Name: Tworzenie dopasowanych par modeli in vivo/in vitro pochodzących od pacjentów PDX i organoidów pochodzących z PDX do badań farmakologicznych nad nowotworami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: Poznaj metodę tworzenia organoidów z PDX do badań farmakologicznych nad nowotworami. Protokół umożliwia generowanie sparowanych modeli in vivo/in vitro z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i hodowli 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Jody Barbeau, Federice Parisi i Rajendrze Kumari za krytyczną lekturę i redakcję rękopisu. Autorzy pragną również podziękować zespołowi Crown Bioscience Oncology in vitro i in vivo za ich wielki wysiłek techniczny.

Wszystkie protokoły i poprawki lub procedury związane z opieką i użytkowaniem zwierząt zostały przejrzane i zatwierdzone przez Crown Bioscience Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) przed przeprowadzeniem badań. Opieka i użytkowanie zwierząt odbywały się zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care), jak podano w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, National Research Council (2011). Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach odbywały się w sterylnych warunkach w obiektach SPF (wolnych od specyficznych patogenów) i były prowadzone w ścisłej zgodności z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych różnych instytucji rządowych (np. Narodowych Instytutów Zdrowia). Protokoły zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach w instytucji placówki (np. Instytucjonalny Komitet IACUC).
1. Przygotowanie do przeszczepu guza
<ol>
	<li>Pomieszczenia dla zwierząt
	<ol>
		<li>Nagie myszy Balb / c (n = 5) w indywidualnych wentylowanych klatkach, w temperaturze 20-26 °C, wilgotności 30-70% i cyklu oświetlenia 12 godzin światła/12 godzin ciemności, z pościelą z kolb kukurydzy zmienianą co tydzień i sterylizowaną napromienianiem suchą granulowaną karmą plus sterylną wodą pitną ad libitum.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie fragmentu guza dawcy
	<ol>
		<li>Ściśle monitoruj myszy dawcy z guzem pod kątem masy ciała (BW, za pomocą wagi ważącej) i objętości guza (TV, przez pomiar suwmiarki).</li>
		<li>Gdy telewizja osiągnie 800-1000 mm3, poddaj eutanazji zwierzęta z nowotworem w kapturze stanowiącym zagrożenie biologiczne.
		<ol>
			<li>Umieść myszy w komorze eutanazyjnej z pokrywą, która dostarcza gaz CO2 do komory. Odprowadzać gaz do komory z natężeniem przepływu, które powoduje szybką utratę przytomności przy minimalnym stresie zwierzęcia. Optymalne natężenie przepływu dla CO2 wynosi około 2-2,5 l/min.</li>
			<li>Zapewnić eutanazję, obserwując, że zwierzęta nie odzyskują przytomności.</li>
			<li>Po pozornej śmierci klinicznej należy utrzymać przepływ gazu przez >1 minuty, aby zminimalizować możliwość wyzdrowienia zwierzęcia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wysterylizuj skórę wokół guza za pomocą wacików jodoforowych. Zebrać guzy, usuwając sąsiednie tkanki nienowotworowe i umieszczając na szalce Petriego zawierającej 20 ml PBS, wstępnie schłodzonej (4 °C) przed eutanazją.</li>
		<li>Umyj guzy za pomocą PBS na innej szalce Petriego, aby usunąć składniki krwi, a następnie przeciąć na pół i usunąć dodatkową skórę, naczynia krwionośne, zwapnienia i/lub martwicę.</li>
		<li>Umieść tylko nienaruszone fragmenty guza w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z 20 ml PBS, przed transportem do oddzielnego pomieszczenia dla zwierząt w celu przeszczepu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Podskórny wzrost guza
<ol>
	<li>Podskórne inokulowanie fragmentu guza myszom z obniżoną odpornością
	<ol>
		<li>Pokrój guz PDX na 2 mm kawałki za pomocą skalpela i umieść każdy z nich w trokarach w celu implantacji podskórnej (SC).</li>
		<li>Znieczulenie zwierząt biorców 5% izofluranem (utrzymywanym przez stożek nosowy na poziomie 1%). Zwierzęta rozluźniają się, tracąc odruch prostowania i ostatecznie stają się nieruchome i nie reagują na ból. Zamocuj znieczulone myszy na tablicy eksperymentalnej w odpowiedniej pozycji bocznej i wysterylizuj wacikami jodoforowymi, szczególnie obszary otaczające miejsce inokulacji guza.</li>
		<li>Na skórze lewej strony tuż przy czaszce do biodra wykonaj 0,5 cm nacięcie skalpelem i utwórz tunel pod skórą w kierunku kończyny przedniej, 2-3 cm, za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Aseptycznie przenieś jedną kostkę fragmentu guza na miejsce inokulacji z pożywki i umieść głęboko w tunelu podskórnym. Wizualnie potwierdzić położenie fragmentu przed zamknięciem rany za pomocą klipsów do rany.</li>
		<li>Monitoruj myszy z implantacją guza (5), dopóki nie staną się świadome, aby utrzymać leżący mostek, a następnie wróć do klatki dopiero po pełnym wyzdrowieniu ze znieczulenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitorowanie stanu zdrowia myszy z nowotworem
	<ol>
		<li>Codziennie sprawdzaj spożycie wody i jedzenia oraz co tydzień rejestruj masę ciała.</li>
		<li>Sprawdź myszy podczas rutynowego monitorowania. Rejestruj wszelkie wpływy na mobilność, oddychanie, pielęgnację i ogólny wygląd, spożycie jedzenia i wody, przyrost/utratę masy ciała, wodobrzusze itp.</li>
		<li>Mierz TV dwa razy w tygodniu za pomocą suwmiarki i odciągaj w mm3 na: TV = 0,5 a × b2, gdzie a i b to odpowiednio długość i szerokość guza.</li>
		<li>Składaj ofiary ze zwierząt w celu pobrania próbek, gdy pojawi się którykolwiek z następujących objawów: utrata masy ciała >20%; upośledzenie ruchomości (niezdolność do jedzenia lub picia); niezdolność do normalnego poruszania się z powodu znacznego wodobrzusza lub powiększonego brzucha; wysiłek w oddychaniu; śmierć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sekcja zwłok i żniwo nowotworów
<ol>
	<li>Gdy objętość guza osiągnie 200-800 mm3, należy poddać myszy eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi protokołami (patrz krok 1.2.2).</li>
	<li>Zbierz tkanki nowotworowe, usuwając sąsiednie tkanki nienowotworowe, a następnie umieść tkankę w plastikowej tubie o pojemności 50 ml z AD+++ (na lodzie) przed dysocjacją.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do hodowli organoidów pochodzących z PDX
UWAGA: Wszystkie poniższe kroki zostały wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, zgodnie ze standardowymi wytycznymi hodowli tkankowych. Przed użyciem należy przechowywać wstępnie ogrzane płytki 96-, 24- i 6-dołkowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
<ol>
	<li>Preparaty odczynnikowe
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór ekstraktu z błony podstawnej (BME) (zredukowany czynnik wzrostu, bez czerwieni fenolowej). Przechowuj 10 ml BME w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc. Po rozmrożeniu zakręć butelką BME, aby zapewnić dyspersję.</li>
		<li>Przygotować podłoże bazowe/bufor myjący AD+++. Dodaj 5 ml 200 mM L-glutaminy, 1 M HEPES i Pen/Strep do pożywek Advanced DMEM/F12, pipetując pipetą o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Przygotuj podłoże organoidowe okrężnicy zgodnie z opisem Sato i wsp.18 poprzez uzupełnienie pożywki bazowej o N-Ac (1 mM), A83-01 (500 nM), B27 (1x), EGF (50 ng/ml), Noggin (100 ng/ml), nikotynamid (10 mM), SB202190 (10 nM), R-spondyna (500 ng/ml), L-glutamina (2 mM), HEPES (10 μM), penicylina-streptomycyna (1x) i Y-27623 (10 μM)19.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę wytrawiającą AD+++: 10 ml 1x pożywki do hodowli organoidów z 500 μl kolagenazy typu II (20 mg / ml) i 10 μl RhoKI Y-27632 (10 mM).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysocjacja guza20
	<ol>
		<li>Przenieś guz w plastikowej probówce o pojemności 50 ml na 10-centymetrową szalkę Petriego. Zrób zdjęcie makroskopowe wraz z linijką i zapisz opis jej warunków (tj. rozmiar, tkanka tłuszczowa, unaczynienie, martwica itp.).</li>
		<li>Usuń nadmiar AD+++ przez aspirację i pokrój tkankę nowotworową na małe kawałki nożyczkami, a następnie przenieś 1-2 kawałki do mikroprobówki o pojemności 2 ml w celu natychmiastowego zamrożenia na suchym lodzie. Przechowywać w temperaturze -80 °C w celu profilowania genomowego. Zmiel pozostałe kawałki na drobniejsze kawałki nożyczkami przed przeniesieniem do plastikowej tubki o pojemności 50 ml za pomocą AD+++.</li>
		<li>Przemyć tkankę mieloną 2-3 razy przez 35 ml AD+++, a następnie dodać 10 ml pożywki wytrawiającej (patrz krok 4.1.4) i umieścić na wytrząsarce orbitalnej o sile 4 x g na 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Homogenizować strawioną tkankę, pipetując w górę i w dół za pomocą sterylnej plastikowej pipety o pojemności 5 ml, a następnie dodać 20 ml AD+++ i przefiltrować przez sitko o wielkości 100 μm.</li>
		<li>Przemyć przejście dwukrotnie za pomocą AD+++ (wirować z prędkością 450 x g przez 5 minut), a następnie ponownie zawiesić w BME (dodać 4x objętość BME do granulki do zawiesiny) i trzymać na lodzie19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie hodowli organoidów
	<ol>
		<li>Dodaj zawiesinę komórek BME do 6-dołkowej płytki w wielu kroplach, aby uzyskać łącznie 200 μl na studzienkę.</li>
		<li>Przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C. Po 30 minutach krople żelu krzepną.</li>
		<li>Dodać 2 ml pożywki organoidowej do każdej studzienki, z reprezentatywnymi kroplami zarejestrowanymi za pomocą fotografii mikroskopowej przed przeniesieniem do inkubatora (37 °C i 5% CO2 ).</li>
		<li>Utrzymuj kultury organoidów ze zmianą pożywki co 3-4 dni i pasażem w stosunku 1:2 co 7 dni lub w zależności od ich wzrostu i gęstości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza histopatologiczna i sekwencjonowania nowej generacji (NGS)
<ol>
	<li>histopatologia
	<ol>
		<li>Zebrać organoidy ze studzienki z istniejącą pożywką za pomocą pipety P1000, następnie odwirować (wirować przy 450 x g przez 5 minut), przemyć PBS i utrwalić w 10% formalinie przez 1 godzinę.</li>
		<li>Umieść utrwalone organoidy w 100% żelatynie na dnie stożkowej probówki o pojemności 50 ml, a następnie wykonaj rutynową obróbkę tkanek i zatopienie.</li>
		<li>Przeprowadzić barwienie hematoksyniną-eozyną (H&E) przy użyciu standardowych protokołów na 4 mm odcinkach parafiny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekwencjonowanie RNAseq i całego egzomu
	<ol>
		<li>Zebrać organoidy ze studzienki z istniejącą pożywką za pomocą pipety P1000, a następnie odwirować za pomocą mikrowirówki z maksymalną prędkością (12 000 x g) przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać osad, usuwając sklarent nadsadzeniowy, aby upewnić się, że nie ma widocznego BME, a następnie zamrozić błyskawicznie w mikroprobówce (suchy lód), a następnie przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Ekstrahuj RNA lub DNA przy użyciu standardowej procedury od producentów i wykonaj analizę NGS zarówno dla sekwencjonowania RNAseq, jak i całego eksomu (WES).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Test IC5020
<ol>
	<li>Wysiew organoidów na płytce 384-dołkowej do testu IC50
	<ol>
		<li>Dysocjację organoidów w kroplach BME z każdej studzienki (trawienie BME) poprzez dodanie 20 μl 100-krotnego roztworu dyspazy do każdej studzienki (płytka 6-dołkowa), która zawierała 2 ml pożywki organoidowej, a następnie 30 minut inkubacji w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wytrawione organoidy ze wszystkich studzienek należy pipetować przez filtr 70 μm do plastikowej probówki o pojemności 50 ml w celu zebrania organoidów.</li>
		<li>Policz organoidy pod mikroskopią w celu określenia stężenia organoidów. Zawiesić organoidy za pomocą pożywki hodowlanej, przed dodaniem BME, aby osiągnąć końcowe stężenie 5% (v/v) na lodzie.</li>
		<li>Dodać 50 μl zawiesiny organoidów do każdej 384-dołkowej płytki z dozownikiem płynu, zgodnie z mapą płytki o gęstości wysiewu 200 CR2110 PDXO na basenik w odpowiedniej pożywce do hodowli organoidów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie cisplatyną i irynotekanem
	<ol>
		<li>Stosować cisplatynę (o najwyższym stężeniu 100 μM) i "irynotekan" (o najwyższym stężeniu 10 μM). Dodać SN-38 (metabolit irynotekanu, w przeciwieństwie do irynotekanu, który jest zwykle stosowany w badaniach in vivo) do każdej studzienki zgodnie ze schematem rozcieńczania leku dla 9 dawek, w seryjnym rozcieńczaniu za pomocą dyspensera cyfrowego.</li>
		<li>Utwórz mapę tablic za pomocą narzędzia programowego dozownika cyfrowego. Uwzględnij nośnik kontroli ujemnej ze 100% żywotnością i kontrolą pozytywną staurosporyny 5 μM, która wykazała 0% żywotności.</li>
		<li>Umieścić 384-dołkowe płytki poddane działaniu leku z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie żywotności komórek organoidowych po leczeniu farmakologicznym
	<ol>
		<li>Pod koniec 5-dniowego leczenia farmakologicznego należy określić żywotność komórek organoidowych za pomocą odczynników do żywotności komórek luminescencyjnych zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta. Dodaj odczynnik luminescencyjny do każdej studzienki z dozownikiem płynu i mieszaj przez 5 minut na wytrząsarce płytkowej, a następnie 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Nagraj sygnał luminescencyjny na luminescencyjnym czytniku płytek wielodołkowych.</li>
		<li>Oblicz znormalizowaną żywotność każdego dołka, korzystając z surowych odczytów z czytnika płytek i utwórz krzywą dawka-odpowiedź oraz wartości IC50 poprzez nieliniowe dopasowanie krzywej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+erlotinib+resistance+with+tailored+treatment+regimen+in+patient-derived+xenografts+from+naive+Asian+NSCLC+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients.</a> International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).</li>
<li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+Cancer+Researchearch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in Cancer Researchearch.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Models+of+Cancer+Explode+with+Possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Weeber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+genetic+diversity+in+organoids+cultured+from+biopsies+of+human+colorectal+cancer+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Derived+Organoids+Predict+Chemoradiation+Responses+of+Locally+Advanced+Rectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).</li>
<li>Ganesh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rectal+cancer+organoid+platform+to+study+individual+responses+to+chemoradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation.</a> Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Yang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+RNAi+library+based+on+partially+randomized+consensus+sequences+of+nuclear+receptors%3A+identifying+the+receptors+involved+in+amyloid+beta+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation.</a> Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+gastric+cancers+with+EGFR+amplification+and+overexpression+respond+to+cetuximab+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy.</a> Scientific Reports. 3, 2992(2013).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+defined+oncogenic+mutation+alleles+seems+to+better+predict+the+response+to+cetuximab+in+CRC+patient-derived+xenograft+than+KRAS+12%2F13+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations.</a> Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Pathology+of+Patient+Tumors%2C+Patient-Derived+Xenografts%2C+and+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines.</a> Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma+Organoid+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
<li>Corcoran, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+BRAF+and+MEK+Inhibition+With+Dabrafenib+and+Trametinib+in+BRAF+V600-Mutant+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. , (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są lub byli obecnie pełnoetatowymi pracownikami Crown Bioscience, Inc.

Wstępne dane dotyczące PDX-/PDXO-CR2110 w tym raporcie potwierdzają biologiczną równoważność między PDX a jego pochodną, PDXO, w odniesieniu do genomiki, histopatologii i farmakologii, ponieważ oba modele reprezentują formy chorobowe z pierwotnego CSC pacjenta. Oba modele są modelami choroby pochodzącymi od pacjenta, potencjalnie predykcyjnymi odpowiedzi klinicznej pacjentów 10,11,12,21. Dopaso...

Nowotwory to zbiór różnorodnych zaburzeń genetycznych i immunologicznych. Pomyślne opracowanie skutecznych metod leczenia jest w dużym stopniu uzależnione od modeli eksperymentalnych, które skutecznie przewidują wyniki kliniczne. Duże biblioteki dobrze scharakteryzowanych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) od dawna są postrzegane jako system translacyjny in vivo z wyboru do testowania terapii chemo- i/lub celowanych ze względu na ich zdolność do rekapitulacji charakterystyki guza pacjenta, heterogeniczności i odpowiedzi pacjenta na lek1, umożliwiając w ten sposób badania kliniczne na myszach podobne do fazy II w celu poprawy sukcesu klinicznego2,3. PDX są ogólnie uważane za choroby nowotworowych komórek macierzystych, charakteryzujące się stabilnością genetyczną, w przeciwieństwie do ksenoprzeszczepów pochodzących z linii komórkowych2. W ciągu ostatnich kilku dekad na całym świecie stworzono duże kolekcje PDX, które stały się dziś koniem roboczym w opracowywaniu leków przeciwnowotworowych. Chociaż modele zwierzęce są szeroko stosowane i mają dużą wartość translacyjną, są z natury kosztowne, czasochłonne i mają niską przepustowość, a zatem nie nadają się do badań przesiewowych na dużą skalę. PDX są również niepożądane w testach immunoonkologicznych (IO) ze względu na upośledzoną odporność4. W związku z tym niepraktyczne jest pełne wykorzystanie dostępnej dużej biblioteki PDX.
Ostatnie odkrycia, zapoczątkowane przez laboratorium Hansa Cleversa5, doprowadziły do założenia in vitro hodowli organoidów generowanych z dorosłych komórek macierzystych w większości ludzkich organów pochodzenia nabłonkowego5. Protokoły te zostały jeszcze bardziej udoskonalone, aby umożliwić wzrost organoidów z zakładanych CSC w ludzkich rakach o różnych wskazaniach6,7. Te organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) są stabilne genomicznie8,9 i wykazano, że są wysoce predykcyjne dla wyników leczenia klinicznego10,11,12. Ponadto charakter PDO in vitro umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS)13, co potencjalnie daje przewagę nad modelami in vivo i wykorzystuje duże biblioteki organoidów jako substytut populacji pacjentów. PDO mają szansę stać się ważną platformą odkrywczą i translacyjną, pokonując wiele ograniczeń PDX opisanych powyżej.
Zarówno PDO, jak i PDX są modelami pochodnymi od pacjentów i sterowanymi przez CSC, z możliwością oceny terapii w kontekście spersonalizowanego leczenia lub formatu badania klinicznego. Istniejące duże biblioteki PDX, takie jak zastrzeżona kolekcja >3000 PDXs14,15,16,17, są zatem odpowiednie do szybkiego generowania bibliotek organoidów nowotworowych (organoidów pochodzących z PDX lub PDXO), co skutkuje dopasowaną biblioteką sparowanych modeli PDX i PDXO. Niniejszy raport opisuje procedurę tworzenia i charakterystyki raka jelita grubego PDXO-CR2110 w odniesieniu do jego macierzystego modelu PDX-CR211016.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowane technologie DMEM/F12</td><td>Life 12634028</td><td></td><td>Podłoże bazowe</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclon</td><td>SH30243.01</td><td>Medium myjące</td></tr><tr><td>Kolagen typu II</td><td>Invitrogen</td><td>17101015</td><td>Digest guz</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Matryca hodowli organoidów (ekstrakt z błony podstawnej, obniżony czynnik wzrostu)</td></tr><tr><td>N-Ac</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>Pożywka do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Pożywka do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Pożywka do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Pożywka do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>Pożywka do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>Pożywka do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7076</td><td>Pożywka do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Sigma</td><td>G9145</td><td>Pożywka do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>Rspondin</td><td>Peprotech</td><td>120-38-1000</td><td>Pożywka do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>Pożywka do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Life Technologies</td><td>15630056</td><td>Pożywka do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Pożywka do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole</td><td>M1817</td><td>Pożywka do hodowli organoidów</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105041</td><td>Test przesiewowy</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td>Test przesiewowy (luminescencyjny wskaźnik ATP)</td></tr><tr><td>Dozownik wielokroplowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>Multidrop combi</td><td>Organoidy galwaniczne/CellTiter-Glo Dodawanie 3D</td></tr><tr><td>Dozownik cyfrowy</td><td>Tecan</td><td>D300e</td><td>Dodatek związków</td></tr><tr><td>Envision Czytnik płytek</td><td>Perkin Elmer</td><td>2104</td><td>Odczyt luminescencji</td></tr><tr><td>Balb/c nagie myszy</td> Pekin <td>HFK Bio-Technology Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAeasy Mini zestaw</td> do <td>oczyszczania</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Qiagen 74104 tRNADNAeasy Krew & Zestaw tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Zestaw do oczyszczania DNA</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Fisher</td><td>HG-4000-012</td><td>Osadzanie organoidów</td></tr></tbody></table>

tworzenie dopasowanych par modeli in vivo/in vitro pochodzących od pacjentów pdx i organoidów pochodzących z pdx do badań farmakologicznych nad nowotworami

Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research

Ksenoprzeszczepy nowotworowe pochodzące od pacjentów (PDX) są uważane za najbardziej predykcyjne modele przedkliniczne, głównie uważane za napędzane przez rakowe komórki macierzyste (CSC) do konwencjonalnej oceny leków przeciwnowotworowych. Duża biblioteka PDX odzwierciedla różnorodność populacji pacjentów, a tym samym umożliwia prowadzenie badań przedklinicznych opartych na populacji ("badania kliniczne na myszach podobne do fazy II"); jednak PDX mają praktyczne ograniczenia związane z niską przepustowością, wysokimi kosztami i długim czasem trwania. Organoidy nowotworowe, będące również modelami opartymi na CSC pochodzącymi od pacjenta, można uznać za odpowiednik PDX in vitro, pokonując pewne ograniczenia PDX w radzeniu sobie z dużymi bibliotekami organoidów lub związków. W badaniu tym opisano metodę tworzenia organoidów pochodzących z PDX (PDXO), w wyniku czego uzyskano sparowane modele do badań farmakologicznych in vitro i in vivo. Podskórnie przeszczepione guzy PDX-CR2110 pobrano od myszy z guzem, gdy guzy osiągnęły 200-800 mm3, zgodnie z zatwierdzoną procedurą autopsji, a następnie usunięto sąsiednie tkanki nienowotworowe i dysocjację na małe fragmenty guza. Małe fragmenty guza zostały umyte i przepuszczone przez sitko komórkowe o wielkości 100 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń. Klastry komórek zebrano i zawieszono w roztworze ekstraktu z błony podstawnej (BME) i posiano na 6-dołkowej płytce w postaci stałej kropli z otaczającą płynną pożywką do wzrostu w inkubatorze CO2 . Wzrost organoidów monitorowano dwa razy w tygodniu pod mikroskopem świetlnym i rejestrowano za pomocą fotografii, a następnie zmieniano płynne podłoże 2 lub 3 razy w tygodniu. Wyhodowane organoidy poddano dalszej pasażce (7 dni później) w stosunku 1:2 poprzez rozbicie organoidów osadzonych w BME za pomocą mechanicznego ścinania, wspomaganego przez dodanie trypsyny i dodanie 10 μM Y-27632. Organoidy poddano kriokonserwacji w krioprobówkach w celu długotrwałego przechowywania, po uwolnieniu z BME przez odwirowanie, a także pobrano próbki (np. bloku DNA, RNA i FFPE) w celu dalszej charakterystyki.

Morfologia PDXO, typowa dla organoidów w mikroskopii świetlnej i zgodna z rodzicielskim PDX w barwieniu H&amp;E 
W mikroskopii świetlnej PDXO-CR2110 wykazuje typową morfologię torbielowatą (Rycina 1A), co zostało opisane wcześniej dla organoidów pochodzących od pacjentów (PDO), co stanowi dowód na podobieństwo między PDXO a PDO w tych samych warunkach hodowli.
Badanie histopatologiczne z zastosowaniem barwienia H&amp;E wykazuje, że struktury tk...

Opisano metodę tworzenia organoidów przy użyciu ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) do badań przesiewowych in vitro, co daje dopasowane pary modeli in vivo/in vitro. Guzy PDX zostały zebrane/przetworzone na małe kawałki mechanicznie lub enzymatycznie, a następnie metodą Cleversa do wyhodowania organoidów nowotworowych, które zostały pasażowane, kriokonserwowane i scharakteryzowane w stosunku do oryginalnego PDX.

Tworzenie dopasowanych par modeli in vivo/in vitro pochodzących od pacjentów PDX i organoidów pochodzących z PDX do badań farmakologicznych nad nowotworami

Patient-derived tumor xenografts (PDXs) are considered the most predictive preclinical models, largely believed to be driven by cancer stem cells (CSC) ...

Protokół ten może być wykorzystany do ustanowienia dopasowanej biblioteki sparowanych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta lub PDX i odpowiadających im linii organoidów pochodzących od pacjenta. Zaletą tej metody jest to, że można ją wykorzystać do tworzenia organoidów przy użyciu PDX do badań przesiewowych in vitro, w wyniku czego uzyskuje się dopasowane pary modeli in vivo/in vitro. Zacznij od pobrania guzów i przetworzenia tkanki zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.Po strawieniu tkanek należy pipetować tkankę w górę iw dół za pomocą sterylnej plastikowej pipety o pojemności pięciu mililitrów. Następnie dodaj 20 mililitrów AD+ do homogenatu i przefiltruj go za pomocą sitka o średnicy 100 mikrometrów. Przemyć filtrat dwukrotnie AD+, a następnie przenieść go do plastikowej probówki i odwirować w temperaturze 450 razy G przez pięć minut.Ponownie zawieś komórki w BME i utrzymuj je na lodzie. Aby przygotować kulturę organoidową, przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka sześciodołkowej płytki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Dodaj dwa mililitry pożywki organoidowej do każdej studzienki i zobrazuj przedstawiciela upuszczanego pod mikroskopem.Utrzymuj kultury organoidów w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla ze zmianami pożywki co trzy do czterech dni i pasażem w stosunku jeden do dwóch co siedem dni. Po dysocjacji organoidów przepuść je przez filtr o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej plastikowej tuby. Policz organoidy pod mikroskopem i ponownie zawieś je w BME na lodzie, aby uzyskać końcowe stężenie 5%Dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny organoidów do każdej 384-dołkowej płytki z dozownikiem płynu, aby uzyskać gęstość wysiewu 200 CR2110 PDXO na studzienkę.Użyj dozownika cyfrowego, aby dodać SN38 do każdej studzienki w rozcieńczeniu szeregowym. Utwórz mapę tablic rejestracyjnych za pomocą narzędzia programowego dozownika cyfrowego. Leczenie powinno obejmować podłoże kontroli ujemnej o 100% żywotności i kontrolę pozytywną pięciu mikromolowych staurosporyny o żywotności 0%.Po zakończeniu umieść 384-dołkowe płytki potraktowane lekiem z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod mikroskopem świetlnym PDXO CR2110 wykazuje typową morfologię torbielowatą, wykazując podobieństwo między organoidami pochodzącymi z PDX a organoidami pochodzącymi od pacjentów w tych samych warunkach hodowli. Badanie histopatologiczne metodą barwienia H&E ujawnia, że struktury tkankowe i typy komórek PDXO CR2110 są podobne do oryginalnego PDX CR2110.Porównania profili genomowych PDX i PDXO wykazują 94,92% korelację ekspresji transkryptomu i 97,67% zgodność mutacji DNA, co sugeruje ogólne podobieństwo genomowe między tą parą modeli. Testy wrażliwości na leki przeprowadzono na PDXO CR2110 w płytkach 384-dołkowych. PDXO CR2110 był wrażliwy na irynotekan i oporny na cisplatynę, co było zgodne z wynikami leczenia PDX.Dopasowana para modeli in vitro i in vivo może się wzajemnie uzupełniać w zakresie badań przesiewowych in vitro i walidacji in vivo, poprawiając wskaźnik powodzenia odkrywania leków i potencjalnie zmniejszając wskaźniki odejść w rozwoju klinicznym.

creating-matched-vivoin-vitro-patient-derived-model-pairs-pdx-pdx

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Hodowle organoidowe gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzące od pacjentów są szybko ustalonym trójwymiarowym modelem, który z dużą wiernością przedstawia przedziały komórek nowotworowych nabłonka, umożliwiając badania translacyjne nad tą śmiertelną złośliwością. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody tworzenia i rozmnażania organoidów, a także wykonywania odpowiednich testów biologicznych przy użyciu tych modeli.

Izolacja i charakterystyka modeli organoidowych gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzących od pacjenta

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

W poniższej pracy opisujemy kolejne kroki niezbędne do stworzenia dużego biobanku raka jelita grubego i trzustki.

Stworzenie i utrzymanie żywego biobanku - jak to robimy

Wysoce dokładny system wysokoprzepustowych testów in vitro został opracowany do oceny leków przeciwnowotworowych przy użyciu organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDO), podobnych do tkanek nowotworowych, ale nie nadaje się do wysokoprzepustowych systemów testów in vitro z płytkami 96-dołkowymi i 384-dołkowymi.

Wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Obecny protokół ustanawia i charakteryzuje model ksenoprzeszczepu (PDX) anaplastycznego raka tarczycy (ATC) oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) pochodzącego od pacjenta, ponieważ modele PDX szybko stają się standardem w dziedzinie onkologii translacyjnej.

Opracowanie i charakterystyka modeli ksenoprzeszczepów anaplastycznego raka tarczycy oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi pochodzących od pacjentów

Przedstawiamy protokół, który może być wykorzystany do przeprowadzenia testów leków terapeutycznych z organoidami raka jajnika pochodzącymi od pacjentek.

Modele organoidowe pochodzące od pacjentek z rakiem jajnika do przedklinicznych testów leków

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów są wyrafinowanym systemem modelowym do badań podstawowych i translacyjnych. Ten artykuł dotyczący metod szczegółowo opisuje zastosowanie multipleksowanego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek do jednoczesnej oceny kinetycznej różnych fenotypów organoidów.

Multipleksowane obrazowanie żywych komórek w celu uzyskania odpowiedzi na leki w organoidalnych modelach raka pochodzących od pacjenta

Tutaj prezentujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem poprzez hodowlę oddzielonych zawiesin komórkowych ze świeżych tkanek czerniaka. Organoidy te wiernie odwzorowują specyficzne dla pacjenta nowotwory in vitro, oferując innowacyjne podejście do badania mechanizmów immunosupresyjnych nowotworów, badań przesiewowych leków, mechanizmów oporności na leki i podejść do nadzoru nad rakiem.

Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem

Poznaj metodę tworzenia organoidów z PDX do badań farmakologicznych nad nowotworami. Protokół umożliwia generowanie sparowanych modeli in vivo/in vitro z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i hodowli 3D.

Tworzenie dopasowanych par modeli in vivo/in vitro pochodzących od pacjentów PDX i organoidów pochodzących z PDX do badań farmakologicznych nad nowotworami (Wideo) | JoVE Journal

Tworzenie dopasowanych par modeli in vivo/in vitro pochodzących od pacjentów PDX i organoidów pochodzących z PDX do badań farmakologicznych nad nowotworami

Przeglądaj więcej filmów