Model hodowli komórkowej do badania roli interakcji neuron-glej w niedokrwieniu

Udar niedokrwienny jest stanem klinicznym charakteryzującym się hipoperfuzją tkanki mózgowej i powoduje utratę neuronów. Liczne dowody sugerują, że interakcja między komórkami glejowymi a moczowymi wywiera wpływ ciśnienia po zdarzeniu niedokrwiennym. Aby zbadać potencjalne mechanizmy ochronne, ważne jest opracowanie modeli, które pozwolą na badanie interakcji neuron-glej w środowisku niedokrwiennym.

Tutaj przedstawiamy proste podejście do izolowania astrocytów i neuronów z kory embrionalnej szczura, które przy użyciu specyficznej pożywki hodowlanej umożliwia tworzenie kultur wzbogaconych w neurony lub astrocyty lub kultur neoglejowych o wysokiej wydajności i odtwarzalności. Aby zbadać wzajemne oddziaływanie między astrocytami a neuronami, proponujemy podejście oparte na systemie kohodowli, w którym neurony hodowane na szkiełkach nakrywkowych są utrzymywane w kontakcie z monowarstwą astrocytów pokrytych płytkami wielodołkowymi. Obie kultury są utrzymywane częściowo przez małe kulki parafinowe.

Takie podejście pozwala na niezależną manipulację i zastosowanie specyficznego leczenia do każdego typu komórek, co stanowi zaletę w wielu badaniach. Aby zasymulować to, co dzieje się podczas udaru niedokrwiennego, hodowle są poddawane protokołowi deprywacji tlenu i glukozy. Protokół ten stanowi użyteczne narzędzie do badania roli interakcji neuron-glej w udarze niedokrwiennym.

Zacznij od izolacji kory zarodkowej szczura. Zarodki uzyskano od rodziny szczurów w 15 dniu ciąży i umieszczono w sterylnej probówce Falcon zawierającej PBS. Nadal w saszetce z żółtkiem zarodki umieszcza się na szalce Petriego zawierającej zimny PBS.

Za pomocą nożyczek i pęsety woreczek żółtkowy jest rozbijany, a zarodek jest usuwany i umieszczany na innej szalce Petriego zawierającej zimny PBS na okładzie z lodu. Należy zachować szczególną ostrożność podczas rozbijania woreczka żółtkowego, aby nie uszkodzić zarodka. Umieść zarodek pod mikroskopem preparacyjnym, delikatnie utrwal zarodek za pomocą twizzera.

Początkowe nacięcie powinno być równoległe do kory. Uważaj, aby nie odciąć głowy zwierzęciu. Skóra głowy i są ostrożnie usuwane, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej kory.

To następne nacięcie oddziela korę. Usuń naczynia krwionośne obecne w tkance. Na koniec, za pomocą pipety, przenieś tkankę korową do probówki Falcon z PBS.

Zawiesinę jednokomórkową uzyskuje się poprzez mechaniczne trawienie tkanki mózgowej kory mózgowej za pomocą końcówek o zmniejszającej się średnicy. Upewnij się, że tkanka jest dobrze homogenizowana Po roztrawieniu odwirować materiał w temperaturze 400 g przez trzy minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce hodowlanej, uprzednio ogrzanej do 37 stopni.

Obliczyć całkowitą liczbę komórek obecnych w zawiesinie za pomocą komory Neubauera i przygotować rozcieńczenie do uzyskania odpowiedniej gęstości komórek. Na koniec wysiewaj komórki w dołku wielostudzienkowym i inkubuj w temperaturze 37 stopni. W celu przygotowania materiału do systemu kohodowli należy podgrzać parafinę w bloku grzewczym, aż stanie się płynna.

Następnie, za pomocą szklanej pipety Pasteura, przygotuj małe kulki na szkiełkach nakrywkowych, które wcześniej umieszczono w wielodołku i pokryto poli-D-lizyną. Na 24 godziny przed kontaktem dwóch kultur zmień pożywkę hodowlaną neuronów i astrocytów, aby uzupełnić ją NBM z lub bez inaktywowanego termicznie FBS. Gdy dwie kultury są gotowe do użycia, przenieś neuron, osadzony w szkiełkach nakrywkowych z kulkami parafinowymi, do studzienek zawierających astrocyty za pomocą pęsety uprzednio zanurzonej w 70% etanolu.

Po umieszczeniu obu typów komórek w kontakcie odczekaj od ośmiu do 12 godzin, a następnie rozpocznij różne bodźce i procedury. Niedobór tlenu i glukozy odbywa się w kulturze z siedmiodniowym wzrostem. Usuń pożywkę hodowlaną i umyj komórki dwa razy pożywką HBSS bez suplementacji glukozy.

Upewnij się, że cała pożywka zawierająca glukozę została umyta. Uszczelnij komorę hipoksji i dodaj mieszankę gazów zawierającą 95% azotu i 5% dwutlenku węgla na cztery minuty z przepływem 20 litrów przez kilka minut w celu zastąpienia tlenu obecnego w komorze. Następnie zatrzymaj przepływ i umieść komorę hipoksji w inkubatorze pod kątem 37 stopni.

Po okresie niedoboru tlenu i glukozy należy zastąpić pożywkę, HBSS bez suplementacji glukozy odpowiednią pożywką do pozostałych procedur i inkubować komórki w temperaturze 37 stopni. Aby scharakteryzować typ hodowli korowej, przeprowadziliśmy immunohistochemię w trzech typach kultur korowych, aby ocenić liczbę komórek, które wyrażały GFPA lub MAP2, które są markerami szeroko stosowanymi odpowiednio dla komórek astrocytarnych i neuronalnych. Analiza ta wykazała, że dzięki temu protokołowi byliśmy w stanie uzyskać czystą, wzbogaconą hodowlę astrocytów z około 97% komórek wykazujących ekspresję GFAP.

Jeśli chodzi o hodowlę wzbogaconą neuronami, zweryfikowaliśmy około 78% komórek wykazujących ekspresję MAP2. Identyfikujemy jednak około 18% komórek GFAP i MAP2 ujemnych. W przypadku hodowli korowej neuronów glejowych zaobserwowano, że około 49% komórek jest MAP2 dodatnich.

31% ma pozytywny wynik GFAP. A 20%nie ponoszą odpowiedzialności za GFAP ani MAP2. Siedem dni po założeniu hodowli korowej, posiew gleju neuronów i kultura wzbogacona neuronami poddano procedurze OGD przez 4 i 6 godzin.

Po tej procedurze komórki znakowano MAP2, a następnie liczbę komórek MAP2-dodatnich określono ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W hodowli neuronów glejowych zaobserwowano zmniejszenie liczby neuronów o około 30%, gdy hodowla została poddana okresowi OGD trwającemu 4 godziny. Po okresie OGD trwającym 6 godzin, rozszerzenie zmiany zwiększa się, osiągając około 60% utraty neuronów.

Jeśli chodzi o wzbogaconą hodowlę neuronów wystawionych na działanie OGD, zaobserwowano około 41% i 64% spadek liczby komórek MAP2. Ponadto zaobserwowano, że w kulturze wzbogaconej neuronami nastąpił niewielki wzrost wydłużenia urazu w porównaniu z hodowlą gleju neuronalnego również wystawioną na OGD w ciągu 4 godzin. Podsumowując, oto model in vitro do badania udaru niedokrwiennego ustalonego w prosty, szybki i drogi oraz powtarzalny sposób.

Dodatkowo, opisana metoda pozwala również na implementację neuronów i kultur pierwotnych wzbogaconych astrocytami, ale także hodowli neuronów glejowych. W ten sposób zapewnia doskonały model in vitro do modelowania kilku chorób mózgu o wyższym poziomie złożoności niż unieśmiertelnione linie komórkowe i czyste hodowle neuronów lub gleju.