Name: Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj optogenetyczną aktywację szlaków aferentnych w wycinkach mózgu oraz modulację odpowiedzi za pomocą izofluranu. Ta metoda pozwala badać specyficzne typy komórek i dynamikę synaptyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Bryanowi Krause za wsparcie techniczne i wskazówki dotyczące tego projektu.
Ta praca była wspierana przez Międzynarodowe Towarzystwo Badań Anestezjologicznych (IMRA do AR), Narodowe Instytuty Zdrowia (R01 GM109086 do MIB) oraz Wydział Anestezjologii, Szkoła Medycyny i Zdrowia Publicznego, University of Wisconsin, Madison, WI, USA.

<ol><li>Baumgart, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+inhibits+synaptic+vesicle+exocytosis+through+reduced+Ca2%2B+influx%2C+not+Ca2%2B-exocytosis+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).</li>
<li>Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+inhibits+the+neurotransmitter+release+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery.</a> Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+anesthetics+with+neurotransmitter+release+machinery+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins.</a> Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).</li>
<li>Crick, F., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+consciousness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">A framework for consciousness.</a> Nature Neurosciences. 6 (2), 119-126 (2003).</li>
<li>Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+consciousness%3A+progress+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of consciousness: progress and problems.</a> Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).</li>
<li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+theoretical+approaches+to+conscious+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Experimental and theoretical approaches to conscious processing.</a> Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).</li>
<li>Friston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+theory+of+cortical+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A theory of cortical responses.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 360 (1456), 815-836 (2005).</li>
<li>Mashour, G. A., Hudetz, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-Up+and+Top-Down+Mechanisms+of+General+Anesthetics+Modulate+Different+Dimensions+of+Consciousness%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 44(2017).</li>
<li>Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Effects+of+General+Anesthetics+on+Cortical+Network+Activity+Using+Ex+Vivo+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations.</a> Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).</li>
<li>Redinbaugh, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamus+Modulates+Consciousness+Via+Layer-Specific+Control+of+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex.</a> Neuron. 105 (4), 0896(2020).</li>
<li>Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REBUS+and+the+Anarchic+Brain%3A+Toward+a+Unified+Model+of+the+Brain+Action+of+Psychedelics%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics.</a> Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).</li>
<li>Mak-McCully, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+cortical+and+thalamic+activity+during+non-REM+sleep+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans.</a> Nature communications. 8 (1), 15499(2017).</li>
<li>Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consciousness+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Consciousness and anesthesia.</a> Science. 322 (5903), 876-880 (2008).</li>
<li>Sanders, R. D., Maze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenergic+trespass+in+anesthetic+and+sedative+states%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states.</a> Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).</li>
<li>Hemmings, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+Comprehensive+Understanding+of+Anesthetic+Mechanisms+of+Action%3A+A+Decade+of+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).</li>
<li>Nourski, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+Predictive+Coding+across+Awareness+States+under+Anesthesia%3A+An+Intracranial+Electrophysiology+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study.</a> Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propofol+disrupts+functional+interactions+between+sensory+and+high-order+processing+of+auditory+verbal+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Brain+Mapping%22%5BJournal%5D)">Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory.</a> Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).</li>
<li>Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+cortical+network+activity+by+the+general+anesthetic+isoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Anaesthesiology%22%5BJournal%5D)">Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane.</a> British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).</li>
<li>Lee, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+frontal-parietal+communication+by+ketamine%2C+propofol%2C+and+sevoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane.</a> Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).</li>
<li>Ferrarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+in+cortical+effective+connectivity+during+midazolam-induced+loss+of+consciousness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).</li>
<li>Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+inhibition+of+frontal-to-parietal+feedback+connectivity+is+a+neurophysiologic+correlate+of+general+anesthesia+in+surgical+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients.</a> PLoS.One. 6 (10), 25155(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+Properties+in+Transitions+of+Consciousness+during+Propofol-induced+Sedation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16791(2017).</li>
<li>Murphy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propofol+anesthesia+and+sleep%3A+a+high-density+EEG+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study.</a> Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).</li>
<li>Murphy, C., Krause, B., Banks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+effects+of+isoflurane+on+cortico-cortical+feedback+afferent+responses+in+murine+non-primary+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Anaesthesiology%22%5BJournal%5D)">Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex.</a> British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).</li>
<li>Raz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+effect+of+isoflurane+on+top-down+versus+bottom-up+pathways+in+sensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+System+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex.</a> Frontiers in System Neurosciences. 8, 191(2014).</li>
<li>Schrouff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+functional+integration+decreases+during+propofol-induced+loss+of+consciousness%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness.</a> Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-Specific+Feedforward+Circuits+between+Thalamus+and+Neocortex+Revealed+by+Selective+Optical+Stimulation+of+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons.</a> Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).</li>
<li>Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+diffusion+and+partition+coefficients+of+propofol+in+rat+brain+tissue%3A+implications+for+studies+of+drug+action+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BJA%3A+British+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro.</a> BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).</li>
<li>Benkwitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+EC50+amnesic+concentration+of+etomidate+and+its+diffusion+profile+in+brain+tissue%3A+implications+for+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies.</a> Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).</li>
<li>Franks, N. P., Lieb, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+actions+of+volatile+general+anaesthetics+at+molecular+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels.</a> British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).</li>
<li>Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partition+coefficients+of+volatile+anesthetics+in+aqueous+electrolyte+solutions+at+various+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures.</a> Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).</li>
<li>Au - Segev, A., Au - Garcia-Oscos, F., Au - Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Lin, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+channelrhodopsin+variants%3A+features%2C+limitations+and+future+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments.</a> Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).</li>
<li>Banks, M. I., Pearce, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+actions+of+volatile+anesthetics+on+GABAA+IPSCs%3A+dissociation+of+blocking+and+prolonging+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects.</a> Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).</li>
<li>Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+measures+of+volatile+anesthetics+in+the+aqueous+phase+using+calcium+sensitive+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisano protokół oceny wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych odpowiedzi na selektywnie aktywowane szlaki aferentne w wycinkach mózgu ex vivo.
Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych i równoległych schematów zapisu pozwala badaczom badać reakcje lokalnych populacji na aferentne dane wejściowe z odległych regionów mózgu, jednocześnie rejestrując z docelowych populacji interneuronów. Zastosowanie technologii optogenetycznej pozwala na zachowanie i aktywację zakończeń aksonów projekcji af...

Lotne środki znieczulające są powszechnie stosowane w różnych warunkach klinicznych i akademickich od ponad stu lat. Różne klasy środków znieczulających mają unikalne, często nienakładające się na siebie cele molekularne1,2,3, ale prawie wszystkie z nich powodują utratę przytomności. Podczas gdy ich efekty behawioralne są dość przewidywalne, mechanizmy, za pomocą których środki znieczulające wywołują utratę przytomności, są w dużej mierze nieznane. Środki znieczulające mogą ostatecznie wpływać zarówno na poziom, jak i zawartość świadomości poprzez działania na obwody korowo-wzgórzowe, zakłócając integrację informacji w całej hierarchii korowej4,5,6,7,8,9. W szerszym ujęciu, modulacja obwodów korowo-wzgórzowych może odgrywać rolę w eksperymentalnie10 lub farmakologicznie11 odmiennych stanach świadomości, a także może być związana z sleep12 oraz w patofizjologicznych zaburzeniach świadomości13,14.
Nieuchwytność mechanizmów leżących u podstaw utraty i powrotu do świadomości podczas znieczulenia może być częściowo przypisana nieliniowemu, synergicznemu działaniu środków znieczulających na poziomie komórkowym, sieciowym i systemowym15. Izofluran, na przykład, hamuje aktywność w wybranych obszarach mózgu16,17,18, upośledza łączność między odległymi regionami mózgu19,20,21,22,23 i zmniejsza reakcje synaptyczne w sposób specyficzny dla szlaku manner24,25. Nie jest jasne, jakie efekty działania środków znieczulających, od poziomu molekularnego do systemowego, są konieczne lub wystarczające do spowodowania utraty przytomności. Oprócz merytorycznych badań klinicznych świadomości przy użyciu technik nieinwazyjnych19,20,26, ważne jest, aby eksperymentatorzy starali się rozwikłać odrębne interakcje komórkowe i sieciowe, które służą świadomemu doświadczeniu.
Upraszczając złożone interakcje występujące w nienaruszonym mózgu, wycinki mózgu ex vivo pozwalają na badanie izolowanych komponentów dynamicznych systemów mózgu9. Preparat o zmniejszonej ilości plastrów łączy w sobie korzyści płynące ze stosunkowo nienaruszonych struktur anatomicznych lokalnych obwodów nerwowych z wszechstronnością manipulacji in vitro. Jednak do niedawna ograniczenia metodologiczne uniemożliwiały badanie właściwości synaptycznych i obwodowych sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu27,28; Kręta ścieżka dróg włókien korowo-wzgórzowych sprawiła, że aktywacja niezależnych szlaków aferentnych była prawie niemożliwa przez stymulację elektryczną.
Badanie wpływu środków znieczulających na preparaty do wycinania mózgu stanowi dodatkowe wyzwanie. W przypadku braku nienaruszonego układu oddechowego i krążenia, środki znieczulające muszą być stosowane w kąpieli, a stężenia starannie dopasowane do szacowanych stężeń w miejscu działania. W przypadku wielu dożylnych środków znieczulających powolne tempo równoważenia w tkance sprawia, że tradycyjne badania farmakologiczne są pracochłonne29,30. Badanie wpływu środków znieczulających gazami lotnymi w preparatach ex vivo jest łatwiejsze do opanowania, ale wiąże się również z wyzwaniami. Obejmują one konwersję wdychanych dawek ciśnienia parcjalnego na stężenia wodne oraz potrzebę zmodyfikowanego systemu dostarczania leku do tkanki za pośrednictwem sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego31.
Tutaj opisane są metody, za pomocą których badacze mogą wykorzystać dobrze udokumentowane właściwości fizykochemiczne lotnego znieczulającego izofluranu do dostarczania leków do wycinków mózgu ex vivo, aktywować specyficzne dla szlaku i warstwy wejścia do obszaru zainteresowania kory mózgowej o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, oraz przeprowadzać jednoczesne zapisy laminarne i ukierunkowane zapisy patch clamp z wybranych populacji neuronów. W połączeniu procedury te pozwalają badaczom mierzyć lotne zmiany wywołane znieczuleniem w kilku obserwowalnych właściwościach reakcji elektrofizjologicznej, od poziomu synaptycznego do poziomu sieci lokalnej.

<table><tbody><tr><td>Obiektyw szerokokątny 2,5x</td><td>Olympus</td><td>MPLFLN2,5X</td><td></td></tr><tr><td>40-krotna soczewka do zanurzenia w wodzie</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>mieszanina 95% O2/5% CO2</td> Sonda <td>Airgas</td><td>Z02OX95R2003045</td><td></td></tr><tr><td>A16</td><td>NeuroNexus</td><td>A16x1-2mm-100-177-A16</td><td>16-kanałowa sonda</td></tr><tr><td>AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP</td><td>Karl Deisseroth Lab, UNC Monitor</td> gazów anestetycznych Vector Core <td></td><td></td></tr><tr><td>(POET II)</td><td>Criticare</td><td>602-3A</td><td></td></tr><tr><td>ATP, Sól magnezowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>roztwór wewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>007914</td><td>Zależna od Cre mysz tdTomato</td></tr><tr><td>B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>008069</td><td>Mysz PV-Cre</td></tr><tr><td>Wytrząsarka do brzucha</td><td>Thomas Scientific</td><td>1210H86-TS</td><td>do równoważenia szczelnych worków z gazem</td></tr><tr><td>Roztwór betadyny</td><td>Marka ogólna Bleach</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ogólna marka</td><td></td><td>elektrody zaciskowej do chlorowania srebra</td></tr><tr><td>Bupivicaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSC20010</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Szkło kapilarne (nagrania z zaciskiem krosowym)</td><td>King Precision Glass, Inc.</td><td>KG-33</td><td>borokrzemian, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Długość: 90.0mm</td></tr><tr><td>Szkło kapilarne (zastrzyki wirusowe)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>3.5"</td></tr><tr><td>Sterowanie mikromanipulatorem junior</td><td>Luigs i Neumann</td><td>SM8</td><td>do sterowania mikromanipulatorem junior</td></tr><tr><td>Sterowanie manipulatorami i stołem przesuwnym</td><td>Luigs and Neumann</td><td>SM7</td><td>do sterowania elektrodą wielokanałową i Stół przesuwny</td></tr><tr><td>Digidata 1440A + Clampex 10</td><td>Molecular Devices</td><td>1440A</td><td>Digitizer i oprogramowanie</td></tr><tr><td>E-3603 rurki</td><td>Fisher Scientific</td><td>14171208</td><td>do dostarczania mieszaniny 95% O2/5% CO2 do komory inkubacyjnej + zastosowanie ciśnienia podczas zaciskania łaty</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Dot Scientific</td><td>DSE57060</td> rozwiązanie <td>wewnątrzkomórkowe</td></tr><tr><td>ERP-27 EEG Panel</td> <td>referencyjny/krosowy EEGNeuralynx</td><td>Wycofana igła</td><td></td></tr><tr><td>do napełniania</td><td>World Precision Instruments</td><td>50821912</td><td>do napełniania pipet z zaciskiem krosowym</td></tr><tr><td>Kostka filtracyjna do obrazowania EYFP</td><td>Olympus</td><td>U-MRFPHQ</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>09801E</td><td>kładzie się na szablonie plastra podczas przygotowywania bloku tkanki</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet płonących/brązowych</td><td>Instrument</td> <td>SutterP-1000</td><td>2,5x2,5 Pudełko</td></tr><tr><td>filament Rurka dyspersyjna</td><td>gazu Sigma Aldrich</td><td>CLS3953312C</td><td></td></tr><tr><td>Szklana strzykawka (100 mL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z314390</td><td>do napełniania worków z uszczelnieniem gazowym</td></tr><tr><td>Kwas glukonowy, Sól potasowa (K-glukonian)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSG37020</td><td>roztwór wewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Dot Scientific</td><td>DSG32040</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>GTP, Sól sodowa</td><td>Roztwór wewnątrzkomórkowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8877</td></tr><tr><td>Adapter sondy czołowej</td><td>Adapter NeuroNexus</td><td>A16-OM16</td><td>do podłączenia 16-kanałowej sondy do wejścia sceny głównej</td></tr><tr><td>Kleszcze hemostatyczne</td><td>VWR International</td><td>76192-096</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Dot Scientific</td><td>DSH75030</td><td>ACSF, roztwór wewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>HS-16 Headstage</td><td>Neuralynx</td><td>Emerytowany</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy (70%)</td><td>VWR International</td><td>101223-746</td><td></td></tr><tr><td>Młodszy mikromanipulator</td><td>Luigs and Neumann</td><td>210-100 000 0090-R</td><td>do manipulacji elektrodą zaciskową</td></tr><tr><td>Moduł sterowania źródłem światła LED Mightex</td><td></td><td>BLS-PL02_US</td><td>optogenetyczne sterowanie źródłem światła</td></tr><tr><td>Wzmacniacz Lidocaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lynx-8</td><td>Neuralynx</td><td>wycofany</td><td></td></tr><tr><td>zasilacz Lynx-8</td><td>Neuralynx</td><td>wycofany</td><td></td></tr><tr><td>siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSM24300</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>mCherry, Texas Czerwona kostka</td><td>filtracyjna Chroma</td><td>49008</td><td>do obrazowania tdReporter fluorescencyjny</td></tr><tr><td>pomidorów Meloksykam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do mikropipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9044962</td><td></td></tr><tr><td>Pompa mikrostrzykawkowa</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>generyczna MultiClamp 700A</td><td>Urządzenia molekularne/Axon Instruments</td><td>700A</td><td>Wzmacniacz</td></tr><tr><td>Azot (do stołu powietrznego)</td><td>Airgas</td><td>NI200</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowa siatka</td><td>Fisher Scientific</td><td>501460083</td><td>rozciągnięta na podkowę ze spłaszczonego drutu platynowego, na tym opiera się plasterek podczas nagrań</td></tr><tr><td>Nylon, wycięty z rajstop</td><td>Mały kawałek marki</td><td></td> Generic <td>do tworzenia platformy plastrów w komorze inkubacyjnej, pojedyncze włókna do tworzenia harfy platynowej</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1697520</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Dot Scientific</td><td>307</td><td>Do przenoszenia tkanki na zestaw</td></tr><tr><td>Drut platynowy</td><td>VWR International</td><td>BT124000</td><td>2 cm, spłaszczony, do wykonania harfy platynowej</td></tr><tr>Optogenetyczny system dostarczania światła<td>Polygon400</td><td>Mightex</td><td>DSI-E-0470-0617-000,</td><td>dostarczany z oprogramowaniem PolyScan2</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSP41000</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Fosforan potasu (KH2PO4)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSP41200</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Szafirowe ostrze (do wibratomu)</td><td>VWR International</td><td>100492-502</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-361445</td><td></td></tr><tr><td>Szczelny worek gazowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>109236</td><td></td></tr><tr><td>Stół przesuwny do mikroskopu</td><td>Luigs and Neumann</td><td>380FMU</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (HCO3-)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSS22060</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSS23020</td><td>ACSF, roztwór wewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre)</td><td>Mysz Jackson Laboratory</td><td>013044</td><td>SOM-Cre</td></tr><tr><td>Przyrząd stereotaktyczny</td><td>Kopf</td><td>Model 902</td><td>Podwójny klej Super Animal</td></tr><tr><td></td><td>Super Staples</td><td>886833</td><td>do mocowania bloku tkanki do etapu próbki podczas przygotowywania plastrów</td></tr><tr><td>Wiertarka chirurgiczna</td><td>RAM Products Inc.</td>Strzykawka <td>DIGITALMICROTORQUE</td><td>Microtorque II</td></tr><tr><td>(1 ml) z końcówką LuerLock</td><td>Fisher Scientific</td><td>309628</td><td>do wywierania nacisku podczas zaciskania łaty</td></tr><tr><td>Strzykawka (1 mL) z końcówką ślizgową</td><td>WW Grainger, Inc.</td><td>19G384</td><td>do napełniania pipet z zaciskiem krosowym</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe VWR</td><td>International</td><td>66064-414</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom wibracyjny</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>ręczniki Wypall</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-042-427</td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

Środki znieczulające wpływają częściowo na świadomość poprzez swoje działania na obwody wzgórzowo-korowe. Jednak stopień, w jakim lotne środki znieczulające wpływają na różne komórkowe i sieciowe składniki tych obwodów, pozostaje niejasny. Wycinki mózgu ex vivo dostarczają środków, za pomocą których badacze mogą badać dyskretne składniki złożonych sieci i rozplątywać potencjalne mechanizmy leżące u podstaw wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje. Aby wyizolować potencjalne efekty leków specyficzne dla typu komórki i szlaku w wycinkach mózgu, badacze muszą być w stanie niezależnie aktywować szlaki włókien doprowadzających, zidentyfikować nienakładające się populacje komórek i zastosować lotne środki znieczulające do tkanki w roztworze wodnym. W tym protokole opisano metody pomiaru optogenetycznie wywołanych odpowiedzi na dwie niezależne szlaki aferentne do kory nowej w wycinkach mózgu ex vivo. Odpowiedzi zewnątrzkomórkowe są rejestrowane w celu oznaczenia aktywności sieciowej, a ukierunkowane zapisy klamry łatkowej całej komórki są przeprowadzane w interneuronach dodatnich pod względem somatostatyny i parwalbuminy. Opisano dostarczanie fizjologicznie istotnych stężeń izofluranu przez sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy w celu modulowania odpowiedzi komórkowych i sieciowych.

Harmonogram kroków opisanych w protokole przedstawiono na Rysunku 1. Wejścia korowe pochodzące z korowych obszarów wyższego rzędu lub z niepierwotnych jąder wzgórza mają częściowo nakładające się pola zakończeń w warstwie 1 niepierwotnej kory wzrokowej24. Aby wyizolować niezależne drogi doprowadzające wzgórzowo-korowe lub koro-korowe, wykonano iniekcję wektora wirusowego zawierającego ChR2 oraz fluorescencyjny reporter eYFP do Po lub Cg. Komórki w promieniu iniekcji p...

Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.

Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect ...

Protokół ten można wykorzystać do zbadania, czy lotne środki znieczulające zaburzają niektóre streszczenia bardziej niż inne, do określenia, czy ich działanie jest specyficzne dla typu komórki, czy dla szlaku, oraz do określenia, jakie efekty występują na poziomie populacji. Główną zaletą tej techniki jest specyfika, z jaką możemy ocenić działanie lotnych środków znieczulających. Możemy celować w określone szlaki i typy komórek w jednoczesnym badaniu aktywności populacji.Zacznij od przygotowania bloku tkankowego do cięcia. Delikatnie wyjmij mózg z jamy czaszki i umieść go na bibule filtracyjnej. Wykonaj cięcie wzdłuż płaszczyzny strzałkowej mózgu równolegle do linii środkowej i umieść blok tkankowy na tej płaszczyźnie strzałkowej.Poprowadź bibułę filtracyjną po szablonie blokującym i wyrównaj mózg z konturem leżącego pod spodem szablonu. Wykonaj równoległe cięcie w płaszczyźnie koronalnej, jak wskazują linie na szablonie, dodając niewielką kroplę plasterka aCSF, aby w razie potrzeby bibuła filtracyjna była mokra. Umieść blok tkanki w czterech stopniach Celsjusza, krojąc CSF i nałóż niewielką ilość kleju na lodowatą próbkę.Wyjmij blok tkanki z plastrowania CSF i odchować nadmiar roz

optogenetic-activation-afferent-pathways-brain-slices-modulation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film przedstawia metodę jednoczesnego obrazowania i rejestrowania aktywności elektrycznej z transgenicznych wycinków mózgu, które zawierają specyficzne dla neuronów białka fluorescencyjne. Procedura polega na utrzymywaniu wycinka mózgu w komorze perfuzyjnej z napowietrzonym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, użyciu źródła światła do wzbudzenia komórek znakowanych fluorescencyjnie oraz rejestrowaniu sygnałów elektrycznych za pomocą wielokanałowej sondy i zacisku krosowego.

Jednoczesne optyczne i elektrofizjologiczne monitorowanie komórek neuronalnych w wycinkach mózgu

Ten film demonstruje procedurę analizy połączeń synaptycznych między przyśrodkową korą przedczołową (mPFC) a neuronami ciała migdałowatego za pomocą ostrych wycinków mózgu ciała migdałowatego od myszy. Neurony mPFC u tych myszy wyrażają rodopsynę kanałową połączoną z białkiem fluorescencyjnym. Rodopsyny kanałowe ułatwiają napływ jonów i generowanie potencjału czynnościowego w neuronach mPFC po aktywacji światłem. W konsekwencji neurony mPFC uwalniają neuroprzekaźniki, które wiążą się z...

Wizualizacja i mapowanie ścieżek neuronalnych w wycinku mózgu ciała migdałowatego

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Podejścia optogenetyczne są powszechnie używane do manipulowania aktywnością neuronalną i oceny konsekwencji dla funkcjonowania mózgu. W tym miejscu przedstawiono technikę, która po ekspresji in vivo aktywatora optycznego rodopsyny kanałowej pozwala na analizę ex vivo właściwości synaptycznych określonych połączeń neuronalnych dalekiego zasięgu i lokalnych połączeń nerwowych w obwodach związanych ze strachem.

Ex vivo Optogenetyczna analiza obwodów strachu w wycinkach mózgu

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Ten protokół opisuje zestaw metod do identyfikacji specyficznej dla typu komórki funkcjonalnej łączności sygnałów dalekiego zasięgu z odległych obszarów mózgu za pomocą stymulacji optogenetycznej w wycinkach mózgu ex vivo.

Wewnątrzmózgowe zastrzyki stereotaktyczne in vivo do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Zgodnie z obecną implementacją, optogenetyka u naczelnych wymaga wstrzyknięcia wektorów wirusowych do mózgu. Optymalna metoda iniekcji powinna być niezawodna i, w przypadku wielu zastosowań, zdolna do celowania w pojedyncze miejsca o dowolnej głębokości, które można łatwo i jednoznacznie zidentyfikować w histologii pośmiertnej. Przedstawiono metodę iniekcji o tych właściwościach.

Wstrzyknięcia wektorów AAV do optogenetyki w znieczulonym i przytomnym, zachowującym się mózgu naczelnych innych niż człowiek

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Poznaj optogenetyczną aktywację szlaków aferentnych w wycinkach mózgu oraz modulację odpowiedzi za pomocą izofluranu. Ta metoda pozwala badać specyficzne typy komórek i dynamikę synaptyczną.

Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Przeglądaj więcej filmów