-vocal-fold-for-neuromuscular-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano technikę pozwalającą na ilościowe określenie odpowiedzi fizjologicznej neuronów ssaków in vivo podczas ruchu oraz korelację fizjologii neuronu z jego morfologią, fenotypem neurochemicznym i mikroobwodami synaptycznymi.

Charakterystyka fizjologiczna, morfologiczna i neurochemiczna neuronów modulowanych przez ruch

Opisano metodologię wytwarzania syntetycznych modeli fałdów głosowych. Modele mają rzeczywistą wielkość i naśladują wielowarstwową strukturę ludzkich fałdów głosowych. Wyniki pokazują, że modele wykazują samopodtrzymujące się oscylacje przy ciśnieniach porównywalnych z ciśnieniem płuc oraz wykazują odpowiedzi wibracyjne indukowane przepływem, podobne do tych występujących w ludzkich fałdach głosowych.

Wytwarzanie syntetycznego, wielowarstwowego, samowzbudnego modelu fałdów głosowych

Źródło: Andreatta, R. D. et al., Podskórny wlew neurotrofiny 4 przy użyciu pomp osmotycznych lub bezpośredniego wstrzyknięcia mięśni poprawia starzenie się mięśni krtani szczura. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia infuzję neurotrofiny 4 (NTF4) w starzejącym się modelu szczurzym w celu przywrócenia funkcji mięśni krtani dotkniętej odnerwieniem związanym ze starzeniem się i zmniejszonymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi. NTF4 wyzwala regenerację nerwów i wspomaga tworzenie połączeń...

Napar Neurotrofiny 4 do regeneracji nerwu krtaniowego u starzejącego się szczura

Komórki otoczki węchowej (OEC) to komórki grzebienia nerwowego, które umożliwiają wzrost pierwotnych neuronów węchowych. Ta specyficzna właściwość może być wykorzystana do przeszczepu komórkowego. Przedstawiamy w niniejszej pracy model transplantacji komórkowej oparty na zastosowaniu OEC w modelu uszkodzenia nerwu krtaniowego.

Przeszczep komórek osłonki węchowej w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów obwodowych

Niewydolność oddechowa jest główną przyczyną zgonów po urazie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym. Posiadanie powtarzalnego, mierzalnego i wiarygodnego przedklinicznego modelu zwierzęcego niewydolności oddechowej wywołanej częściowym uszkodzeniem szyjki macicy pomoże zrozumieć późniejszą neuroplastyczność układu oddechowego i nieoddechowego oraz umożliwi przetestowanie przypuszczalnych strategii naprawczych.

Mysi model uszkodzenia rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym do badania neuroplastyczności układu oddechowego po zmianie chorobowej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący zastosowanie neurotrofiny 4 (NTF4) systemowo i bezpośrednio do przebudowy starzejących się mięśni krtani u szczurów.

Podskórny wlew neurotrofiny 4 za pomocą pomp osmotycznych lub bezpośredniego wstrzyknięcia mięśniowego poprawia starzenie się mięśni krtani szczura

Opisujemy zabieg chirurgiczny na znieczulonym modelu szczura w celu określenia napięcia mięśniowego i właściwości lepkosprężystych języka. Zabieg polega na specyficznej stymulacji nerwów podjęzykowych i zastosowaniu biernych krzywych siły/deformacji Lissajous do mięśnia.

In vivo (in vivo) Ocena właściwości mechanicznych i lepkosprężystych języka szczura

Protokół ten opisuje seryjne podejście transoralnej laryngoskopii u myszy i szczurów, które umożliwia bliskie, niezakłócone obrazowanie krtani podczas oddychania i połykania, z wykorzystaniem zoptymalizowanego schematu znieczulenia oraz precyzyjnie dopracowanych technik manipulacji endoskopowej.

Małoinwazyjna laryngoskopia mysia do obrazowania z bliska ruchu krtani podczas oddychania i połykania

W tym badaniu prezentujemy metodę in vivo do szacowania liczby i wielkości jednostek motorycznych w celu ilościowego określenia połączenia jednostki motorycznej membrany szczura. Opisano podejście krok po kroku do tych technik.

Ocena miar wyników łączności przepony przeponowej jednostki motorycznej szczura jako ilościowych biomarkerów zwyrodnienia i kompensacji neuronów ruchowych frenii

Ultradźwiękowe wołania szczurów i myszy laboratoryjnych (USV) są przydatne do badania funkcji głosowych i nerwowych. Ten protokół opisuje paradygmat nagrody pokarmowej, który niezawodnie wywołuje wołania USV dotyczące pożądania bez zamieszań związanych z rozmnażaniem. Zawiera szczegóły dotyczące kondycjonowania zwierząt, prezentacji bodźców, nagrywania i analizy akustycznej, dostarczając metodę odtwarzalną do badania funkcji afektywno-motywacyjnych i czopowych czuciowo-ruchowych.

Elicytacja pokarmu przedwidziała wzmożenie apetytowych ultradźwiękowych wokalizacji u szczurów laboratoryjnych i myszy

Poznaj metodę przygotowania fałdu głosowego szczura do analiz nerwowo-mięśniowych z wykorzystaniem kriosekcjonowania. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie struktur mięśniowych krtani.

Przygotowanie fałdu głosowego szczura do analiz nerwowo-mięśniowych

Przeglądaj więcej filmów