Ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u C. elegans
18 września 2020
Ten protokół opisuje podejścia do wykrywania i ilościowego oznaczania dużych zagregowań i/lub organelli (~4 μm) wytwarzanych przez komórki C. elegans w postaci egzoferów związanych z błoną. Opisujemy szczepy, warunki wzrostu, kryteria punktacji, czas i rozważania mikroskopowe potrzebne do ułatwienia sekcji tego mechanizmu wydalania gruzu.
Charakteryzujemy mechanizmy in vivo wytłaczania agregatów i organelli z neuronów w procesie zwanym egzofergenezą, słabo poznaną biologią, która prawdopodobnie ma znaczenie dla rozprzestrzeniania się patologii chorób neurodegeneracyjnych. Podejścia te są niezbędne do osiągnięcia powtarzalnej punktacji ekstrudowanych egzofer neuronalnych i demonstrują platformę do mechanistycznego rozwarstwiania eliminacji śmieci komórkowych poprzez transfer neuronalny do sąsiednich komórek. Zdefiniowanie in vivo mechanizmów wyrzucania agregatów przez neurony może w rzeczywistości wpłynąć na projektowanie nowych strategii wspomagających leczenie chorób neurodegeneracyjnych u ludzi.
W przypadku warunków podstawowych trzymaj C.Elegans w tym samym wieku biologicznym w stałej temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby zobrazować na żywo dynamikę wewnątrzkomórkową i charakterystykę egzofergenezy, umieść do 20 zwierząt na podkładce agaros na szklanym szkiełku mikroskopowym i unieruchom. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na sparaliżowanych robakach i umieść szkiełko na stoliku konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.
Użyj obiektywu o powiększeniu od 10 do 40x, aby zidentyfikować pożądaną płaszczyznę Z w Brightfield, notując położenie robaka, orientację ogona głowy i położenie sromu, które są punktami orientacyjnymi do późniejszej identyfikacji neuronów i egzoferów. Pozostając w tej samej płaszczyźnie Z, przełącz się na oglądanie fluorescencji w szerokim polu od 10 do 40x dla wybranego reportera cytozolowego i przewiń w obrębie osi Z, aby obserwować głębokość zwierzęcia i ekspresję fluorescencji w płaszczyźnie ogniskowej. Głowa będzie miała fluorescencyjny pierścień nerwowy, a bardziej spiczasty ogon będzie zawierał jedną do dwóch widocznych tylnych bocznych somów neuronów dotykowych.
Większe powiększenie z soczewką 63x może pomóc w identyfikacji pierścienia nerwowego, procesów neuronalnych i ciał somatycznych. W pierwszej kolejności pomocne jest zidentyfikowanie pierścienia nerwowego znajdującego się w głowie zwierzęcia i bocznych wyrostków neuronalnych. Aby to zrobić, zacznij od głowy robaka i powoli przewijaj przez oś Z, aby zidentyfikować płaszczyznę pierścienia nerwowego, do której przyczepione są procesy neuronalne.
Po zidentyfikowaniu pierścienia nerwowego, w widoku fluorescencyjnym podążaj za przyczepionym wyrostkiem neuronalnym bocznie w kierunku tylnym w kierunku sromu, gdzie soma będzie widoczna. Gdy okrągłe ciało lub ciała somy są w centrum uwagi, ważne jest, aby zidentyfikować wszystkie neurony w pobliżu. Aby zidentyfikować neuron dotykowy, najpierw znajdź ALML, ALMR i somę AVM, które powinny być najjaśniejszymi sygnałami i oznaczone okrągłym ciałem komórki na końcu procesu.
Po zlokalizowaniu najbardziej ostrej somy neuronalnej użyj komórki AVM, komórki brzusznej, aby pomóc w przypisaniu orientacji. Jeśli neuron AVM znajduje się w tej samej płaszczyźnie co ALM, oznacza to, że zwierzę spoczywa na boku, a neuron boczny to ALMR. Jeśli neuron AVM nie znajduje się w tej samej płaszczyźnie co dany ALM, neuronem dotykowym znajdującym się najbliżej płaszczyzny ogniskowej jest neuron ALML.
Pomocne jest również zidentyfikowanie neuronu PVM, który jest brzusznym neuronem dotykowym znajdującym się w pobliżu ogona. Płaszczyzna ostrości PVM wskaże, czy przedni neuron dotykowy to ALML czy ALMR. Jeśli dany ALM znajduje się w tej samej płaszczyźnie co PVM, to obserwowany neuron dotykowy jest neuronem ALML.
Po zidentyfikowaniu i przypisaniu najbardziej ostrego ALM, ważne jest, aby określić pozycje innych ciał soma w pobliżu obszaru zainteresowania i we wszystkich płaszczyznach Z, aby nie pomylić ich z egzoferami. Po zlokalizowaniu interesującego neuronu dotykowego, ALMR lub ALML sprawdza neuron pod kątem dużych, wystających domen egzoferów, wystarczająco dużych, aby można je było uznać za egzofer pączka, który jest co najmniej jedną piątą wielkości pierwotnej somy. Jeśli nie zaobserwuje się domeny pączka lub egzoferu, należy dokładniej sprawdzić somę neuronalną pod kątem dołączonego cienkiego włókna emanującego z ciała somy.
Dołączone egzofery zwykle znajdują się bliżej somy źródłowej i w podobnej płaszczyźnie Z. Aby zidentyfikować nieprzyłączony egzofer, poszukaj skoncentrowanych wydalonych białek fluorescencyjnych, które często są jaśniejsze niż soma. Chociaż jest to przedstawione, jest to jeden duży egzofer.
Może istnieć więcej niż jedna jednostka fluorescencyjna pochodząca z jednej somy. Szukaj nieprzyczepionych egzoferów w różnych płaszczyznach ogniskowych i w odległym obszarze bocznym, z którego znaleziono somę, z której pochodzi. Egzofery zazwyczaj wystają z somy w kierunku tylnym od wyrostka neuronalnego.
Sprawdź, czy nie ma dużych kulistych obiektów, które nie są ustawione i zidentyfikowane jako somy neuronalne. Chociaż egzofery są zazwyczaj strukturami duszotwórczymi, z czasem mogą ulec degradacji, uzyskując bardziej nieregularny kształt. Szukaj obecności wydarzeń gwiaździstej nocy i przypadków wielu wydarzeń egzoferyjnych.
Aby uniknąć pomylenia somy spoza płaszczyzny z egzoferem, bardzo ważne jest, aby zidentyfikować wszystkie pobliskie ciała soma, nawet nieostre somy na początku obserwacji. Można zaobserwować rozszerzoną lub spiczastą somę, ale rozszerzenie bez wyraźnego miejsca zwężenia nie powinno być oceniane jako egzofer. Odrzuć małe, rozdzielone pąki, które nie osiągają jednej piątej wielkości somy w kwantyfikacji zdarzenia egzoferu.
Chociaż dojrzałe neuryty mogą się dramatycznie rozszerzać wraz z wiekiem, a białka fluorescencyjne mogą migrować do dystalnego końca takich struktur, nie należy liczyć wyrostków neurytów jako egzoferów. Aby zidentyfikować jednostki fluorescencyjne, które nie są egzoferami, należy wykluczyć jakąkolwiek autofluorescencję, która może być mylona z resztkami pęcherzykowymi gwiaździstej nocy pod wpływem fluorescencji szerokokątnej. Aby wykluczyć embrionalne sygnały fluorescencyjne, przełącz się między fluorescencją a oświetleniem jasnego pola i sprawdź związek sygnału z komórkami jajowymi w macicy.
Poniższa tabela zawiera podsumowanie różnych fluorescencyjnych reporterów wyrażanych przez neurony dotykowe, które zostały wykorzystane do monitorowania produkcji egzoferów. Ładunki, o których wiadomo, że są wytłaczane w egzoferach, obejmują agregaty, takie jak Q128, fuzja ludzkich powtórzeń ekspandowanej poliglutaminy Huntingtona, lizosomy GFP oznaczone lizosomalnym białkiem błonowym związanym z izosomalem oraz mitochondria oznaczone GFP zlokalizowanym w macierzy. Cytoplazmatyczny GFP nie jest silnie wydalany i jest preferencyjnie zatrzymywany w somie, chociaż GFP może być używany do słabej wizualizacji egzoferów.
Ogólnie rzecz biorąc, wytwarzanie egzoferów przez mCherry wyrażające neuron ALMR w warunkach podstawowych rozpoczyna się w pierwszym dniu dorosłości i waha się od około pięciu do 25% ALMR badanych w głównych ramach czasowych produkcji egzoferów od pierwszego do trzeciego dnia dorosłego. Szczególne stresy i perturbacje genetyczne mogą znacznie zwiększyć produkcję egzoferów w neuronach ALMR. Bardzo ważne jest, aby zlokalizować wszystkie pobliskie neurony przed sprawdzeniem interesującego neuronu i jego okolic pod kątem domen egzoferów, nienaruszonych egzoferów lub wydarzeń gwiaździstych nocy.
Jeśli czujesz się komfortowo z ręczną identyfikacją egzofer, można zastosować metody o zwiększonej przepustowości do badań przesiewowych na dużą skalę przy użyciu obrazowania o wysokiej zawartości, umożliwiając analizę całego genomu i mechanistyczną sekcję egzofergenezy.
Przegląd
Niniejsze badanie charakteryzuje mechanizmy usuwania agregatów i organelli z neuronów poprzez proces zwany eksoforogenezą, wykorzystując C. elegans jako organizm modelowy. Celem badania jest zrozumienie, w jaki sposób neurony eliminują komórkowe odpady, co ma znaczenie dla patologii chorób neurodegeneracyjnych oraz potencjalnych strategii terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Choroby neurodegeneracyjne
Wstęp
- Eksoforogeneza jest słabo poznanym procesem biologicznym, który ma znaczenie dla gospodarki odpadami komórkowymi w neuronach.
- Zrozumienie tego procesu może wyjaśnić mechanizmy rozprzestrzeniania się patologii w chorobach neurodegeneracyjnych.
- Identyfikacja neuronalnych eksoforów jest kluczowa dla badania ich roli w interakcjach międzykomórkowych.
- Szczegółowe informacje dotyczące warunków hodowli oraz metod mikroskopowych są niezbędne do przeprowadzenia dokładnych obserwacji.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnych metod punktacji w celu ilościowego określenia liczby egzoferów w kontekstach neuronalnych.
- Zbadanie znaczenia biologicznego ekstruzji agregatów i organelli neuronalnych.
- Ułatwienie opracowania potencjalnych strategii terapeutycznych w schorzeniach neurodegeneracyjnych.
Zastosowane metody
- Wykorzystano techniki obrazowania na żywo oraz mikroskopię fluorescencyjną u C. elegans w celu obserwacji egzoferegenezy.
- Zastosowano paraliżowanie nicieni w celu uzyskania precyzyjnych obrazów przy jednoczesnym zachowaniu ich integralności biologicznej.
- Zidentyfikowano wypustki neuronalne i somata przy użyciu różnych powiększeń, aby zapewnić przejrzystość w różnych płaszczyznach Z.
- Opracowano standardowe protokoły pozwalające odróżnić egzofory od innych struktur komórkowych.
Główne wyniki
- Opisano rozmiar i morfologię egzoferów, podkreślając ich odmienność od ciał komórek neuronów.
- Zidentyfikowano kluczowe cechy pozwalające na dokładną ocenę obecności egzoferów pod mikroskopem.
- Stwierdzono, że identyfikacja otaczających struktur neuronalnych jest niezbędna do prawidłowego oliczania egzoferów.
Wnioski
- Badanie przedstawia ramy teoretyczne służące do zrozumienia mechanizmów usuwania odpadów neuronalnych.
- Wgląd w proces egzoferegenezy może dostarczyć informacji dla przyszłych podejść terapeutycznych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych.
- Powtarzalne metodologie oceny i obrazowania torują drogę do dalszych badań nad zdrowiem i chorobami neuronów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie ekstruzji agregatów neuronalnych i organelli poprzez egzoferogenezę dostarcza wglądu w mechanizmy proteostazy oraz szlaki kontroli jakości mitochondriów, które mają istotne znaczenie dla rozprzestrzeniania się patologii w chorobach neurodegeneracyjnych. Ten model oparty na C. elegans umożliwia ilościową ocenę tworzenia egzoferów, co wspiera walidację celów terapeutycznych i screening fenotypowy we wczesnej fazie odkrywania leków. Powtarzalne metody detekcji ułatwiają współpracę międzyfunkcyjną i predykcyjne ograniczanie ryzyka w odniesieniu do hipotez terapeutycznych obejmujących mechanizmy eliminacji odpadów neuronalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z proteostazą neuronalną i szlakami usuwania agregatów.
- Wartość operacyjna: Wspiera biologiczną minimalizację ryzyka poprzez ilościowe określenie tworzenia egzoferów jako funkcjonalnego wskaźnika eliminacji odpadów neuronalnych.
- Wartość prognostyczna: Generuje ilościowe dane na temat tempa produkcji egzoferów w celu określenia pewności co do celu terapeutycznego i podjęcia decyzji dotyczących selekcji portfolio.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Zapewnia system istotny dla przebiegu choroby do przesiewowego badania genetycznych lub farmakologicznych modulatorów egzoferogenezy.
- Wartość operacyjna: Ustanawia zestandaryzowane kryteria identyfikacji egzoferów, umożliwiając powtarzalną kwantyfikację w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Skalowalność: Kompatybilność z obrazowaniem wysokotreściowym (high-content imaging) w celu prowadzenia przesiewów na dużą skalę i analizy mechanistycznej szlaków egzoferogenezy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy produkcję egzosfer neuronalnych z mechanizmami rozprzestrzeniania się agregatów istotnymi dla modeli ludzkich chorób neurodegeneracyjnych.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Wyjaśnia rolę ekstruzji organelli w kontroli jakości mitochondriów, co wpływa na wybór celów w badaniach przedklinicznych.
- Pewność predykcyjna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez korelację poziomów egzosfer ze stresem proteostatycznym i perturbacjami genetycznymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając ilościowy odczyt fenotypowy proteostazy neuronalnej oraz kontroli jakości organelli, co wspiera etapy identyfikacji związków wiodących i walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących genów i związków wpływających na ekstruzję agregatów i organelli z neuronów.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną ocenę tworzenia egzoferów w celu ewaluacji związków i modyfikatorów genetycznych.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary wielkości, częstotliwości i lokalizacji egzoferów, umożliwiając analizę porównawczą w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy egzoferogenezę ze szlakami rozprzestrzeniania się patologii, wspierając dopasowanie biomarkerów w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę do międzyprojektowej oceny mechanizmów eliminacji odpadów neuronalnych w badaniach odkrywczych i przedklinicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez wyjaśnienie mechanizmów ekstruzji agregatów neuronalnych i organelli.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testu dzięki zdefiniowanym kryteriom identyfikacji oraz kontroli warunków hodowli.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach proteostazy neuronalnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ilościowe odczyty fenotypowe egzosfer.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z C. elegans, mikroskopii fluorescencyjnej oraz identyfikacji morfologii neuronów.
- Zależny od systemów obrazowania fluorescencyjnego konfokalnego lub szerokopolowego z obiektywami 10-63x w celu detekcji egzoferów.
- Wymaga standaryzacji wieku zwierząt, temperatury oraz warunków hodowli, aby kontrolować zmienność produkcji egzoferów wywołaną stresem.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy stosowaniu jej do różnych typów neuronów lub reporterów fluorescencyjnych innych niż neurony czucia.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak odróżnianie egzoferów od autofluorescencji, wypustek neurytów oraz struktur somatycznych znajdujących się poza płaszczyzną ogniskowania.
