Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających
July 23rd, 2020
Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.
Protokół ten można wykorzystać do zbadania, czy lotne środki znieczulające zaburzają niektóre streszczenia bardziej niż inne, do określenia, czy ich działanie jest specyficzne dla typu komórki, czy dla szlaku, oraz do określenia, jakie efekty występują na poziomie populacji. Główną zaletą tej techniki jest specyfika, z jaką możemy ocenić działanie lotnych środków znieczulających. Możemy celować w określone szlaki i typy komórek w jednoczesnym badaniu aktywności populacji.
Zacznij od przygotowania bloku tkankowego do cięcia. Delikatnie wyjmij mózg z jamy czaszki i umieść go na bibule filtracyjnej. Wykonaj cięcie wzdłuż płaszczyzny strzałkowej mózgu równolegle do linii środkowej i umieść blok tkankowy na tej płaszczyźnie strzałkowej.
Poprowadź bibułę filtracyjną po szablonie blokującym i wyrównaj mózg z konturem leżącego pod spodem szablonu. Wykonaj równoległe cięcie w płaszczyźnie koronalnej, jak wskazują linie na szablonie, dodając niewielką kroplę plasterka aCSF, aby w razie potrzeby bibuła filtracyjna była mokra. Umieść blok tkanki w czterech stopniach Celsjusza, krojąc CSF i nałóż niewielką ilość kleju na lodowatą próbkę.
Wyjmij blok tkanki z plastrowania CSF i odchować nadmiar roztworu rogiem chłonnego ręcznika. Przyklej tylną płaszczyznę czołową bloku tkankowego do etapu próbki tak, aby grzbietowa powierzchnia mózgu była skierowana w stronę szafirowego ostrza. Zbierz plasterki mózgu koronalnego o grubości 500 mikrometrów i umieść je na nylonowej siatce w 34 stopniach Celsjusza, krojąc CSF.
Pozwól, aby pojemnik osiągnął temperaturę pokojową. Aby przygotować eksperymentalne worki aCSF z rozpuszczonym izofluranem, dodaj 600 mililitrów eksperymentalnego aCSF i 600 mililitrów mieszaniny 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla do pustego worka z gazem z politetrafluoroetylenu. Oznacz ten formant worka.
Dodaj 300 mililitrów eksperymentalnego aCSF do innego worka z gazem z politetrafluoroetylenu i oznacz ten worek izofluranem. Przystąpić do przygotowania worka z izofluranem zgodnie ze wskazówkami zawartymi w manuskrypcie. Skonfiguruj protokoły symulacji światła, losowo przypisując kształty fal do każdego profilu.
Każdy profil z przypisaną mu postacią fali odpowiada jednemu impulsowi wyzwalającemu z cyfrowego wejścia TTL lub jednej próbie. Po zakończeniu zapisz sekwencję profili. Aby umieścić sondę wielokanałową w szkiełku tkanki mózgowej ex vivo, perfuzuj eksperymentalny aCSF z pęcherzykami w ilości od trzech do sześciu mililitrów na minutę i przenieś wycinek mózgu zawierający obszar zainteresowania na siatkę w komorze perfuzyjnej mikroskopu.
Zakotwicz wycinek mózgu za pomocą platynowej harfy. Obróć siatkę tak, aby linia styków elektrod na dystalnym końcu sondy wielokanałowej była w przybliżeniu prostopadła do powierzchni odklejania. Przy szerokim oświetleniu pola i precyzyjnej kontroli mikromanipulatora opuść sondę wielokanałową w kierunku powierzchni warstwy.
Włącz odpowiednią kostkę filtrującą do wizualizacji fluorescencyjnego białka reporterowego ulegającego ekspresji w zakończeniach aksonów aferentów korowych. W razie potrzeby obróć plasterek, aby dokładniej wyrównać sondę z powierzchnią odklejania. Umieść sondę tuż nad płaszczyzną wycinka 200 mikrometrów przed ostateczną pozycją docelową wzdłuż osi x, pozostawiając co najmniej jeden kanał poza rejestrowanym obszarem tkanki.
Powoli włóż sondę do plastra wzdłuż jego osi podłużnej. Aby zminimalizować uszkodzenia tkanki, przesuwaj sondę tylko do tego stopnia, aby ostre końcówki były widoczne tylko pod powierzchnią tkanki. Przełącz eksperymentalne źródło CSF na workowany roztwór kontrolny i zidentyfikuj komórkę znakowaną fluorescencyjnie w celu ukierunkowanego zapisu patch clamp.
Ogranicz przysłonę do najmniejszej średnicy i włącz obiektyw zanurzający w wodzie o dużej mocy, uważając, aby uniknąć kontaktu między sondą wielokanałową a soczewką obiektywu. Ustaw ostrość na tkance. Wyśrodkuj światło na obszarze tkanki przylegającym do sondy wielokanałowej, ale nie nachodzącym na nią.
Włącz odpowiedni zestaw filtrów, aby umożliwić obrazowanie komórek wyrażających marker fluorescencyjny zależny od Cre. Podnieś soczewkę obiektywu, aby uzyskać wystarczająco dużo miejsca na opuszczenie pipety z plastrem. Załaduj pipetę z plastrem roztworem wewnętrznym i zamontuj ją na uchwycie elektrody.
Użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby zastosować nadciśnienie odpowiadające około 0,1 mililitra powietrza. Zanurz pipetę z plastrem w roztworze, ustawiając końcówkę w ostrości pod kierunkiem wizualnym i uzyskaj zapis całej komórki z docelowej komórki. Zwierzęta wykorzystane w tym protokole wykazywały ekspresję fluorescencyjnego białka reporterowego tdTomato w interneuronach somatostatyny lub parwalbuminowo-dodatnich.
Interneurony te zostały ukierunkowane na zaciskanie łat pod nadzorem wizualnym z włączoną odpowiednią kostką filtrującą. Potencjały postsynaptyczne zaobserwowano w interneuronach w odpowiedzi na ciąg czterech dwumilisekundowych impulsów światła. Zarejestrowano również lokalne potencjały polowe.
Gęstość źródła prądu i aktywność wielocząsteczkową wyodrębniono z lokalnych potencjałów polowych. Amplituda pochłaniaczy prądu wydobywanych z gęstości źródła prądu wzrastała w funkcji natężenia światła. Trzyparametrowe nieliniowe równanie logistyczne zostało dopasowane do danych w celu porównań między ścieżkami.
Amplituda potencjału postsynaptycznego również wzrastała wraz z amplitudą ujścia prądu. Odpowiedzi synaptyczne na sygnały wejściowe wzgórzowo-korowe i korowo-korowe mierzono w warunkach kontrolnych, izofluranu i rekonwalescencji. Postsynaptyczne odpowiedzi somatostatyny i bodźców korowo-korowych oraz wywołane pochłaniacze prądu były tłumione w warunkach izofluranu.
Podczas przygotowywania plastrów mózgu najważniejsze jest utrzymanie zdrowia tkanki. Ważne jest, aby tkanka była chłodna przez cały czas krojenia, działając szybko, nie uszkadzając tkanki. Wielokanałowe nagrania zewnątrzkomórkowe mogą być przetwarzane na różne sposoby.
Na przykład, filtrowanie górnoprzepustowe sygnału szerokopasmowego izoluje aktywność gwałtownego wzrostu populacji, podczas gdy obecne obliczenia gęstości źródła podkreślają aktywność synaptyczną. Łącznie techniki te pozwoliły nam zbadać wpływ znieczulenia na określone izolowane elementy obwodów korowych, dostarczając wglądu w mechanizmy leżące u podstaw utraty przytomności in vivo.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie wykorzystuje ex vivo kroje mózgu do zbadania wpływu znieczulenia o podwyższonej lotności, w szczególności izofluranu, na reakcje neuronów na napływ sygnałów. Za pomocą optogenetyki badacze niezależnie aktywizują thalamokortykalne i kortykookortykkalne napływy w neokorteksie niepierwotnym, badając, jak ekspozycja na znieczulenie modyfikuje reakcje synaptyczne i sieciowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Plastyczność synaptyczna
Tło
- Zrozumienie, jak znieczulenia o podwyższonej lotności wpływają na obwody neuronalne, jest kluczowe.
- Ex vivo kroje mózgu zapewniają skontrolowane środowisko do takich badań.
- Optogenetyka umożliwia selektywne aktywowanie ścieżek neuronalnych.
- Wpływ znieczulenia na reakcje synaptyczne może mieć szersze zastosowanie w klinicznych ustawieniach znieczulenia.
Cel badania
- Określenie, czy znieczulenia o podwyższonej lotności mają różny wpływ na różne ścieżki synaptyczne.
- Ocenienie, czy te efekty są specyficzne dla określonych typów komórek.
- Ewaluacja reakcji populacyjnych podczas ekspozycji na znieczulenie.
Zastosowane metody
- Główną platformą wykorzystaną w tym badaniu były ex vivo kroje mózgu od zwierząt.
- Docelowymi typami komórek były interneurony dodatnie na somatostatynę i parwalbuminę.
- Kroje mózgu były przygotowywane i utrzymywane w warunkach minimalizujących uszkodzenie tkanki.
- Eksperymenty obejmowały stymulację optogenetyczną w celu zmierzenia potencjałów postsynaptycznych.
- Kluczowymi krokami były przygotowanie roztworów eksperymentalnych i konfiguracja protokołów stymulacji świetlnej.
Główne wyniki
- Ekspozycja na izofluran hamowała reakcje synaptyczne na thalamokortykalne i kortykookortykkalne napływy.
- Amplitudy potencjałów postsynaptycznych zwiększały się wraz z intensywnością światła, wskazując na wrażliwość docelowych interneuronów.
- Obliczenia gęstości źródeł prądowych wykazały zwiększoną aktywność synaptyczną w określonych warunkach.
- Wyniki sugerują wyraźne efekty znieczulenia na pobudliwość neuronów i modulacje synaptycznej.
Wnioski
- To badanie pokazuje przydatność ex vivo krojów mózgu w badaniu wpływu znieczulenia na obwody neuronowe.
- Dostarcza wglądu w dynamikę synaptyczną, która jest wpłynięta przez znieczulenia o podwyższonej lotności, przyczyniając się do głębszego zrozumienia mechanizmów neuronalnych podczas znieczulenia.
- Wyniki mogą wpłynąć na praktyki kliniczne dotyczące znieczulenia i jego wpływu na funkcje mózgu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise dissection of anesthetic effects on defined neural pathways and cell types, supporting mechanistic de-risking in CNS drug discovery. By isolating thalamocortical and corticocortical inputs in ex vivo brain slices, it provides quantitative, pathway-specific readouts that enhance target validation confidence. The approach aids in predicting how CNS-active compounds modulate network excitability and synaptic transmission, informing early go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether volatile anesthetics differentially affect synaptic pathways.
- Operational Value: Enables cell type- and pathway-specific assessment of drug effects on neuronal excitability.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with selective modulation of thalamocortical versus corticocortical transmission.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems with quantifiable extracellular and intracellular responses to afferent stimulation.
- Reproducibility: Standardizes optogenetic stimulation and anesthetic delivery via aCSF for consistent synaptic response measurements.
- Scalability: Supports multi-condition testing (control, drug, recovery) to enable dose-response and time-course profiling.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models thalamocortical circuits implicated in consciousness and sensory processing, aligning with neuropsychiatric indications.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by preserving key physiological properties of cortical networks.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insight into anesthetic-induced suppression of postsynaptic potentials, informing safety pharmacology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical assessment, offering a platform to evaluate CNS compound effects on defined neural circuits before in vivo testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pathway-specific drug actions and biological de-risking of synaptic targets.
- Screening: Delivers assay-ready preparations with quantifiable postsynaptic potential and current source density outputs.
- Analytics: Enables comparison of synaptic responses across conditions using non-linear logistic fitting of light-intensity response curves.
- Translational Research: Maintains cortical circuit integrity to support extrapolation to preclinical efficacy and safety studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening anesthetic and non-anesthetic CNS modulators on isolated afferent pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by isolating cell type-specific effects of volatile anesthetics on synaptic transmission.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized tissue preparation, optogenetic stimulation, and anesthetic delivery in aCSF.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing whether compounds preferentially disrupt thalamocortical or corticocortical signaling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on pathway-selective modulation of interneuron activity in sensory cortex.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, electrophysiology, and brain slice preparation.
- Depends on fluorescence-guided patch clamping and multi-channel extracellular recording systems.
- Necessitates precise control of anesthetic concentration in aCSF and light stimulation protocols.
- Involves adaptation considerations when translating findings across species or disease models.
- Limited by tissue viability duration and the need to maintain physiological conditions throughout experimentation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Preparation of Acute Brain Slices
2:47
Placing Multi-Channel Probe in Ex Vivo Brain Tissue Slice
4:38
Patch Clamping Targeted Neurons and Obtaining Whole-Cell Configuration
5:55
Results: Intracellular and Multi-Channel Extracellular Recordings in Cortical Slice
7:19
Conclusion
