Name: Model hodowli komórkowej do produkcji zapasów wirusa zapalenia wątroby typu E o wysokim mianie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę produkcji wirusów zapalenia wątroby typu E o wysokim mianie w hodowli komórkowej. Protokół umożliwia uzyskanie cząstek wirusowych z otoczką i bez niej, wspierając badania nad lekami i szczepionkami przeciw HEV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Suzanne Emerson za klon wirusa zapalenia wątroby typu E p6. Surowica hiperimmunologiczna królika specyficzna dla HEV została dzięki uprzejmości Rainera Ulricha z Instytutu Friedricha Loefflera w Niemczech. Ponadto dziękujemy wszystkim pracownikom Zakładu Wirusologii Molekularnej i Medycznej Uniwersytetu Ruhry w Bochum za wsparcie i dyskusję. Rysunki 1-7 zostały wygenerowane za pomocą BioRender.com.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Począwszy od preparatu plazmidowego, wydajność DNA powinna przekraczać 150 ng / μl, aby móc przeprowadzić wielokrotną linearyzację z tego samego zasobu plazmidu, co minimalizuje ryzyko mutagenezy kluczowych sekwencji genomu wywołanej przez bakterie. Ponadto ważne jest, aby sprawdzić trawienie restrykcyjne dla pełnej linearyzacji plazmidu za pomocą elektroforezy żelowej (ryc. 8b). Brak zlinearyzowanego plazmidowego DNA wywołałby amplifikację toczącego się koła, powodując, że transkrypcja in v...

Wirusowe zapalenie wątroby typu E jest dość niedocenianą chorobą, której częstość występowania wzrasta na całym świecie. Około 20 milionów zakażeń powoduje ponad 70 000 zgonów rocznie1. Czynnik podstawowy, wirus zapalenia wątroby typu E (HEV), został niedawno ponownie przypisany i jest obecnie klasyfikowany w rodzinie Hepeviridae, w tym w rodzajach Orthohepevirus i Piscihepevirus. HEV różnego pochodzenia są klasyfikowane w gatunku Orthohepevirus A-D, w tym izolaty od ludzi, świń, królików, szczurów, ptaków i innych ssaków2. Obecnie zidentyfikowano osiem różnych genotypów (GT) jednoniciowego wirusa RNA zorientowanego pozytywnie2. Chociaż różnią się tożsamością sekwencji, drogami transmisji i dystrybucją geograficzną, ich struktura genomowa jest wysoce konserwatywna. Mówiąc dokładniej, genom HEV o długości 7,2 kbp jest podzielony na 3 główne otwarte ramki odczytu (ORF1-3). Podczas gdy ORF1 koduje wszystkie enzymy potrzebne do pomyślnej replikacji w komórce gospodarza, ORF2 koduje białko kapsydu, a białko ORF3 działa jako funkcjonalny kanał jonowy wymagany do składania i uwalniania zakaźnych cząstek3. Po uwolnieniu do podstawnego lub wierzchołkowego światła HEV występuje zarówno u gatunków quasi-otoczonych, jak i nieotoczkowych/nagich, w zależności od tego, czy wirus pochodzi odpowiednio z krwi czy kału4,5.
Podczas gdy GT1 i GT2 występują głównie w krajach rozwijających się, zakażając wyłącznie ludzi6 drogą fekalno-oralną, GT3, GT4 i GT7 występują głównie w krajach rozwiniętych1,7 z różnymi gatunkami służącymi jako rezerwuary, np. świnie8, rat9, chicken10,11, jeleń12, mongoose13, bat14, rabbit15,16, dzik17 i wiele innych7,18,19, dostarczając dowodów na zoonozę7,20,21,22. Oprócz nieodpowiednich warunków sanitarnych23 i skażone produkty spożywcze12,24,25,26, możliwa jest również transfuzja krwi i przeszczepy narządów27,28. HEV jest częstą przyczyną marskości wątroby i niewydolności wątroby29, szczególnie u pacjentów z wcześniej istniejącą chorobą wątroby, osób z obniżoną odpornością (genotyp 3, 4 i 7) oraz kobiet w ciąży (genotyp 1). Warto zauważyć, że istnieją również objawy pozawątrobowe, takie jak choroba układu krwiotwórczego30,31,32, zaburzenia neurologiczne33 i uszkodzenie nerek34.
Do tej pory, lek off-label ribavirin (RBV) jest leczeniem z wyboru dla wielu zakażonych pacjentów35,36. Zgłaszano jednak przypadki niepowodzenia leczenia i złych długoterminowych wyników klinicznych. Niepowodzenie leczenia wiąże się z mutagenezą wirusową i zwiększoną heterogenicznością wirusa u pacjentów przewlekle zakażonych37,38,39. Wręcz przeciwnie, niedawne europejskie retrospektywne badanie wieloośrodkowe nie było w stanie skorelować mutacji polimerazy z niepowodzeniem leczenia RBV40. W obserwacjach klinicznych i eksperymentach in vitro interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, sole46 oraz silvestrol47,48 wykazały również działanie przeciwwirusowe. Niemniej jednak nadal nie znaleziono konkretnego leczenia HEV, co jest utrudnione ze względu na brak wiedzy na temat cyklu życiowego HEV i jego patogenezy. Dlatego pilnie potrzebny jest solidny system hodowli komórkowych do badań wirusologicznych i opracowywania nowych leków przeciwwirusowych49.
Niestety, podobnie jak inne wirusy zapalenia wątroby, HEV jest trudny do rozprzestrzeniania się w konwencjonalnych liniach komórkowych i zazwyczaj postępuje bardzo powoli, prowadząc do niskiego poziomu wiremii. Niemniej jednak niektóre grupy były w stanie zwiększyć miano wirusa poprzez generowanie subklonów linii komórkowych50 lub dostosowanie suplementów pożywki51. Niedawne generowanie klonów cDNA52 i adaptacja pierwotnych izolacji pacjentów przez pasażowanie53,54 jeszcze bardziej poprawiło propagację HEV w hodowli komórkowej55. W tym protokole wykorzystaliśmy genom szczepu Kernow-C1 przystosowanego do hodowli komórkowej (określanego jako p6_WT)54 oraz zmutowanego szczepu zawierającego mutację zwiększającą replikację (określaną jako p6_G1634R)37. Kernow-C1 jest najczęściej stosowanym szczepem w hodowli komórek HEV i jest zdolny do wytwarzania wysokiego miana wirusa. Oceniając liczbę kopii wirusowego RNA, replikację HEV można monitorować in vitro. Niemniej jednak techniki te nie pozwalają na ocenę liczby wytwarzanych cząstek zakaźnych. Dlatego ustaliliśmy barwienie immunofluorescencyjne w celu określenia jednostek tworzących ognisko (FFU/ml).
Opisana tutaj metoda56 może być używana do produkcji pełnowymiarowych zakaźnych cząsteczek wirusowych, które są zdolne do infekowania różnych typów komórek różnego pochodzenia, w tym komórek pierwotnych i linii komórkowych ssaków. Jest to podstawowy warunek wstępny do rozszyfrowania ważnych aspektów infekcji HEV i tropizmu. Nie ma potrzeby szczepienia zwykle ograniczoną liczbą izolatów pacjentów. Produkcja zakaźnych cząstek HEV z plazmidów stanowi nieskończone źródło, co sprawia, że protokół ten jest porównywalnie wydajny. Ponadto system ten może być wykorzystywany do genetyki odwrotnej, umożliwiając badanie zidentyfikowanych in vivo zmian w genomie i ich wpływu na replikację i dopasowanie HEV. Technika ta pokonuje wiele ograniczeń i może utorować drogę do opracowywania leków, badań mutagenezy i oceny interakcji wirus-gospodarz, takich jak czynniki ograniczające lub wchodzące.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mikro; m mesh</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td>Żniwo wirusa zewnątrzkomórkowego</td></tr><tr><td>4 % Histofix</td><td>CarlRoth</td><td>P087.4</td><td>Immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>CarlRoth</td><td>6755.1</td><td>Roztwór roboczy kolagenu</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td>Zbieranie wirusa</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td>Wybór przekształconych bakterie</td></tr><tr><td>ATP Roche</td><td></td><td>11140965001</td><td>in vitro transkrypcja i elektroporacja</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>BioRender</td><td></td><td>Figure Generation</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Collagen R roztwór 0,4 % sterylny</td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>Roztwór roboczy kolagenu</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Roche</td><td>11140922001</td><td>in vitro transkrypcja</td></tr><tr><td>Kuweta</td><td>Biorad</td><td>165-2088</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td>Immunofluorescencja</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DNAzyca</td> hodowli komórkowej <td>Promega</td><td>M6101</td><td>in vitro transkrypcja</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Promega</td><td>zawarte w transkrypcji P2077</td><td>in vitro</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054.3</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Escherichia coli JM109</td><td>Promega</td><td>L2005</td><td>Transformacja</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>gibco</td><td>10270106</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Immunofluorescencja</td></tr><tr><td>System elektroporacji GenePulser Xcell</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>gibco</td><td>15710049</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Roche</td><td>11140957001</td><td>in vitro transkrypcja</td></tr><tr><td>H2O</td><td>Braun</td><td>184238001</td><td>Immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-03</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Serum końskie</td><td>gibco</td><td>16050122</td><td>Immunofluorescencja</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Roth</td><td>P749.1</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Roth</td><td>6781.3</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>gibco 25030081</td><td></td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>L-Glutation zredukowany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251-5G</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>MEM</td><td>gibco</td><td>31095-029</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100 razy;)</td><td>gibco</td><td>11140-035</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Mikroobjętość Spektrofotometr UV-Vis NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>Stężenie DNA/RNA</td></tr><tr><td>Enzym MluI</td><td>NEB</td><td>R0198L</td><td>Linearyzacja</td></tr><tr><td>Bufor</td><td>NEB</td><td>zawarty w linearyzacji</td><td></td></tr> <tr><td>R0198LZestaw plazmidu NucleoSpin</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740588.250</td><td>Preparat plazmidu</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740948.250</td><td>Oczyszczanie RNA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>gibco</td><td>70011051</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Plazmid kodujący pełnej długości genomu HEV (p6_G1634R)</td><td>Todt et.al</td><td></td><td>Produkcja wirusa</td></tr><tr><td>Plazmid kodujący genom HEV o pełnej długości (p6_WT)</td><td>Shukla i wsp.</td><td>Nr akcesyjny GenBanku JQ679013</td><td>Produkcja wirusa</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe 1E6</td><td>LS-Bio</td><td>C67675</td><td>Immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne 8282</td><td></td><td></td><td>Rainer Ulrich, Instytut Friedricha Loefflera, Niemcy</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Ekstrakcja DNA</td></tr><tr><td>Ribo m7G Cap Analog</td><td>Promega</td><td>P1711</td><td>in vitro transkrypcja</td></tr><tr><td>RNaza od</td><td>CarlRoth</td><td>A998.3</td><td>Oczyszczanie RNA</td></tr><tr><td>RNasin (inhibitor RNazy)</td> <td>Promega</td><td>N2515</td><td>in vitro transkrypcja</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne przeciwko myszom osła 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21202</td><td>Immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne kozie anty-królik 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>Immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Pirogrowan sodu</td><td>gibco 11360070</td><td></td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>T7 polimeraza RNA</td><td>Promega</td><td>P2077</td><td>in vitro transkrypcja</td></tr><tr><td>Bufor transkrypcyjny</td><td>Promega</td><td>zawarty w P2077</td><td>in vitro transkrypcja</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>CarlRoth</td><td>3051.3</td><td>Immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,5 %)</td><td>gibco</td><td>15400054</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>ultra niska IgG</td><td>gibco</td><td>1921005PJ</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>UTP Transkrypcja</td><td>Roche</td><td>11140949001</td><td>in vitro</td></tr></tbody></table>

model hodowli komórkowej do produkcji zapasów wirusa zapalenia wątroby typu e o wysokim mianie

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Wirus zapalenia wątroby typu E jest główną przyczyną marskości wątroby i niewydolności wątroby, której częstość występowania wzrasta na całym świecie. Jednoniciowy wirus RNA przenoszony jest głównie przez transfuzje krwi, nieodpowiednie warunki sanitarne i skażone produkty spożywcze. Do tej pory rybawiryna (RBV) stosowana poza wskazaniami rejestracyjnymi jest leczeniem z wyboru dla wielu pacjentów. Niemniej jednak konkretne leczenie HEV pozostaje do zidentyfikowania. Do tej pory wiedza na temat cyklu życiowego i patogenezy HEV była poważnie ograniczona ze względu na brak wydajnego systemu hodowli komórek HEV. Solidny system hodowli komórkowej jest niezbędny do badania cyklu życiowego wirusa, który obejmuje również patogenezę wirusa. Za pomocą opisanej tutaj metody można wytworzyć miana wirusa do 3 x 106 jednostek tworzących ognisko / ml (FFU / ml) nieotoczkowego HEV i do 5 x 104 FFU / ml otoczkowego HEV. Za pomocą tych cząstek możliwe jest infekowanie różnych komórek różnego pochodzenia, w tym komórek pierwotnych i linii komórkowych ludzkich, a także zwierzęcych. Produkcja zakaźnych cząstek HEV z plazmidów stanowi nieskończone źródło, co sprawia, że protokół ten jest niezwykle wydajny.

W niniejszym protokole opisujemy produkcję infekcyjnych HEVcc o wysokim mianie. Pierwszym krokiem jest izolacja plazmidowego DNA (pBluescript_SK_HEVp654 oraz pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Rycina 8a), które następnie jest linearyzowane poprzez trawienie restrykcyjne i oczyszczane do transkrypcji in vitro (Rycina 1). Prawidłową linearyzację można zweryfikować, porównując niepocięte DNA plazmidowe z DNA plazmidowym p...

Opisana tutaj jest skuteczna metoda wytwarzania zapasów wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV) o wysokim mianie w celu skutecznego infekowania komórek wątroby. Dzięki przedstawionej metodzie można zbierać zarówno bezotoczkowe, jak i otoczkowe cząstki wirusa i wykorzystywać je do inokulacji różnych linii komórkowych.

Model hodowli komórkowej do produkcji zapasów wirusa zapalenia wątroby typu E o wysokim mianie

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

Badania nad wirusem zapalenia wątroby typu E są utrudnione ze względu na brak wydajnego systemu hodowli komórkowych. Nasze techniki pokonują te ograniczenia, torując drogę do projektowania leków i opracowywania szczepionek. Dzięki temu protokołowi jesteśmy w stanie wyprodukować zakaźne wirusy o wysokim mianie zarówno cząstek HEV bez otoczki, jak i otoczki, ułatwiając infekcję różnych komórek.Wykonanie tego protokołu wymaga dostępu do placówki BSA-2 i doświadczenia w podstawowych technikach hodowli komórkowych. Aby zlinearyzować plazmidowe DNA, wymieszaj 10 mikrogramów matrycowego DNA z 10 mikrolitrami buforu i dwoma mikrolitrami enzymu restrykcyjnego Micrococcus luteus i dostosuj końcową objętość do 100 mikrolitrów wodą. Następnie inkubować roztwór przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i potwierdzić linearyzację plazmidu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym zgodnie ze standardowymi protokołami.Po izolacji i linearyzacji plazmidowego DNA, powodzenie linearyzacji można zweryfikować, porównując niestrawione DNA plazmidu z trawionym plazmidowym DNA za pomocą elektroforezy żelowej. W przypadku transkrypcji in vitro oczyszczonego, pełnowymiarowego DNA wirusa zapalenia wątroby typu E, należy wymieszać dwa mikrogramy zlinearyzowanej matrycy DNA z odpowiednimi odczynnikami i użyć wody wolnej od jąder, aby doprowadzić końcową objętość roztworu do 100 mikrolitrów. Po dokładnym wymieszaniu inkubować roztwór przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po dwóch godzinach dodaj do probówki dodatkowe dwa mikrolitry polimerazy RNA T7. Następnie wymieszaj reakcję i inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne dwie godziny. Pod koniec inkubacji trawić początkową matrycę DNA z 7,5 mikrolitrami DNA z dokładnym wymieszaniem i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Po ekstrakcji dokładnie sprawdź integralność RNA i wydajność za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym zgodnie ze standardowymi protokołami. W przypadku niskiej liczebności RNA należy obserwować wyraźne prążki, a nie rozmazany rozmaz. Niektóre kroki wymagają szybkiego wykonania, a tym samym starannego przygotowania.Zwróć również szczególną uwagę na integralność RNA i żywotność komórek. Aby przygotować ludzkie komórki raka wątroby do produkcji wirusa zapalenia wątroby typu E pochodzącego z hodowli komórkowych, należy zasiać komórki w 20 mililitrach kompletnego DMEM na 15-centymetrowej naczyniu hodowlanej pokrytej kolagenem i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż osiągną 90% konfluencji. Pod koniec hodowli umyj komórki 10 mililitrami PBS przed odłączeniem ich od płytki hodowli komórkowej trzema mililitrami 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Ponownie zawiesić odłączone komórki w 10 mililitrach kompletnego DMEM i przenieść komórki do 50-mililitrowej stożkowej rurki w celu zliczenia. Przenieś pięć razy 10 do sześciu komórek do nowej 50-mililitrowej probówki i umyj komórki dwa razy 35 mililitrami PBS na pranie. Po drugim przemyciu umieść komórki na lodzie bez usuwania supernatantu.W celu elektroporacji komórek docelowych uzupełnij 384 mikrolitry cytomiksu dwoma milimolowymi ATP i pięciomilimolowymi glutationami, a następnie przechowuj na lodzie do dalszego użycia. Ostrożnie zastąp supernatant całym 400 mikrolitrami roztworu. Dodaj pięć mikrogramów oczyszczonego wirusowego genomowego RNA do komórek i przenieś zawiesinę komórek do czteromilimetrowej kuwety w celu elektroporacji przy 975 mikrofaradach i 270 woltach przez 20 milisekund.Po elektroporacji użyj pipety Pasteura, aby jak najszybciej przenieść komórki do 11 mililitrów kompletnego DMEM i zasiać 10 mililitrów elektroporowanych komórek do 10-centymetrowej naczynia hodowlanej pokrytego kolagenem. Następnie równomiernie dodać 1,3 razy 10 do piątych komórek w 300 mikrolitrach pożywki na szkiełku nakrywkowym w jednym dołku pokrytej kolagenem płytki o 24 mikromiareczkach i umieścić płytkę i szalkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny. Następnego dnia zastąp supernatant w naczyniu 10 mililitrami świeżego DMEM i włóż naczynie z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na dodatkowe sześć dni.W piątym do siódmego dnia, w zależności od gęstości komórek, wykonaj barwienie immunofluorescencyjne kontroli transfekcji, aby umożliwić obliczenie liczby komórek wyrażających docelowe białko będące przedmiotem zainteresowania, znormalizowanej do całkowitej liczby komórek. Skuteczna elektroporacja może być monitorowana przez barwienie immunofluorescencyjne kontroli transfekcji. Skuteczność transfekcji powinna przekraczać 40%Mutant z niedoborem replikacji może służyć jako kontrola negatywna w celu potwierdzenia specyficzności barwienia.Aby zebrać cząsteczki wirusa zapalenia wątroby typu E pochodzące z zewnątrzkomórkowej hodowli komórkowej, szóstego dnia należy przefiltrować supernatant przez siatkę o pojemności 0,45 mikrolitra, aby usunąć wszelkie resztki komórek i przechowywać pobrany wirus zapalenia wątroby typu E pochodzący z hodowli komórek zewnątrzkomórkowych w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W celu pobrania cząstek wirusa zapalenia wątroby typu E pochodzących z wewnątrzkomórkowych hodowli komórkowych umyj komórki PBS i odłącz komórki 1,5 mililitra 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki się odłączą, przerwij reakcję za pomocą 8,5 mililitra DMEM i przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki w celu odwirowania.Dodaj 1,6 mililitra kompletnego podłoża DMEM na elektroporację do pojedynczych dwumililitrowych probówek reakcyjnych i użyj 800 mikrolitrów pożywki do ponownego zawieszenia komórek, przenosząc w ten sposób ogniwa do probówek. Zamrozić komórki w ciekłym azocie, a następnie trzykrotnie rozmrozić komórki na lodzie przed odwirowaniem powstałych lizatów na wysokich obrotach przez 10 minut przy 10 000 g. Następnie przenieś supernatanty do nowych probówek, nie naruszając osadów z resztek komórek do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby ocenić miana nowo wytworzonych wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych zapasów wirusa zapalenia wątroby typu E, należy wysiać dwa razy od 10 do czterech komórek na 100 mikrolitrów MEM na studzienkę do 60 środkowych dołków pokrytej kolagenem 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej i wypełnić najbardziej zewnętrzne studzienki 100 mikrolitrami PBS na studzienkę. Po 24 godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj 50 mikrolitrów supernatantu cząstek wirusa zewnątrzkomórkowego do pierwszego rzędu komórek. Po dokładnym wymieszaniu należy seryjnie rozcieńczyć zawartość studzienki sześć razy w stężeniu od jednego do trzech na studzienkę, przenosząc 50 mikrolitrów supernatantu z poprzedniego do następnego rzędu komórek w dwóch egzemplarzach aż do ostatniego rzędu komórek.Aby zainfekować komórki cząstkami wirusa zapalenia wątroby typu E pochodzącymi z wewnątrzkomórkowych hodowli komórkowych, dodaj 25 mikrolitrów wewnątrzkomórkowego supernatantu cząstek wirusa do górnego rzędu komórek i dobrze wymieszaj przed seryjnym rozcieńczeniem komórek sześć razy w stosunku jeden do pięciu z 25 mikrolitrami rozcieńczenia w dwóch egzemplarzach, jak pokazano. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na siedem dni przed barwieniem immunofluorescencyjnym zgodnie z protokołem zawartym w rękopisie. Po inkubacji i barwieniu immunologicznym płytki można analizować za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.Po barwieniu immunologicznym można obliczyć końcowe miano cząstek wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych przy użyciu odpowiedniego wzoru, jak wskazano. Po zakażeniu komórki docelowej cząstkami wirusa E pochodzącymi z hodowli komórkowych przez seryjne rozcieńczanie, można oczekiwać miana między jednym razy 10 do piątego i trzy razy 10 do sześciu jednostek tworzących ognisko na mililitr z kultur komórkowych zakażonych bezotoczkowymi cząstkami wirusa zapalenia wątroby typu E pochodzącymi z wewnątrzkomórkowych kultur komórkowych. W hodowlach zakażonych otoczkowymi cząstkami wirusa zapalenia wątroby typu E pochodzącymi z hodowli komórek zewnątrzkomórkowych oczekuje się mian od jednego razy 10 do drugiego i od jednego razy 10 do czwartego ogniska na mililitr.Ponadto stosunek między kopiami genomu a bezotoczkowymi wewnątrzkomórkowymi cząstkami zakaźnego wirusa jest zwykle niższy niż obserwowany w przypadku kultur zakażonych wirusem zapalenia wątroby typu E pochodzących z zewnątrzkomórkowych hodowli komórkowych, co sugeruje wyższą zakaźność swoistą bezotoczkowych gatunków wirusa zapalenia wątroby typu E. Produkcja cząsteczek wirusa i infekcja komórek docelowych wymagają pełnego cyklu życia wirusa i mogą dostarczyć nowych informacji na temat interakcji wirus-gospodarz. Protokół ten można zmodyfikować w celu przeprowadzenia kinetyki replikacji lub wytworzenia cząstek, które można wykorzystać w testach infekcji.Większość naszych badań opiera się obecnie na cząstkach zakaźnych, zarówno w HEV z powłoką, jak i bez powłoki. A artykuły wykorzystujące nasze techniki są obecnie publikowane.

a-cell-culture-model-for-producing-high-titer-hepatitis-e-virus-stocks

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

Opisujemy dwie metody warunkowej komplementacji trans w procesie składania wirusa zapalenia wątroby C (HCV) i dopełnienia pełnego cyklu życiowego wirusa, które opierają się na tworzeniu heterokaryonów. Techniki te są odpowiednie do przesiewania linii komórkowych wykazujących ekspresję dominujących czynników restrykcyjnych, które uniemożliwiają produkcję zakaźnego potomstwa HCV.

Dwie metody tworzenia heterokaryonów w celu wykrycia czynników restrykcyjnych HCV

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Ten film demonstruje technikę in vitro do wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) za pomocą rekombinowanego systemu reporterowego HBV. Po zakażeniu komórek gospodarza rekombinowany genom wirusa wykazuje ekspresję enzymu reporterowego lucyferazy, który wytwarza bioluminescencję po utlenieniu substratu - pomagając wykryć infekcję wirusową.

System reporterowy rekombinowanego wirusa in vitro do wykrywania infekcji wirusowych

Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest głównym ludzkim patogenem, który powoduje choroby wątroby, w tym marskość wątroby i raka. System hodowli komórek zakaźnych HCV jest niezbędny do zrozumienia molekularnego mechanizmu replikacji HCV i opracowania nowych podejść terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół badania różnych etapów cyklu replikacji HCV.

Protokół analizy replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C

Recellularna macierz zewnątrzkomórkowa zdecelularizowanej wątroby szczura może być używana jako humanizowany, trójwymiarowy model ex vivo do badania dystrybucji i ekspresji transgenu wirusa lub wektora wirusowego.

Badanie wektorów wirusowych w trójwymiarowym modelu wątroby wypełnionym ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego HepG2

Tutaj opisujemy nowo opracowany system zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) do monitorowania wczesnych etapów cyklu życia wirusa HBV. Ten uproszczony system in vitro pomoże w badaniach przesiewowych środków anty-HBV przy użyciu strategii wysokoprzepustowej.

Opracowanie systemu zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B w celu monitorowania wczesnych etapów cyklu replikacji

Celem tego protokołu jest dostarczenie przewodnika krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentów 3-D z wirusem zapalenia wątroby typu B.

Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Ten protokół opisuje eksperymentalny proces wytwarzania zakaźnych cząsteczek pseudotypowych wirusa o wysokim mianie (pp) z glikoproteinami otoczkowymi z dwóch szczepów grypy A i jak określić ich zakaźność. Protokół ten jest wysoce elastyczny do tworzenia pps dowolnego innego typu wirusów otoczkowych z różnymi glikoproteinami otoczki.

Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) w nowych zmodyfikowanych komórkach 293T (293T-NE-3NRs, wyrażających ludzkie NTCP, HNF4α, RXRα i PPARα) oraz tradycyjnych komórkach wątroby (HepG2-NE, wyrażających ludzkie NTCP).

Modelowanie zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B w niewątrobowych komórkach 293T-NE-3NRs

Prezentujemy protokół do badania związków wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) ukierunkowanych na etapy cyklu życia przed i po wejściu wirusa, używając izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do pomiaru powinowactwa wiązania (KD) z polipeptydem kotransportującym taurocholan sodu gospodarza. Skuteczność przeciwwirusową określono poprzez supresję markerów cyklu życia wirusa (tworzenie cccDNA, transkrypcja i składanie wirusa).

Kompetentny model hepatocytów badający wnikanie wirusa zapalenia wątroby typu B przez polipeptyd transportujący taurocholan sodu jako cel terapeutyczny

Poznaj metodę produkcji wirusów zapalenia wątroby typu E o wysokim mianie w hodowli komórkowej. Protokół umożliwia uzyskanie cząstek wirusowych z otoczką i bez niej, wspierając badania nad lekami i szczepionkami przeciw HEV.

Model hodowli komórkowej do produkcji zapasów wirusa zapalenia wątroby typu E o wysokim mianie

Przeglądaj więcej filmów