Name: Pomiar wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę pomiaru wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych mięśniach szkieletowych myszy. Technika ex vivo umożliwia precyzyjną ocenę metabolizmu glukozy bez wpływu czynników systemowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Duńskiej Rady ds. Niezależnych Badań - Nauk Medycznych (FSS8020-00288B) oraz Fundacji Novo Nordisk (NNF160C0023046). Prace te były również wspierane przez grant badawczy dla Rasmusa Kjøbsteda z Duńskiej Akademii Diabetologicznej, który jest finansowany przez Fundację Novo Nordisk, grant numer NNF17SA0031406. Autorzy pragną podziękować Karinie Olsen, Becinie Bolmgren i Irene Bech Nielsen (Wydział Żywienia, Ćwiczeń i Sportu, Wydział Nauk Ścisłych, Uniwersytet Kopenhaski) za ich kompetentną pomoc techniczną.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Nienaruszona regulacja wychwytu glukozy w mięśniach szkieletowych jest ważna dla zachowania ogólnego stanu zdrowia1. W związku z tym badanie wychwytu glukozy przez mięśnie często służy jako podstawowy odczyt przy ocenie różnych interwencji zmieniających zdrowie. Tutaj opisujemy metodę ex vivo pomiaru wychwytu glukozy w izolowanym i inkubowanym mięśniu płaszczkowatym i EDL od myszy w odpowiedzi na insulinę i skurcze wywołane elektrycznie. Metoda jest szybka i niezawodna oraz pozwala na precyzyjną k...

Mięśnie szkieletowe posiadają zdolność do wydobywania dużych ilości glukozy z przestrzeni zewnątrzkomórkowej w odpowiedzi na insulinę i ćwiczenia. Pomaga to w utrzymaniu homeostazy glukozy w całym organizmie i zabezpiecza podaż glukozy w okresach dużego zapotrzebowania na energię. Ponieważ wykazano, że nienaruszona regulacja wychwytu glukozy w mięśniach szkieletowych jest ważna dla ogólnego stanu zdrowia i sprawności fizycznej1,2, pomiary wychwytu glukozy przez mięśnie w różnych warunkach spotkały się z dużym zainteresowaniem. U ludzi i zwierząt klamra hiperinsulinemiczno-euglikemiczna jest stosowana jako złoty standard do oceny wrażliwości na insulinę in vivo3,4. W przeciwieństwie do wyników uzyskanych z doustnego testu tolerancji glukozy, technika zaciskania hiperinsulinemiczno-euglikemicznego nie wymaga nienaruszonej funkcji przewodu pokarmowego ani wydzielania insuliny z trzustki, a tym samym pozwala na porównanie odpowiedzi na insulinę między osobami, które wykazują różnice w funkcji przewodu pokarmowego i/lub trzustki. Pomiary wychwytu glukozy przez mięśnie in vivo podczas ćwiczeń u ludzi są wykonywane często od 1960 roku5. Najpierw za pomocą technik równowagi tętniczo-żylnej6, a następnie za pomocą obrazowania za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) w połączeniu z pozytonowym analogiem glukozy, np. 18F-Fluoro-deoksy-glucose7. U gryzoni stymulowany wysiłkiem fizycznym wychwyt glukozy mięśniowej in vivo jest zwykle wykonywany przy użyciu radioaktywnych lub stabilnych analogów glukozy znakowanych izotopami8,9,10.
Metodą uzupełniającą pomiary poboru glukozy przez mięśnie in vivo, jest izolowanie i inkubacja małych mięśni od gryzoni, a następnie mierzenie wychwytu glukozy za pomocą radioaktywnych lub stabilnych analogów glukozy znakowanych izotopami11,12,13. Metoda ta pozwala na dokładne i wiarygodne określenie ilościowe wskaźników wychwytu glukozy w dojrzałych mięśniach szkieletowych i może być wykonywana w obecności różnych stężeń insuliny oraz podczas skurczu wywołanego stymulacją elektryczną. Co ważniejsze, pomiary wychwytu glukozy w izolowanych i inkubowanych mięśniach szkieletowych mają znaczenie przy badaniu fenotypu metabolicznego mięśni myszy, które przeszły różne interwencje (np. odżywianie, aktywność fizyczna, infekcje, terapie). Izolowany model mięśni szkieletowych jest również odpowiednim narzędziem do badania związków farmakologicznych, które mogą wpływać na wychwyt glukozy per se i/lub modyfikować wrażliwość na insulinę12,14. W ten sposób skuteczność związków przeznaczonych do regulacji metabolizmu glukozy w mięśniach może być testowana i oceniana w ściśle kontrolowanym środowisku przed kolejnymi testami in vivo na przedklinicznych modelach zwierzęcych.
W pewnych warunkach, żywotność metaboliczna może stanowić wyzwanie w izolowanym i inkubowanym systemie modelowym mięśni szkieletowych. Rzeczywiście, brak układu krążenia w inkubowanych mięśniach powoduje, że dostarczanie substratów (np. tlenu i składników odżywczych) w pełni zależy od prostej dyfuzji między włóknami mięśniowymi a otaczającym środowiskiem. W związku z tym ważne jest, aby inkubowane mięśnie były małe i cienkie, a zatem stanowiły mniejszą barierę dla dyfuzji tlenu podczas inkubacji15. Szczególnie podczas długotrwałych inkubacji trwających kilka godzin, stany niedotlenienia mogą rozwinąć się z powodu niewystarczającego dopływu tlenu, co skutkuje wyczerpaniem energii mięśni15. Chociaż różne markery żywotności metabolicznej w inkubowanych mięśniach szczurów były już wcześniej opisywane wraz z identyfikacją ważnych zmiennych, które pomagają utrzymać żywotność mięśni szczurów15, kompleksowa ocena żywotności metabolicznej w małych inkubowanych mięśniach myszy jest nadal uzasadniona. W związku z tym obecnie zawartość glikogenu jest głównie stosowana jako marker żywotności metabolicznej w inkubowanych mięśniach szkieletowych myszy 16,17.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół pomiaru podstawowego, stymulowanego insuliną i skurczem wychwytu glukozy w izolowanych i inkubowanych mięśniach płaszczkowatych i EDL od myszy przy użyciu radioznakowanej [3H]2-deoksy-D-glukozy i [14C]mannitolu jako markera zewnątrzkomórkowego. W niniejszym badaniu wychwyt glukozy mierzono w okresie 10 minut, a metoda została przedstawiona z wykorzystaniem submaksymalnych i maksymalnych skutecznych stężeń insuliny oraz protokołu pojedynczego skurczu. Jednak opisane tutaj protokoły można łatwo modyfikować pod względem czasu inkubacji, dawkowania insuliny i protokołu stymulacji elektrycznej. Ponadto zapewniamy dokładną charakterystykę różnych markerów żywotności metabolicznej w inkubowanym mięśniu płaszczkowatym i mięśniu myszy EDL. Wyniki wskazują, że suplementacja glukozy do buforu inkubacyjnego jest niezbędna do zachowania żywotności metabolicznej mięśni inkubowanych przez 1 godzinę.

<table><tbody><tr><td>[14C]D-mannitol</td><td>Amerykańskie chemikalia znakowane radioznakiem, Inc.</td><td>ARC 0127</td><td></td></tr><tr><td>[3H]2-deoksy-D-glukoza&nbsp;</td><td>Amerykańskie chemikalia znakowane radioaktywnie, Inc.</td><td>ART 0103A</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoksy-D-glukoza</td><td>Sigma</td><td>D8375</td><td></td></tr><tr><td>4-0 USP niesterylny chirurgiczny nylonowy szew</td><td>Aparat Harvarda</td><td>51-7698</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna/HRP (sprzężony)</td><td>DAKO</td><td>P0397</td><td>Służy do wykrywania białka ACC</td></tr><tr><td>Akt2</td><td>przeciwciało Sygnalizacja komórkowa</td><td>3063</td><td></td></tr><tr><td>AMPK&alpha; 2 przeciwciało</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19131</td><td></td></tr><tr><td>aprotynina</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>benzamidyna</td><td>Sigma</td><td>B6505</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td> Zestaw kalibracyjny <td>Merck</td><td>1020831000</td><td></td></tr> (<tr><td>siła)</td><td>Duńska Myo Technology A/S</td><td>300041</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescencja</td><td>Milipory</td><td>WBLUF0500</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Merck</td><td>1084180100</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Program do zbierania danych</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW wersja oprogramowania 7.1</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do dializy</td><td>Visking</td><td>DTV.12000.09 Rozmiar nr 9</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy system obrazowania</td><td>BioRad</td><td>ChemiDoc MP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EDTA Sigma EDS</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczny stymulator impulsów</td><td>Digitimer</td><td>D330 MultiStim System</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7637</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Novo Nordisk</td><td>Actrapid, 100 IE/ml</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>104873025</td><td></td></tr><tr><td>leupeptyna</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>1058860500</td><td></td></tr><tr><td>System miografu paskowego</td> mięśni <td>Duńska technologia Myo A/S</td><td>Model 820MS</td><td></td></tr><tr><td>Na-orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Na-pirofosforan</td><td>Sigma</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Na-pirogronian</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106041000</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S1504</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>VWR</td><td>27778260</td><td></td></tr><tr><td>pACC Ser212 </td><td>przeciwciało Sygnalizacja komórkowa</td><td>3661</td><td></td></tr><tr><td>pAkt Thr308</td><td>przeciwciało Sygnalizacja komórkowa</td><td>9275</td><td></td></tr><tr><td>pAMPK Przeciwciało Thr172</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2531</td><td></td></tr><tr><td>fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Platynowe elektrody</td><td>Duńska technologia Myo A/S</td><td>300145</td><td></td></tr><tr><td>pTBC1D4 Ser588</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>8730</td><td></td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny</td><td>Perkin Elmer</td><td>Tri-Carb-2910TR</td><td></td></tr><tr><td>Płyn scyntylacyjny&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013329</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analiz statystycznych</td><td>Systat</td><td>SigmaPlot wersja 14</td><td></td></tr><tr><td>TBC1D4 przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab189890</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>Merck</td><td>Milli-Q Reference A+ System</td><td></td></tr> <tr><td>&beta;-glicerofosforan</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych myszy

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Mięsień szkieletowy jest tkanką reagującą na insulinę i zazwyczaj pobiera większość glukozy, która dostaje się do krwi po posiłku. Ponadto doniesiono, że mięśnie szkieletowe mogą zwiększyć ekstrakcję glukozy z krwi nawet 50-krotnie podczas ćwiczeń w porównaniu z warunkami spoczynku. Wzrost wychwytu glukozy przez mięśnie podczas wysiłku fizycznego i stymulacji insuliną jest zależny od translokacji transportera glukozy 4 (GLUT4) z przedziałów wewnątrzkomórkowych do błony powierzchniowej komórek mięśniowych, a także fosforylacji glukozy do glukozo-6-fosforanu przez heksokinazę II. Izolacja i inkubacja mięśni myszy, takich jak m. soleus i m. extensor digitorum longus (EDL), jest odpowiednim modelem ex vivo do badania wpływu insuliny i skurczu indukowanego elektrycznie (model ćwiczeń) na wychwyt glukozy w dojrzałych mięśniach szkieletowych. W ten sposób model ex vivo pozwala na ocenę wrażliwości mięśni na insulinę i umożliwia dopasowanie produkcji siły mięśniowej podczas skurczu, zapewniając równomierną rekrutację włókien mięśniowych podczas pomiarów wychwytu glukozy przez mięśnie. Co więcej, opisany model nadaje się do badania związków farmakologicznych, które mogą mieć wpływ na wrażliwość mięśni na insulinę lub mogą być pomocne przy próbie określenia złożoności regulacyjnej wychwytu glukozy w mięśniach szkieletowych.
Tutaj opisujemy i udostępniamy szczegółowy protokół, jak mierzyć pobór glukozy stymulowany insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych preparatach mięśni płaszczkowatych i EDL od myszy przy użyciu radioznakowanej [3H]2-deoksy-D-glukozy i [14C]mannitolu jako markera zewnątrzkomórkowego. Pozwala to na dokładną ocenę wychwytu glukozy w dojrzałych mięśniach szkieletowych przy braku czynników zakłócających, które mogą zakłócać nienaruszony model zwierzęcy. Ponadto dostarczamy informacji na temat żywotności metabolicznej inkubowanych mięśni szkieletowych myszy, co sugeruje, że zastosowana metoda ma pewne zastrzeżenia w pewnych warunkach podczas badania metabolizmu energii mięśniowej.

Jak pokazano na Rysunku 2, podstawowe tempo wychwytu glukozy było podobne w izolowanych mięśniach soleus i EDL samic myszy. Było to zgłaszane już wielokrotnie wcześniej12,13,19,20. W odpowiedzi na podmaksymalne stężenie insuliny (100 µU/mL) wychwyt glukozy wzrósł odpowiednio około 0,8 i 0,6 razy, osiągając 12 i 9 µmol/g białka/h w m...

Nienaruszona regulacja wychwytu glukozy w mięśniach jest ważna dla utrzymania homeostazy glukozy w całym organizmie. Protokół ten przedstawia ocenę wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych przy jednoczesnym określeniu wpływu różnych interwencji fizjologicznych na metabolizm glukozy w całym organizmie.

Pomiar wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych myszy

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Model ex vivo jest przydatną metodą oceny wpływu różnych interwencji fizjologicznych i związków farmakologicznych na wychwyt glukozy przez mięśnie. Technika ta pozwala na dokładną ocenę wychwytu glukozy w izolowanych mięśniach szkieletowych myszy przy braku czynników zakłócających, które mogą zakłócać nienaruszony model zwierzęcy. Przed rozpoczęciem eksperymentu włącz zintegrowany system biograficzny muscle strip i ogrzej komory do 30 stopni Celsjusza.Otwórz oprogramowanie do zbierania danych i skalibruj przetworniki wymuszone, aby zapewnić porównywalność między zestawami danych. Dodaj cztery mililitry wstępnie podgrzanej pożywki do inkubacji o temperaturze 30 stopni Celsjusza do każdej komory inkubacyjnej i upewnij się, że podłoże jest stale natleniane 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla. Umieść mysz w pozycji leżącej na tacy sekcyjnej i potwierdź brak reakcji na odruch pedałowania.Następnie przygwoźdź pojedynczą przednią łapę igłą. Użyj nożyczek, aby usunąć skórę z podudzia, aż widoczne będzie zarówno ścięgno Achillesa, jak i staw kolanowy. W celu rozwarstwienia mięśnia płaszczkowatego przymocuj pojedynczą pętlę do szwów o średnicy 0,4 centymetra przygotowaną z 16-centymetrowego niewchłanialnego nylonowego kawałka szwu chirurgicznego do ścięgna Achillesa i przymocuj kleszcze do ścięgna Achillesa dystalnie do pętli.Wytnij, aby uwolnić mięśnie płaszczkowaty i brzuchaty łydki z łapy i ostrożnie przesuń kleszcze po myszy, aby odsłonić mięsień płaszczkowaty. Przygnij kleszcze do kołków i umieść drugą pętlę szwów wokół bliższego ścięgna mięśnia płaszczkowatego. Przeciąć ścięgno proksymalne i wypreparować płaszczkowaty, w tym dwie dołączone pętle szwów wolne od mięśnia brzuchatego łydki.Po pobraniu użyj pętli, aby szybko przymocować mięsień płaszczkowaty do odpowiednich haczyków w jednej z komór inkubacyjnych. Użyj kleszczy, aby usunąć powięź pokrywającą mięsień piszczelowy przedni. Dystalne ścięgna mięśni piszczelowych przednich lub EDL powinny być przezroczyste, białe, widoczne i oddzielone od siebie.Przetnij ścięgno destylacyjne mięśnia piszczelowego przedniego i wypreparuj mięsień. Użyj kleszczy, aby delikatnie uwolnić mięsień EDL z otaczających tkanek, pozostawiając mięsień nienaruszony bez przecinania ścięgien. Umieść indywidualne pętle szwów wokół destylacji i bliższych ścięgien EDL.Po umieszczeniu pętli przetnij ścięgna, aby uwolnić mięsień EDL z przymocowanymi pętlami do szwów i szybko przymocuj pętle do haczyków w drugiej komorze inkubacyjnej. Następnie dostosuj napięcie spoczynkowe każdego mięśnia do około pięciu miliniutonów i pozwól mięśniom zrównoważyć się w pożywce przez co najmniej 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Aby zmierzyć wychwyt glukozy stymulowany insuliną, należy zastąpić podstawową pożywkę inkubacyjną w komorach pożywką inkubacyjną bez insuliny, submaksymalnym efektywnym stężeniem insuliny lub maksymalnym efektywnym stężeniem insuliny przez 20 minut inkubacji.Pod koniec okresu stymulacji należy zastąpić pożywkę inkubacyjną pożywką do inkubacji wychwytu glukozy zawierającą identyczne stężenie insuliny przez 10 minut inkubacji. Pod koniec inkubacji wychwytu glukozy ostrożnie wyjąć mięśnie z komór inkubacyjnych i umyć próbki w lodowatej pożywce do inkubacji. Po umyciu szybko osusz mięśnie na bibule filtracyjnej i zamroź tkankę bez pętli szwów w ciekłym azocie.Następnie zbierz 100 mikrolitrów pożywki do inkubacji wychwytu glukozy z każdej komory do przechowywania w temperaturze 20 stopni Celsjusza i analizy wychwytu glukozy przez mięśnie. Aby zmierzyć wychwyt glukozy stymulowany skurczem, umieść elektrody platynowe centralnie i po obu stronach mięśni w komorach inkubacyjnych i rozpocznij skurcz mięśni natychmiast po zastąpieniu podstawowej pożywki inkubacyjnej pożywką do inkubacji wychwytu glukozy. Rejestruj wymuszoną produkcję z każdego inkubowanego mięśnia.Po 10 minutach delikatnie zebrać i zamrozić mięśnie, jak pokazano, przechowując 100 mikrolitrów podwielokrotności pożywki do inkubacji wychwytu glukozy z każdej komory do analizy wychwytu glukozy w mięśniach, jak pokazano. Aby określić sygnalizację mięśniowokomórkową za pomocą analizy western blotting w tym samym zestawie próbek mięśni, homogenizuj każdą zamrożoną próbkę mięśni w 400 mikrolitrach lodowatego buforu homogenizacyjnego i obracaj próbkę końcem na końcu przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zebrać likanian przez wirowanie i zmierzyć ilość białka będącego przedmiotem zainteresowania w każdej palecie próbek zgodnie ze standardowymi protokołami analizy western blot.Aby zmierzyć wychwyt glukozy w każdej próbce, należy dodać 150 mikrolitrów supernatantu z każdej próbki i 25 mikrolitrów pożywki do inkubacji wychwytu glukozy z odpowiednich komór inkubacyjnych, aby oddzielić fiolki do liczenia płynów scyntylacyjnych zawierające trzy mililitry płynnego płynu scyntylacyjnego na fiolkę. Następnie załadować fiolki na płynny licznik scyntylacyjny i zmierzyć radioaktywność dwóch deoksyglukozy i mannitolu zgodnie z wytycznymi producenta. W tej reprezentatywnej analizie wskaźniki podstawowego wychwytu glukozy były podobne między mięśniami płaszczkowatymi i EDL wyizolowanymi od samic myszy.Wychwyt glukozy zwiększył się w mięśniach płaszczkowatych i EDL w odpowiedzi na zarówno submaksymalne, jak i maksymalnie skuteczne stężenia insuliny. Co więcej, zarówno submaksymalne, jak i maksymalne wychwyty glukozy stymulowane insuliną były istotnie wyższe w mięśniu płaszczkowatym. W przeciwieństwie do tego, wychwyt glukozy wywołany skurczem był znacznie wyższy w EDL w porównaniu z mięśniem płaszczkowatym.Tutaj można zaobserwować maksymalną siłę mięśniową wytwarzaną w mięśniach płaszczkowatych i EDL podczas 10-minutowego okresu stymulacji. Zgodnie z oczekiwaniami, mięsień EDL generował większą siłę w początkowej części okresu stymulacji, po czym nastąpił szybki spadek w dalszej części okresu stymulacji. Submaksymalne i maksymalne stężenia insuliny indukowały wzrost fosforylacji treoniny Akt 308 i TBC1D4 seryny 588, podczas gdy skurcz indukował wzrost fosforylacji AMPK alfa treoniny 172 i seryny ACC 212.Ani insulina, ani skurcz nie doprowadziły do zmiany całkowitej zawartości białka. Przed próbą zmierzenia wychwytu glukozy w izolowanych mięśniach myszy ważne jest, aby dokładnie przećwiczyć sekcję mięśni płaszczkowatych i EDL. Po dokonaniu oceny wychwytu glukozy przez mięśnie, pozostały lizat białka mięśniowego można wykorzystać do dodatkowej analizy biochemicznej, która może wyjaśnić obserwowane zmiany w tempie wychwytu glukozy.

measurement-insulin-contraction-stimulated-glucose-uptake-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje szybką technikę ilościowego oznaczania translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony plazmatycznej komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Ilościowy pomiar translokacji GLUT4 do błony komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej

Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny, lub clamp insulinowy, jest złotym standardem w ocenie działania insuliny in vivo. Opisano metodę przeprowadzania clampów insulinowych u myszy. Obejmuje ona metodę cewnikowania tętniczego, która pozwala na wykonywanie eksperymentów na świadomych, nieskrępowanych myszach przy minimalnym stresie.

Zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u świadomych, nieunieruchomionych myszy

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Mysi mięsień brodawkowaty lewej komory może być użyty do zbadania kurczliwości serca in vitro. W tym artykule szczegółowo opisano izolację i protokoły eksperymentalne do badania charakterystyki kurczliwości serca.

Pomiary kurczliwości izolowanych mięśni brodawkowatych w celu zbadania inotropii serca u myszy

Wywołane insuliną rozszerzenie naczyń krwionośnych reguluje perfuzję mięśni i zwiększa powierzchnię mikrokrążenia (rekrutację mikronaczyniową) dostępną do wymiany substancji rozpuszczonej między krwią a śródmiąższem tkankowym. Przedstawiono połączoną mikroskopię przyżyciową i ultrasonografię ze wzmocnieniem kontrastowym w celu jednoczesnej oceny działania insuliny na większe naczynia i mikrokrążenie in vivo.

Połączona mikroskopia przyżyciowa i ultrasonografia tylna myszy ze wzmocnieniem kontrastowym w celu zbadania rozszerzenia naczyń krwionośnych i perfuzji mięśni wywołanego insuliną

To badanie opisuje protokół, który wykorzystuje obrazowanie 18F-FDG i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET/CT), wraz z modelowaniem kinetycznym, do ilościowego określenia in vivo, w czasie rzeczywistym wychwytu 18F-FDG do tkanek.

Określanie kinetyki metabolizmu glukozy za pomocą 18F-FDG Micro-PET/CT

W tej metodzie, ludzkie pierwotne komórki mięśniowe są hodowane in vitro w celu uzyskania zróżnicowanych miotub, a wskaźniki wychwytu glukozy są mierzone. Zapewniamy szczegółowy protokół do ilościowego określania wskaźników w stanach podstawowych i stymulowanych insuliną przy użyciu znakowanej radioaktywnie [3H] 2-deoksy-D-glukozy.

Pomiar wychwytu glukozy i odpowiedź na stymulację insuliną w ludzkich pierwotnych miotubach in vitro

Zewnątrzkomórkowe wyczerpanie fluorescencyjnie znakowanej glukozy koreluje z wychwytem glukozy i może być wykorzystane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych wychwytu glukozy w wyciętych organach i hodowlach komórkowych.

Zewnątrzkomórkowy zubożenie glukozy jako pośrednia miara wychwytu glukozy w komórkach i tkankach ex vivo

Zacisk hiperglikemiczny służy do pomiaru uwalniania insuliny przy utrzymującym się wyższym stężeniu glukozy we krwi. Zacisk hipoglikemiczny służy do pomiaru produkcji glukozy indukowanej reakcjami przeciwregulacyjnymi. Obie metody wykorzystują tę samą procedurę chirurgiczną. W tym miejscu przedstawiamy technikę zaciskową do oceny ogólnoustrojowego metabolizmu glukozy.

Zacisk hiperglikemiczny i zacisk hipoglikemiczny u świadomych myszy

W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką jako dodatkową technikę oceny funkcji endokrynnej trzustki z redukcją możliwych czynników zakłócających.

Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką

Poznaj metodę pomiaru wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych mięśniach szkieletowych myszy. Technika ex vivo umożliwia precyzyjną ocenę metabolizmu glukozy bez wpływu czynników systemowych.

Pomiar wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych myszy

Przeglądaj więcej filmów