Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających
23 lipca 2020
Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.
Protokół ten można wykorzystać do zbadania, czy lotne środki znieczulające zaburzają niektóre streszczenia bardziej niż inne, do określenia, czy ich działanie jest specyficzne dla typu komórki, czy dla szlaku, oraz do określenia, jakie efekty występują na poziomie populacji. Główną zaletą tej techniki jest specyfika, z jaką możemy ocenić działanie lotnych środków znieczulających. Możemy celować w określone szlaki i typy komórek w jednoczesnym badaniu aktywności populacji.
Zacznij od przygotowania bloku tkankowego do cięcia. Delikatnie wyjmij mózg z jamy czaszki i umieść go na bibule filtracyjnej. Wykonaj cięcie wzdłuż płaszczyzny strzałkowej mózgu równolegle do linii środkowej i umieść blok tkankowy na tej płaszczyźnie strzałkowej.
Poprowadź bibułę filtracyjną po szablonie blokującym i wyrównaj mózg z konturem leżącego pod spodem szablonu. Wykonaj równoległe cięcie w płaszczyźnie koronalnej, jak wskazują linie na szablonie, dodając niewielką kroplę plasterka aCSF, aby w razie potrzeby bibuła filtracyjna była mokra. Umieść blok tkanki w czterech stopniach Celsjusza, krojąc CSF i nałóż niewielką ilość kleju na lodowatą próbkę.
Wyjmij blok tkanki z plastrowania CSF i odchować nadmiar roztworu rogiem chłonnego ręcznika. Przyklej tylną płaszczyznę czołową bloku tkankowego do etapu próbki tak, aby grzbietowa powierzchnia mózgu była skierowana w stronę szafirowego ostrza. Zbierz plasterki mózgu koronalnego o grubości 500 mikrometrów i umieść je na nylonowej siatce w 34 stopniach Celsjusza, krojąc CSF.
Pozwól, aby pojemnik osiągnął temperaturę pokojową. Aby przygotować eksperymentalne worki aCSF z rozpuszczonym izofluranem, dodaj 600 mililitrów eksperymentalnego aCSF i 600 mililitrów mieszaniny 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla do pustego worka z gazem z politetrafluoroetylenu. Oznacz ten formant worka.
Dodaj 300 mililitrów eksperymentalnego aCSF do innego worka z gazem z politetrafluoroetylenu i oznacz ten worek izofluranem. Przystąpić do przygotowania worka z izofluranem zgodnie ze wskazówkami zawartymi w manuskrypcie. Skonfiguruj protokoły symulacji światła, losowo przypisując kształty fal do każdego profilu.
Każdy profil z przypisaną mu postacią fali odpowiada jednemu impulsowi wyzwalającemu z cyfrowego wejścia TTL lub jednej próbie. Po zakończeniu zapisz sekwencję profili. Aby umieścić sondę wielokanałową w szkiełku tkanki mózgowej ex vivo, perfuzuj eksperymentalny aCSF z pęcherzykami w ilości od trzech do sześciu mililitrów na minutę i przenieś wycinek mózgu zawierający obszar zainteresowania na siatkę w komorze perfuzyjnej mikroskopu.
Zakotwicz wycinek mózgu za pomocą platynowej harfy. Obróć siatkę tak, aby linia styków elektrod na dystalnym końcu sondy wielokanałowej była w przybliżeniu prostopadła do powierzchni odklejania. Przy szerokim oświetleniu pola i precyzyjnej kontroli mikromanipulatora opuść sondę wielokanałową w kierunku powierzchni warstwy.
Włącz odpowiednią kostkę filtrującą do wizualizacji fluorescencyjnego białka reporterowego ulegającego ekspresji w zakończeniach aksonów aferentów korowych. W razie potrzeby obróć plasterek, aby dokładniej wyrównać sondę z powierzchnią odklejania. Umieść sondę tuż nad płaszczyzną wycinka 200 mikrometrów przed ostateczną pozycją docelową wzdłuż osi x, pozostawiając co najmniej jeden kanał poza rejestrowanym obszarem tkanki.
Powoli włóż sondę do plastra wzdłuż jego osi podłużnej. Aby zminimalizować uszkodzenia tkanki, przesuwaj sondę tylko do tego stopnia, aby ostre końcówki były widoczne tylko pod powierzchnią tkanki. Przełącz eksperymentalne źródło CSF na workowany roztwór kontrolny i zidentyfikuj komórkę znakowaną fluorescencyjnie w celu ukierunkowanego zapisu patch clamp.
Ogranicz przysłonę do najmniejszej średnicy i włącz obiektyw zanurzający w wodzie o dużej mocy, uważając, aby uniknąć kontaktu między sondą wielokanałową a soczewką obiektywu. Ustaw ostrość na tkance. Wyśrodkuj światło na obszarze tkanki przylegającym do sondy wielokanałowej, ale nie nachodzącym na nią.
Włącz odpowiedni zestaw filtrów, aby umożliwić obrazowanie komórek wyrażających marker fluorescencyjny zależny od Cre. Podnieś soczewkę obiektywu, aby uzyskać wystarczająco dużo miejsca na opuszczenie pipety z plastrem. Załaduj pipetę z plastrem roztworem wewnętrznym i zamontuj ją na uchwycie elektrody.
Użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby zastosować nadciśnienie odpowiadające około 0,1 mililitra powietrza. Zanurz pipetę z plastrem w roztworze, ustawiając końcówkę w ostrości pod kierunkiem wizualnym i uzyskaj zapis całej komórki z docelowej komórki. Zwierzęta wykorzystane w tym protokole wykazywały ekspresję fluorescencyjnego białka reporterowego tdTomato w interneuronach somatostatyny lub parwalbuminowo-dodatnich.
Interneurony te zostały ukierunkowane na zaciskanie łat pod nadzorem wizualnym z włączoną odpowiednią kostką filtrującą. Potencjały postsynaptyczne zaobserwowano w interneuronach w odpowiedzi na ciąg czterech dwumilisekundowych impulsów światła. Zarejestrowano również lokalne potencjały polowe.
Gęstość źródła prądu i aktywność wielocząsteczkową wyodrębniono z lokalnych potencjałów polowych. Amplituda pochłaniaczy prądu wydobywanych z gęstości źródła prądu wzrastała w funkcji natężenia światła. Trzyparametrowe nieliniowe równanie logistyczne zostało dopasowane do danych w celu porównań między ścieżkami.
Amplituda potencjału postsynaptycznego również wzrastała wraz z amplitudą ujścia prądu. Odpowiedzi synaptyczne na sygnały wejściowe wzgórzowo-korowe i korowo-korowe mierzono w warunkach kontrolnych, izofluranu i rekonwalescencji. Postsynaptyczne odpowiedzi somatostatyny i bodźców korowo-korowych oraz wywołane pochłaniacze prądu były tłumione w warunkach izofluranu.
Podczas przygotowywania plastrów mózgu najważniejsze jest utrzymanie zdrowia tkanki. Ważne jest, aby tkanka była chłodna przez cały czas krojenia, działając szybko, nie uszkadzając tkanki. Wielokanałowe nagrania zewnątrzkomórkowe mogą być przetwarzane na różne sposoby.
Na przykład, filtrowanie górnoprzepustowe sygnału szerokopasmowego izoluje aktywność gwałtownego wzrostu populacji, podczas gdy obecne obliczenia gęstości źródła podkreślają aktywność synaptyczną. Łącznie techniki te pozwoliły nam zbadać wpływ znieczulenia na określone izolowane elementy obwodów korowych, dostarczając wglądu w mechanizmy leżące u podstaw utraty przytomności in vivo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu wykorzystano skrawki mózgu ex vivo do zbadania wpływu lotnych anestetyków, a w szczególności izofluranu, na reakcje neuronalne na sygnały doprowadzające. Dzięki zastosowaniu optogenetyki badacze niezależnie aktywują aferencje wzgórzowo-korowe i kora-kora w neokorze niepierwotnej, analizując, w jaki sposób ekspozycja na środek anestetyczny moduluje odpowiedzi synaptyczne i sieciowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Plastyczność synaptyczna
Wprowadzenie
- Zrozumienie wpływu lotnych anestetyków na obwody neuronalne ma kluczowe znaczenie.
- Przekroje mózgu ex vivo zapewniają kontrolowane środowisko do prowadzenia takich badań.
- Optogenetyka umożliwia specyficzną aktywację szlaków neuronalnych.
- Wpływ środków znieczulających na odpowiedzi synaptyczne może dostarczyć istotnych informacji dotyczących szerszego zastosowania anestezji w warunkach klinicznych.
Cel badania
- Aby ustalić, czy anestetyki lotne wywierają zróżnicowany wpływ na różne szlaki synaptyczne.
- Aby ocenić, czy efekty te są specyficzne dla określonych typów komórek.
- Aby ocenić odpowiedzi na poziomie populacyjnym podczas ekspozycji na anestetyk.
Zastosowane metody
- Główną platformą wykorzystaną w tej badaniu były skrawki mózgu zwierząt ex vivo.
- Docelowe typy komórek obejmowały interneurony somatostatynowe oraz parwalbuminowe.
- Skrawki mózgu przygotowano i utrzymywano w warunkach minimalizujących uszkodzenia tkanki.
- Doświadczenia obejmowały stymulację optogenetyczną w celu pomiaru potencjałów postsynaptycznych.
- Kluczowe etapy obejmowały przygotowanie roztworów eksperymentalnych oraz konfigurację protokołów stymulacji światłem.
Główne wyniki
- Ekspozycja na izofluran zahamowała odpowiedzi synaptyczne na sygnały wzgórzowo-korowe i korowo-korowe.
- Amplitudy potencjałów postsynaptycznych wzrastały wraz z natężeniem światła, co wskazuje na responsywność targetowanych interneuronów.
- Obliczenia gęstości źródła prądu wykazały zwiększoną aktywność synaptyczną w określonych warunkach.
- Wyniki sugerują wyraźny wpływ środków znieczulających na pobudliwość neuronalną oraz modulację synaptyczną.
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje użyteczność skrawków mózgu ex vivo w badaniu wpływu środków anestetycznych na obwody neuronalne.
- Dostarcza ono informacji na temat dynamiki synaptycznej pod wpływem lotnych anestetyków, przyczyniając się do głębszego zrozumienia mechanizmów neuronalnych podczas znieczulenia.
- Wyniki mogą wpłynąć na praktyki kliniczne dotyczące anestezji oraz jej oddziaływania na funkcje mózgu.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia precyzyjne rozdzielenie efektów działania środków znieczulających na określone szlaki neuronalne i typy komórek, co wspiera proces ograniczania ryzyka mechanistycznego w badaniach nad lekami ukierunkowanymi na OUN. Poprzez izolację wkładów wzgórzowo-korowych i koro-korowych w skrawkach mózgu ex vivo, metoda ta dostarcza ilościowych, specyficznych dla danej drogi odczytów, które zwiększają pewność walidacji celu terapeutycznego. Podejście to pomaga w przewidywaniu, w jaki sposób związki aktywne w OUN modulują pobudliwość sieci i przekaźnictwo synaptyczne, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania wczesnych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w etapach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez badanie, czy anestetyki lotne w różny sposób wpływają na szlaki synaptyczne.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ocenę wpływu leków na pobudliwość neuronalną w sposób specyficzny dla typu komórek i konkretnego szlaku.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję związków z portfela badawczego poprzez identyfikację substancji wykazujących selektywną modulację przekaźnictwa wzgórzowo-korowego w stosunku do przekazywania sygnałów koro-korowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Tworzy zwalidowane systemy biologiczne z mierzalnymi odpowiedziami pozakomórkowymi i wewnątrzkomórkowymi na stymulację aferentną.
- Powtarzalność: Standaryzuje stymulację optogenetyczną oraz podawanie anestetyku za pomocą aCSF w celu uzyskania spójnych pomiarów odpowiedzi synaptycznej.
- Skalowalność: Umożliwia testowanie wielu warunków (kontrolnych, z lekiem, po regeneracji) w celu opracowania profili zależności dawka-odpowiedź oraz przebiegu czasowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modeluje obwody wzgórzowo-korowe zaangażowane w świadomość i przetwarzanie sensoryczne, co jest zgodne z wskazaniami neuropsychiatrycznymi.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez zachowanie kluczowych właściwości fizjologicznych sieci korowych.
- Decyzje z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza wglądu mechanistycznego w indukowane przez anestetyki tłumienie potencjałów postsynaptycznych, co dostarcza informacji dla farmakologii bezpieczeństwa.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, oferując platformę do oceny wpływu związków działających na OUN na określone obwody neuronalne przed badaniami in vivo.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących specyficznego działania leków na szlaki sygnałowe oraz redukcję ryzyka biologicznego w przypadku celów synaptycznych.
- Przesiewy: Dostarcza preparaty gotowe do analizy z mierzalnymi wynikami potencjału postsynaptycznego i gęstości prądu źródłowego.
- Analityka: Umożliwia porównywanie odpowiedzi synaptycznych w różnych warunkach przy użyciu nieliniowego dopasowania logistycznego krzywych odpowiedzi na intensywność światła.
- Badania translacyjne: Zachowuje integralność obwodów korowych, co pozwala na ekstrapolację wyników do przedklinicznych badań bezpieczeństwa i skuteczności.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do przesiewowych badań anestetycznych i nieanestetycznych modulatorów OUN na izolowanych szlakach doprowadzających.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez izolację specyficznych dla typu komórek efektów anestetyków lotnych na przekaźnictwo synaptyczne.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji przygotowania tkanek, stymulacji optogenetycznej oraz podawania anestetyków w aCSF.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ujawnienie, czy związki preferencyjnie zaburzają sygnalizację wzgórzowo-korową czy koro-korową.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o selektywną dla szlaku modulację aktywności interneuronów w korze sensorycznej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu optogenetyki, elektrofizjologii oraz przygotowania skrawków mózgu.
- Metoda opiera się na wykorzystaniu patch-clamping sterowanego fluorescencyjnie oraz wielokanałowych systemów rejestracji pozakomórkowej.
- Konieczna jest precyzyjna kontrola stężenia anestetyku w aCSF oraz protokołów stymulacji światłem.
- Wymaga uwzględnienia różnic adaptacyjnych przy przenoszeniu wyników między gatunkami lub modelami chorób.
- Ograniczeniem jest czas żywotności tkanki oraz konieczność utrzymania warunków fizjologicznych przez cały okres przeprowadzania eksperymentu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Preparation of Acute Brain Slices
2:47
Placing Multi-Channel Probe in Ex Vivo Brain Tissue Slice
4:38
Patch Clamping Targeted Neurons and Obtaining Whole-Cell Configuration
5:55
Results: Intracellular and Multi-Channel Extracellular Recordings in Cortical Slice
7:19
Conclusion
