Name: Ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj mechanizmy egzoferogenezy w neuronach C. elegans przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda umożliwia ilościową ocenę ekstruzji agregatów białkowych i organelli z komórek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uznajemy następujące granty NIH: R01AG047101 i R37AG56510. Członkowie laboratoriów Driscoll i Grant wnieśli ogromny wkład w rozwój i dopracowanie opisanych protokołów, przeprowadzając rygorystyczne eksperymenty i prowadząc silną komunikację.

<ol><li>Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Spread+of+Protein+Aggregates+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).</li>
<li>Davis, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+degradation+of+axonal+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcellular degradation of axonal mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9633-9638 (2014).</li>
<li>Torralba, D., Baixauli, F., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+Know+No+Boundaries%3A+Mechanisms+and+Functions+of+Intercellular+Mitochondrial+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria Know No Boundaries: Mechanisms and Functions of Intercellular Mitochondrial Transfer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 107(2016).</li>
<li>Stahl, P. D., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Exosomes+and+Microvesicles+Integrators+of+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%2C+Md.%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles Integrators of Homeostasis.</a> Physiology (Bethesda, Md.). 34 (3), 169-177 (2019).</li>
<li>Melentijevic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-elegans+neurons+jettison+protein+aggregates+and+mitochondria+under+neurotoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">C-elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress.</a> Nature. 542 (7641), 367(2017).</li>
<li>Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+a+prion+domain+from+cell-to-cell+by+vesicular+transport+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 9 (3), 1003351(2013).</li>
<li>Tyson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+animal+model+defines+genetic+contributions+for+neuron-to-neuron+transfer+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel animal model defines genetic contributions for neuron-to-neuron transfer of alpha-synuclein.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+spreading+of+huntingtin+aggregates+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 5427-5433 (2015).</li>
<li>Pearce, M. M. P., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+neuronal+huntingtin+aggregates+to+phagocytic+glia+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain.</a> Nature Communications. 6, 6768(2015).</li>
<li>Fu, H., Li, J., Du, P., Jin, W., Cui, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+wastes+are+extracellularly+disposed+by+excretosomes%2C+nanotubes+and+exophers+in+mouse+HT22+cells+through+an+autophagic+vesicle+clustering+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic wastes are extracellularly disposed by excretosomes, nanotubes and exophers in mouse HT22 cells through an autophagic vesicle clustering mechanism.</a> bioRxiv. 10 (1), (2019).</li>
<li>Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia-reoxygenation+regulates+mitochondrial+dynamics+through+the+hypoxia+response+pathway%2C+SKN-1%2FNrf%2C+and+stomatin-like+protein+STL-1%2FSLP-2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2.</a> PLoS Genetics. 9 (12), 1004063(2013).</li>
<li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+green+fluorescent+protein%3A+probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive green fluorescent protein: probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2008).</li>
<li>Perkins, L. A., Hedgecock, E. M., Thomson, J. N., Culotti, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+sensory+cilia+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 117 (2), 456-487 (1986).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+growth+and+aging+of+Caenorhabditis+elegans+in+the+presence+of+fluorodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine.</a> Journal of Gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).</li>
<li>Weicksel, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+molecule+that+disrupts+a+key+event+during+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel small molecule that disrupts a key event during the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> Development. 143 (19), 3540-3548 (2016).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PloS One. 13 (3), 0193989(2018).</li>
<li>Toth, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+sprouting+and+synapse+deterioration+in+the+aging+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, (2015).</li>
<li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li>
<li>Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+dsRNA+feeding+libraries+to+generate+robust+loss-of-function+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene knockdown in C. elegans using dsRNA feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50693(2013).</li>
</ol>

Charakterystyka molekularnych mechanizmów eliminacji agregatów i organelli in vivo w postaci dużych egzoferów jest w powijakach. Pytania dotyczące przeznaczenia ładunków do wydalenia, spolaryzowanego zbierania tych ładunków w komórce, regulacji decyzji o wytwarzaniu egzoferów, maszynerii pośredniczącej w wytłaczaniu oraz interakcji egzoferów z maszynerią degradacyjną w sąsiedniej komórce, wszystkie pozostają do rozwiązania. Co więcej, wizualizacja in vivo połączeń rurkowych, które mogą przechodzić przez materiał biologiczny, w tym wapń, agregaty i mitochondria, jest sama w sobie interesującą i niedostatecznie zbadaną biologią. Pytania o to, dlaczego niektóre komórki są bardziej podatne na produkcję egzoferów niż inne, również pozostają nierozwiązane, ale mogą zacząć być genetycznie preparowane za pomocą podejść opisanych w tym protokole.
W niniejszym protokole szczegółowo opisano podejścia do osiągania powtarzalnej punktacji produkcji eksopferów, ze zwróceniem uwagi na odróżnianie egzoferów od pobliskich komórek somów, czas analiz w celu uchwycenia szczytu produkcji eksopferów oraz ścisłą kontrolę warunków wzrostu w celu wyeliminowania niezamierzonych stresów, które mogą modulować poziomy eksoferów. Zarówno rozróżnienie dużego wczesnego egzoferu, jak i dyspersja "gwiaździstej nocy" w otaczającej tkance podskórnej mogą być ilościowo określone ilościowo jako dowód na wytwarzanie egzoferów. Biorąc to pod uwagę, neurony wyrażające mCherry w warunkach podstawowych są najczęściej związane z 5-25% neuronów określonego typu wytwarzających egzofer. Kontrolowane wprowadzenie warunków stresu może być zastosowane w celu zwiększenia produkcji eksopferów do wykrywania nawet 90% neuronów wytwarzających ekstruzje, co jest szczególnie przydatne w genetycznych lub farmakologicznych badaniach przesiewowych modyfikatorów.
W ludzkiej chorobie neurodegeneracyjnej duże agregaty mogą przenosić się z chorych neuronów do sąsiednich komórek, aby sprzyjać rozprzestrzenianiu się patologii. Mechanizm egzoferii może transpirować za pośrednictwem konserwatywnego mechanizmu używanego do ekstruzji agregatów w całej gromadzie. Zdefiniowanie cząsteczek in vivo , które albo zwiększają efektywność tego procesu (co uważa się za bardziej skuteczną kontrolę proteostazy), albo go blokują, może zostać wykorzystane do opracowania nowych strategii zwalczania wielu chorób neurodegeneracyjnych. W związku z tym opisany tutaj protokół może być stosowany do klasycznych badań przesiewowych mutagenezy genetycznej, badań przesiewowych RNAi całego genomu, które systematycznie niszczą geny w celu identyfikacji wzmacniaczy i supresorów, lub do badań interwencyjnych leków, które identyfikują potencjalne modyfikatory farmakologiczne tego procesu. Podejście jest proste, choć nieco pracochłonne. Egzofery są tak duże, że można je oglądać za pomocą mikroskopu preparacyjnego o dużym powiększeniu. Mimo to neurony C. elegans są stosunkowo małe i patrzenie na ich organelle lub błony wymaga obrazów konfokalnych o większej mocy i jest powolnym procesem. Opcje zapewniające wyższą przepustowość mogą obejmować metody obrazowania o wysokiej zawartości w formacie płytek wielodołkowych.
Zastosowanie ustandaryzowanego podejścia do punktacji egzoferów powinno leżeć u podstaw skoordynowanej genetycznej analizy procesu, w którym neurony mogą organizować i eliminować szczątki komórkowe.

Neurotoksyczne wyzwania związane z agregatami i dysfunkcyjnymi mitochondriami od dawna uważane są za nieodłączne od komórki, ale ostatnio stało się jasne, że nieprawidłowo sfałdowane białka chorób ludzkich pochodzące z jednego neuronu mogą również rozprzestrzeniać się na sąsiednie komórki, promując patologię1. Podobnie, mitochondria ssaków mogą zostać wysłane z komórki ich pierwotnej produkcji w celu degradacji transkomórkowej2 lub w celu uratowania populacji mitochondriów w zagrożonych sąsiednich komórkach3. Na ogół zaobserwowano, że pęcherzyki o różnych rozmiarach przenoszą materiał komórkowy do sąsiednich komórek lub do płynnego otoczenia4. Niektóre wytłaczane pęcherzyki zbliżają się do wielkości przeciętnej somy neuronalnej (średni dotyk neuronu soma ~ 6 μm) i mogą pomieścić duże agregaty i organelle.
Uderzający przykład wytłaczania dużych pęcherzyków, które mogą przenosić agregaty białkowe i organelle, występuje w neuronach receptora dotyku C. elegans, które wyrażają konstrukt reporterowy o wysokiej liczbie kopii, kodując szkodliwy, podatny na agregację, odporny na degradację mCherry5. Wytłoczenia z neuronów dotykowych, zwane egzoferami, mają średnią średnicę ~4 μm, selektywnie obejmują mCherry lub inne agregaty i są dostarczane bezpośrednio do sąsiedniej tkanki podskórnej, która normalnie otacza neurony receptora dotyku. Tkanka podskórna próbuje degradacji opartej na lizosomach, ale niektóre niestrawne treści, takie jak agregaty mCherry, mogą być ponownie wytłaczane przez tkankę podskórną do wypełnionego płynem pseudocoelom zwierzęcia, z którego mCherry może zostać pobrana przez odległe komórki zmiatacze zwane celomocytami do długotrwałego przechowywania (Rysunek 1, Rysunek 2)5.
Duże, ekstrudowane pęcherzyki egzoferowe opuszczają komórkę otoczoną błoną plazmatyczną receptora dotyku i mogą zawierać zagregowane białka chorób ludzkich, mitochondria i lizosomy. Wydaje się, że proces produkcji egzoferów obejmuje sortowanie potencjalnie toksycznych gatunków (na przykład mCherry ulega ekspresji podatnej na agregację, jest oddzielany od rozpuszczalnych, nieszkodliwych białek, takich jak GFP, które pozostają głównie w somie neuronalnej). W ten sposób ukierunkowane wydalenie zagrażających istot jest realizowane przez neuron5. Wyzwanie proteostazy, takie jak stres wywołany przez knockdown autofagii, hamowanie proteasomu za pośrednictwem MG132 lub transgeniczna ekspresja ludzkich białek chorobowych, takich jak ekspandowana poliglutamina Q128 związana z chorobą Huntingtona lub związany z chorobą Alzheimera fragment Aβ1-42, może zwiększyć liczbę neuronów, które wytwarzają egzofery5.
Ponieważ egzofery dopiero niedawno zostały udokumentowane, to, co wiadomo o ich biologii, zasługuje na opis. Egzofery zostały odkryte w neuronach receptorów dotyku C. elegans i są najlepiej przebadane. Istnieje sześć mechanosensorycznych neuronów dotykowych C. elegans, które mają ciała komórkowe rozmieszczone wokół ciała (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A) i nazywane są komórkami mikrotubul, ponieważ ich ultrastruktura zawiera charakterystyczne 15 mikrotubul protofilamentowych. Neurony receptora dotyku to przedni AVM (przedni brzuszny neuron mikrotubulowy), ALMR i ALML (przednie boczne neurony mikrotubul prawe i lewe), bardziej centralny PVM (tylny brzuszny neuron mikrotubulowy) oraz tylne PLMR i PLML (tylne boczne neurony mikrotubul prawe i lewe) w ogonie. Co ciekawe, sześć neuronów receptorów dotyku wytwarza egzofery w różnym tempie, pomimo ekspresji tego samego ofensywnego transgenu (<silna klasa = "xfig">Figura 3C). Spośród sześciu neuronów mechanosensorycznych receptorów dotyku, neuron ALMR ulega egzofergenezie częściej niż inne neurony dotykowe. Kwantyfikacja liczb egzoferów z neuronów dotykowych jest zatem zwykle ustalana poprzez skupienie się na ALMR.
Egzofereneza to dynamiczny proces, który zazwyczaj zaczyna się od obrzęku cytoplazmy neuronalnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-B). Zawartość komórkowa, organelle lub agregaty białkowe są zbierane po jednej stronie somy neuronalnej, najczęściej w kierunku tylnego końca neuronu ALMR (z dala od wystającego neurytu), tworząc domenę przedegzopową (PED) (<silna klasa = "xfig">Figura 1B). Wczesny występ obserwuje się, gdy PED zaczyna wychodzić na zewnątrz, tworząc rozpoznawalny wystający pączek. Późny pączek jest definiowany, gdy najszersza średnica domeny przed-eksopherowej jest w przybliżeniu o 1/3 większa niż średnica zwężenia szyjki soma-eksophera (<silna klasa="xfig">Ryc. 1C). Egzofery mogą być wyrzucane w prawie każdym kierunku z somy, ale większość egzoferów wychodzi z tyłu ciała komórki i pozostaje w przybliżeniu w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co soma źródłowa.
Eksofer może oddalać się od somy, z której pochodzi, gdy szyjka pąka zwęża się do cienkiego włókna. Egzosfery mogą pozostać przyczepione do somy za pośrednictwem tego włókna (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D, strzałka) i mogą później ulec odłączeniu. Zawartość komórkowa, taka jak wapń, agregaty i mitochondria, może być przenoszona za pośrednictwem tego włókna do dołączonego exopher5, chociaż większość wytłaczanego materiału jest umieszczana w komorze eksophera przez masowe pączkowanie. Egzofery uważa się za dojrzałe, gdy nie ma widocznej rurki łączącej lub cienkiego włókna, a eksofer jest całkowicie oddzielony od wysyłającej somy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1E).
Egzofery wytwarzane przez neurony dotykowe C. elegans natychmiast napotykają tkankę podskórną, która otacza neuron dotykowy. Najczęściej pęcherzyk egzoferowy wydaje się przemieszczać w obrębie tkanki podskórnej do tyłu w kierunku ogona i może być dość daleko od somy, zanim zawartość egzoferu wydaje się być przeznaczona do degradacji (na przykład odległość może wynosić ~100 μm od somy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1F)). Fluorescencyjny pęcherzyk egzoferowy rozpada się na wiele mniejszych pęcherzyków w obrębie tkanki podskórnej, przybierając wygląd określany jako "gwiaździsta noc" (<silna klasa="xfig">Ryc. 1G i <silna klasa="xfig">Ryc. 2). W fazie "gwiaździstej nocy" można zaobserwować punktowy materiał fluorescencyjny rozproszony po syncytium podskórnym w wielu mniejszych punktach fluorescencji w porównaniu z pierwotnym pojedynczym egzoferem. Gwiaździsta noc może wyglądać na punktową w małym powiększeniu, a przy większym powiększeniu może wyglądać na punktową i/lub połączoną w sieć w obrębie tkanki podskórnej. Sygnał fluorescencyjny gwiaździstej nocy jest zazwyczaj ciemniejszy niż eksofer i fluorescencja wyrażana neuronalnie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B-C). Uważa się, że dyspersja mCherry w wielu punktowych pęcherzykach obejmuje dojrzewanie fagosomu i fuzję z siecią endosomalną / lizosomalną komórki podskórnej. Niektóre materiały egzoferowe są prawdopodobnie degradowane w podskórnej sieci lizosomalnej, ale szczątkowe gatunki, które są odporne na degradację (takie jak agregaty mCherry) są wyrzucane z tkanki podskórnej do pseudocoelom, płynnego przedziału, który może zawierać resztki komórkowe. Materiał fluorescencyjny jest później pobierany przez odległe komórki zmiatacze zwane celomocytami (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C), które mogą koncentrować, przechowywać i ponownie próbować degradacji mCherry.
Zjawisko ekstruzji i transferu agregatów wydaje się być zachowane w całej typie, zostało odnotowane w modelach genetycznych, takich jak C. elegans5,6,7 i D. melanogaster8,9, a także w wielu modelach ssaków. Egzoferowe ekstruzje zostały zgłoszone dla komórek ssaków10, co sugeruje, że konserwatywne mechanizmy mogą leżeć u podstaw wydalania agregatów i organelli. Produkcja egzoferów może być zatem konserwatywnym mechanizmem zarządzania resztkami komórkowymi, który stanowi podstawową, ale wcześniej nierozpoznaną, gałąź proteostazy neuronalnej i kontroli jakości mitochondriów, która, gdy jest niezrównoważona, może aktywnie przyczyniać się do chorób neurodegeneracyjnych. Identyfikacja cząsteczek biorących udział w rozróżnianiu i sortowaniu szczątków, transporcie do odrębnej lokalizacji subkomórkowej, ekstruzji, tworzeniu/rozcinaniu połączenia rurkowego łączącego somę i późny egzofer oraz rozpoznawaniu dużego wytłaczanego pęcherzyka do odległej degradacji przez sąsiednią komórkę pozostaje do przyszłych prac. Badania na modelach nicieni i much będą miały kluczowe znaczenie dla zdefiniowania mechanizmów zbierania i przenoszenia agregatów i organelli, wykorzystując bezstronne podejścia genetyczne i potężne narzędzia biologiczne oferowane przez te modele w celu identyfikacji uczestniczących cząsteczek w kontekście fizjologicznym.
Kluczowe pierwsze kroki w rozszyfrowywaniu mechanizmów działających w biologii egzoferów obejmują zdefiniowanie protokołów odtwarzalnej kwantyfikacji egzoferów in vivo. Model C. elegans oferuje szczególną zaletę dla takich wysiłków, ponieważ ciało jest przezroczyste, a egzofery można łatwo zaobserwować, gdy zawierają fluorescencyjnie znakowane białka lub organelle. Doniesiono, że egzofery są generowane przez neurony dopaminergiczne C. elegans, neurony czuciowe PDE i, ASE i ASER oraz neurony amfidowe wypełniające barwniki5. Ponieważ egzofery wytwarzane przez neurony receptorów dotyku są najlepiej scharakteryzowane, skupiono się tutaj na wykorzystaniu neuronów dotykowych do analizy egzoferów. Jednak podstawowe podejście można zastosować do pomiaru produkcji egzoferów z dowolnej komórki. Przedstawiono protokoły wykrywania i ilościowego oznaczania egzoferów wytwarzanych przez neurony receptora dotyku C. elegans, które transgenicznie eksprymują białko mCherry, z naciskiem na ładunki, które można monitorować, oraz ograniczenia czasowe w punktacji. W tym artykule zdefiniowano podejścia do identyfikacji egzoferów in vivo oraz ilościowe określenie warunków środowiskowych i genetycznych, które modulują produkcję egzoferów. Protokoły kładą nacisk na stałe warunki bezstresowe w celu określenia wyjściowej produkcji eksopferów i porównań między genotypami.

<table><tbody><tr><td>95B Naukowa kamera CMOS</td><td>Fotometria Prime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu; L końcówki o niskiej retencji</td><td>Pipeta serologiczna Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml</td><td>Appleton Woods</td><td>CC214</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L końcówki o niskiej retencji</td><td>Sarstedt</td><td>70.1130.105</td><td></td></tr><tr><td>13% podchloryn sodu</td><td>Acros Organics</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera o pojemności 2 l</td><td>Zaopatrzenie laboratorium naukowego</td><td>FLA4036</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 ml</td><td>Appleton Woods</td><td>CC216</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; L końcówki o niskiej retencji</td><td>Sarstedt</td><td>70.765.105</td><td></td></tr><tr><td>50 ml pipeta serologiczna</td><td>Appleton Woods</td><td>CC117</td><td></td></tr><tr><td>5-fluoro-2'-deoksyurydyna 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497.ME</td><td></td></tr><tr><td>9 cm sterylne szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>11309283</td><td></td></tr><tr><td>etanol absolutny</td><td>Vwr</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans szczep dziki</td><td>Dostarczany przez CGC</td><td>N2</td><td>C. elegans szczep</td></tr><tr><td>dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>Acros</td><td>110190250</td><td></td></tr><tr><td>dwuzasadowy fosforan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>E. coli szczep OP50</td><td>Dostarczany przez CGC</td><td>Op50</td><td>Szczep E coli</td></tr><tr><td>Mikroskop standardowy FBS10</td><td>Instrumenty Meyera</td><td>KSC 410-1-100-1</td><td>FBS10 Standard z podstawą płytkową, głowicą trójokularową 100/100 i</td></tr> szklaną pipetą zmiennoogniskową <tr>Fisherbrand<td>270 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50255</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermofisher scientific</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>Rozsiewacze do zaszczepiania</td><td>Fisher Scientific</td><td>11821741</td><td></td></tr><tr><td>LB medium kapsułki</td><td>MP biomedicals</td><td>3002-031</td><td></td></tr><tr><td>LDI &ndash; Oświetlacz diod laserowych</td><td>89 North</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lewamizol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16595-80-5</td><td></td></tr><tr><td>M4 multipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000012</td><td></td></tr><tr><td>siarczan magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>monozasadowy fosforan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Multitron Standard inkubator wytrząsający</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td>INFO28573</tr><tr><td>Nalgene 1 L Naczynia wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P10</td><td>Pipeta Eppendorf Research Plus</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Pipeta Eppendorf Research Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>pipeta 2</td><td>VWR</td><td>612-0927</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki polistyrenowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00131491</td><td></td></tr><tr><td>RC5C plus wirówka podłogowa</td><td>Sorvall</td><td>9900884</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka cytologiczne wielokrotnego użytku z pierścieniem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22037242</td><td></td></tr><tr><td>SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>GFP wyrażany w neuronach dotykowych</td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13422</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/4880/53</td><td></td></tr><tr><td>Tactrol 2 Autoklaw</td><td>Priorclave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Thermofisher scientific</td><td>28313</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit</td><td>CrestOptics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]</td><td>kontrakt Driscoll lab</td><td></td><td>mCherry wyrażony w neuronach dotykowych</td></tr><tr><td>ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]</td><td>kontrakt Driscoll lab</td><td></td><td>Q128 wyrażony w neuronach dotykowych</td></tr><tr><td>ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]</td><td>kontrakt Driscoll lab</td><td></td><td>mitoROGFP wyrażony w neuronach dotykowych</td></tr><tr><td>ZB4528 bzIs166[Pmec-4mWiśnia]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]</td><td>kontrakt Driscoll laboratoryjny</td><td></td><td>marker autofagii wyrażony w neuronach</td></tr><tr><td>dotykowych ZEISS Axio Vert.A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u c. elegans

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toksyczność nieprawidłowo sfałdowanych białek i dysfunkcja mitochondriów są kluczowymi czynnikami, które sprzyjają związanemu z wiekiem funkcjonalnemu spadkowi neuronów i chorobom neurodegeneracyjnym u różnych gatunków. Chociaż te neurotoksyczne wyzwania od dawna są uważane za nieodłączne od komórek, obecnie istnieją znaczne dowody na to, że nieprawidłowo sfałdowane białka chorób ludzkich pochodzące z jednego neuronu mogą pojawiać się w sąsiednich komórkach, co jest zjawiskiem proponowanym do promowania rozprzestrzeniania się patologii w ludzkiej chorobie neurodegeneracyjnej.
C. elegans dorosłe neurony, które wyrażają białka agregujące, mogą wydzielać duże (~4 μm) pęcherzyki otoczone błoną, które mogą zawierać zagregowane białka, mitochondria i lizosomy. Te duże pęcherzyki nazywane są "egzoferami" i różnią się od egzosomów (które są około 100 razy mniejsze i mają różną biogenezę). Wyrzucanie szczątków komórkowych w egzoferach może zachodzić przez konserwatywny mechanizm, który stanowi podstawową, ale wcześniej nierozpoznaną, gałąź proteostazy neuronalnej i kontroli jakości mitochondriów, istotną dla procesów, w których agregaty rozprzestrzeniają się w ludzkich chorobach neurodegeneracyjnych.
Podczas gdy egzofery były głównie badane u zwierząt, które wykazują wysoką kopię transgenicznego mCherry w neuronach dotykowych, te protokoły są równie przydatne w badaniu egzoferenezy przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych organelli lub innych interesujących białek w różnych klasach neuronów.
Opisane tutaj są cechy fizyczne egzoferów C. elegans, strategie ich wykrywania, kryteria identyfikacji, optymalny czas na oznaczanie ilościowe oraz protokoły wzrostu zwierząt, które kontrolują stres, który może modulować poziom produkcji egzoferów. Przedstawione tutaj szczegóły protokołów powinny posłużyć do ustanowienia standardu analizy ilościowej egzoferów w różnych laboratoriach. Dokument ten ma służyć jako źródło informacji w tej dziedzinie dla laboratoriów dążących do opracowania mechanizmów molekularnych, za pomocą których wytwarzane są egzofery i za pomocą których egzofery są reagowane przez sąsiednie i odległe komórki.

Ten protokół opisuje podejścia do wykrywania i ilościowego oznaczania dużych zagregowań i/lub organelli (~4 μm) wytwarzanych przez komórki C. elegans w postaci egzoferów związanych z błoną. Opisujemy szczepy, warunki wzrostu, kryteria punktacji, czas i rozważania mikroskopowe potrzebne do ułatwienia sekcji tego mechanizmu wydalania gruzu.

Ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Charakteryzujemy mechanizmy in vivo wytłaczania agregatów i organelli z neuronów w procesie zwanym egzofergenezą, słabo poznaną biologią, która prawdopodobnie ma znaczenie dla rozprzestrzeniania się patologii chorób neurodegeneracyjnych. Podejścia te są niezbędne do osiągnięcia powtarzalnej punktacji ekstrudowanych egzofer neuronalnych i demonstrują platformę do mechanistycznego rozwarstwiania eliminacji śmieci komórkowych poprzez transfer neuronalny do sąsiednich komórek. Zdefiniowanie in vivo mechanizmów wyrzucania agregatów przez neurony może w rzeczywistości wpłynąć na projektowanie nowych strategii wspomagających leczenie chorób neurodegeneracyjnych u ludzi.W przypadku warunków podstawowych trzymaj C.Elegans w tym samym wieku biologicznym w stałej temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby zobrazować na żywo dynamikę wewnątrzkomórkową i charakterystykę egzofergenezy, umieść do 20 zwierząt na podkładce agaros na szklanym szkiełku mikroskopowym i unieruchom. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na sparaliżowanych robakach i umieść szkiełko na stoliku konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.Użyj obiektywu o powiększeniu od 10 do 40x, aby zidentyfikować pożądaną płaszczyznę Z w Brightfield, notując położenie robaka, orientację ogona głowy i położenie sromu, które są punktami orientacyjnymi do późniejszej identyfikacji neuronów i egzoferów. Pozostając w tej samej płaszczyźnie Z, przełącz się na oglądanie fluorescencji w szerokim polu od 10 do 40x dla wybranego reportera cytozolowego i przewiń w obrębie osi Z, aby obserwować głębokość zwierzęcia i ekspresję fluorescencji w płaszczyźnie ogniskowej. Głowa będzie miała fluorescencyjny pierścień nerwowy, a bardziej spiczasty ogon będzie zawierał jedną do dwóch widocznych tylnych bocznych somów neuronów dotykowych.Większe powiększenie z soczewką 63x może pomóc w identyfikacji pierścienia nerwowego, procesów neuronalnych i ciał somatycznych. W pierwszej kolejności pomocne jest zidentyfikowanie pierścienia nerwowego znajdującego się w głowie zwierzęcia i bocznych wyrostków neuronalnych. Aby to zrobić, zacznij od głowy robaka i powoli przewijaj przez oś Z, aby zidentyfikować płaszczyznę pierścienia nerwowego, do której przyczepione są procesy neuronalne.Po zidentyfikowaniu pierścienia nerwowego, w widoku fluorescencyjnym podążaj za przyczepionym wyrostkiem neuronalnym bocznie w kierunku tylnym w kierunku sromu, gdzie soma będzie widoczna. Gdy okrągłe ciało lub ciała somy są w centrum uwagi, ważne jest, aby zidentyfikować wszystkie neurony w pobliżu. Aby zidentyfikować neuron dotykowy, najpierw znajdź ALML, ALMR i somę AVM, które powinny być najjaśniejszymi sygnałami i oznaczone okrągłym ciałem komórki na końcu procesu.Po zlokalizowaniu najbardziej ostrej somy neuronalnej użyj komórki AVM, komórki brzusznej, aby pomóc w przypisaniu orientacji. Jeśli neuron AVM znajduje się w tej samej płaszczyźnie co ALM, oznacza to, że zwierzę spoczywa na boku, a neuron boczny to ALMR. Jeśli neuron AVM nie znajduje się w tej samej płaszczyźnie co dany ALM, neuronem dotykowym znajdującym się najbliżej płaszczyzny ogniskowej jest neuron ALML.Pomocne jest również zidentyfikowanie neuronu PVM, który jest brzusznym neuronem dotykowym znajdującym się w pobliżu ogona. Płaszczyzna ostrości PVM wskaże, czy przedni neuron dotykowy to ALML czy ALMR. Jeśli dany ALM znajduje się w tej samej płaszczyźnie co PVM, to obserwowany neuron dotykowy jest neuronem ALML.Po zidentyfikowaniu i przypisaniu najbardziej ostrego ALM, ważne jest, aby określić pozycje innych ciał soma w pobliżu obszaru zainteresowania i we wszystkich płaszczyznach Z, aby nie pomylić ich z egzoferami. Po zlokalizowaniu interesującego neuronu dotykowego, ALMR lub ALML sprawdza neuron pod kątem dużych, wystających domen egzoferów, wystarczająco dużych, aby można je było uznać za egzofer pączka, który jest co najmniej jedną piątą wielkości pierwotnej somy. Jeśli nie zaobserwuje się domeny pączka lub egzoferu, należy dokładniej sprawdzić somę neuronalną pod kątem dołączonego cienkiego włókna emanującego z ciała somy.Dołączone egzofery zwykle znajdują się bliżej somy źródłowej i w podobnej płaszczyźnie Z. Aby zidentyfikować nieprzyłączony egzofer, poszukaj skoncentrowanych wydalonych białek fluorescencyjnych, które często są jaśniejsze niż soma. Chociaż jest to przedstawione, jest to jeden duży egzofer.Może istnieć więcej niż jedna jednostka fluorescencyjna pochodząca z jednej somy. Szukaj nieprzyczepionych egzoferów w różnych płaszczyznach ogniskowych i w odległym obszarze bocznym, z którego znaleziono somę, z której pochodzi. Egzofery zazwyczaj wystają z somy w kierunku tylnym od wyrostka neuronalnego.Sprawdź, czy nie ma dużych kulistych obiektów, które nie są ustawione i zidentyfikowane jako somy neuronalne. Chociaż egzofery są zazwyczaj strukturami duszotwórczymi, z czasem mogą ulec degradacji, uzyskując bardziej nieregularny kształt. Szukaj obecności wydarzeń gwiaździstej nocy i przypadków wielu wydarzeń egzoferyjnych.Aby uniknąć pomylenia somy spoza płaszczyzny z egzoferem, bardzo ważne jest, aby zidentyfikować wszystkie pobliskie ciała soma, nawet nieostre somy na początku obserwacji. Można zaobserwować rozszerzoną lub spiczastą somę, ale rozszerzenie bez wyraźnego miejsca zwężenia nie powinno być oceniane jako egzofer. Odrzuć małe, rozdzielone pąki, które nie osiągają jednej piątej wielkości somy w kwantyfikacji zdarzenia egzoferu.Chociaż dojrzałe neuryty mogą się dramatycznie rozszerzać wraz z wiekiem, a białka fluorescencyjne mogą migrować do dystalnego końca takich struktur, nie należy liczyć wyrostków neurytów jako egzoferów. Aby zidentyfikować jednostki fluorescencyjne, które nie są egzoferami, należy wykluczyć jakąkolwiek autofluorescencję, która może być mylona z resztkami pęcherzykowymi gwiaździstej nocy pod wpływem fluorescencji szerokokątnej. Aby wykluczyć embrionalne sygnały fluorescencyjne, przełącz się między fluorescencją a oświetleniem jasnego pola i sprawdź związek sygnału z komórkami jajowymi w macicy.Poniższa tabela zawiera podsumowanie różnych fluorescencyjnych reporterów wyrażanych przez neurony dotykowe, które zostały wykorzystane do monitorowania produkcji egzoferów. Ładunki, o których wiadomo, że są wytłaczane w egzoferach, obejmują agregaty, takie jak Q128, fuzja ludzkich powtórzeń ekspandowanej poliglutaminy Huntingtona, lizosomy GFP oznaczone lizosomalnym białkiem błonowym związanym z izosomalem oraz mitochondria oznaczone GFP zlokalizowanym w macierzy. Cytoplazmatyczny GFP nie jest silnie wydalany i jest preferencyjnie zatrzymywany w somie, chociaż GFP może być używany do słabej wizualizacji egzoferów.Ogólnie rzecz biorąc, wytwarzanie egzoferów przez mCherry wyrażające neuron ALMR w warunkach podstawowych rozpoczyna się w pierwszym dniu dorosłości i waha się od około pięciu do 25% ALMR badanych w głównych ramach czasowych produkcji egzoferów od pierwszego do trzeciego dnia dorosłego. Szczególne stresy i perturbacje genetyczne mogą znacznie zwiększyć produkcję egzoferów w neuronach ALMR. Bardzo ważne jest, aby zlokalizować wszystkie pobliskie neurony przed sprawdzeniem interesującego neuronu i jego okolic pod kątem domen egzoferów, nienaruszonych egzoferów lub wydarzeń gwiaździstych nocy.Jeśli czujesz się komfortowo z ręczną identyfikacją egzofer, można zastosować metody o zwiększonej przepustowości do badań przesiewowych na dużą skalę przy użyciu obrazowania o wysokiej zawartości, umożliwiając analizę całego genomu i mechanistyczną sekcję egzofergenezy.

quantitative-approaches-for-scoring-vivo-neuronal-aggregate-organelle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to ogólnotkankowe zastosowanie nanoskalowej rozdzielczości EM. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę nanotomii stosowaną do badania mózgu larw danio pręgowanego w zdrowiu i po nieinwazyjnym uszkodzeniu mózgu.

Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Produkty translacyjne związane z powtarzalnością, niezależne, są wyłaniającymi się cechami patogennymi kilku powtarzających się chorób opartych na ekspansji. Celem opisanego protokołu jest ocena toksyczności spowodowanej przez te peptydy przy użyciu testów behawioralnych i komórkowych w systemie modelowym C. elegans.

Pomiar toksyczności peptydów RAN u C. elegans

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

Poznaj mechanizmy egzoferogenezy w neuronach C. elegans przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda umożliwia ilościową ocenę ekstruzji agregatów białkowych i organelli z komórek nerwowych.

Ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów