Name: Wykorzystanie pierwotnych hodowanych neuronów hipokampa do badania składania początkowych segmentów aksonów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy składania segmentów początkowych aksonów w hodowanych neuronach hipokampa. Protokół wykorzystuje transfekcję ankyrin-G GFP do badania struktury AIS i jej wpływu na funkcję neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Gary'emu Bankerowi za sugestię dotyczącą protokołu hodowli neuronów. Praca ta jest wspierana przez Howard Hughes Medical Institute, grant z NIH oraz profesurę ufundowaną przez George'a Bartha Gellera (V.B.).

UWAGA: Ta metoda hodowli neuronów hipokampa od postnatalnych myszy 0-day ANK3-E22/23f/f jest zaadaptowana z systemu kokultury gleju/neuronów Gary'ego Bankera. Dlatego bardzo ważne jest, aby wykonać wszystkie kroki po sekcji w czystym okapie przy użyciu wysterylizowanych narzędzi. Ten protokół trwa do 1 miesiąca. Przepływ pracy jest wyświetlany w Rysunek 3. Protokół jest zgodny z wytycznymi Uniwersytetu Duke'a dotyczącymi zwierząt.
1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych i talerzy neuronalnych
<ol>
	<li>Co najmniej tydzień przed dniem hodowli załaduj szkiełka nakrywkowe na stojak i namocz je w kwasie azotowym (70% W/W) przez noc (można przedłużyć o kilka dni).</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe nasączone kwasem azotowym wodą destylowaną na wytrząsarce o niskiej prędkości w szklanym słoiku 2 razy po 1 godzinę każdy.</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe w nasyconym KOH rozpuszczonym w 100% etanolu przez noc. Dodaj KOH do etanolu, aż przestanie się rozpuszczać.</li>
	<li>Powtórz etap mycia wodą destylowaną. Szkiełka nakrywkowe płukać 100% etanolem raz przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieś szkiełka nakrywkowe ze stojaka do szklanej zlewki. Przykryj zlewkę folią aluminiową. Piecz szkiełka nakrywkowe w piekarniku w temperaturze 225 °C przez noc, aby je wysterylizować. (Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w zlewce przez tygodnie).</li>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego, a następnie nałóż 3-4 kropki wosku na szkiełko nakrywkowe, aby służyły jako stopy. Użyj pipety Pasteura, aby zanurzyć w gotowanym wosku w szklanej butelce. Następnie szybko dotknij szkiełka nakrywkowego, aby utworzyć kropkę. Szalka Petriego o średnicy 60 mm może pomieścić 4 szkiełka nakrywkowe. Szalka Petriego o średnicy 10 mm może pomieścić ~10 szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Na 2 dni przed dniem hodowli posmaruj szkiełka nakrywkowe (strona z kropkami wosku) filtrem wysterylizowanym 1 mg/ml poli-L-lizyny w 0,1 M kwasie borowym (pH 8,5) przez co najmniej 6 godzin i spłucz wodą 2 razy, za każdym razem po 1 godzinie. Szkiełka nakrywkowe pozostają na tej samej szalce Petriego.</li>
	<li>Powoli dodawać pożywkę galwaniczną (MEM uzupełnioną glukozą 0,6% (wag./obj.) i 10% (obj./obj.) surowicy końskiej) do płytek, nie naruszając szkiełek nakrywkowych. Umieść płytki w inkubatorze do dnia hodowli, aby wysiać neurony.</li>
</ol>
2. Przygotowanie potraw z karmienia komórek glejowych (2 tygodnie przed dniem hodowli)
<ol>
	<li>Wypreparuj korę mózgową z poporodowego 1-dniowego mózgu myszy i oderwij opony mózgowe.</li>
	<li>Posiekaj tkankę kory mózgowej tak drobno, jak to możliwe, czystymi nożyczkami na czystej szalce Petriego w czystej ławce.</li>
	<li>Przenieś posiekaną tkankę do 12 ml HBSS i dodaj 1,5 ml 2,5% trypsyny i 1% (wag./obj.) DNazy. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut, huśtać się co 5 minut. Dobrze strawione tkanki stają się lepkie i tworzą duże skupisko. Rozcieraj 10-15 razy pipetą o pojemności 10 ml, aby rozbić tkankę i uzyskać lepsze trawienie.</li>
	<li>Dobrze strawioną tkankę rozcierać 10-15 razy pipetą o pojemności 5 ml, aż większość kawałków zniknie, a podłoże stanie się mętne. Przepuść przez sitko komórkowe, aby usunąć pozostałe kawałki i dodaj 15 ml pożywki glejowej (Minimalna pożywka niezbędna (MEM) uzupełniona glukozą (0,6% wag./obj.), 10% (obj./obj.) surowicą konia i penicyliną-streptomycyną (1x), aby zatrzymać trawienie.</li>
	<li>Odwirować komórki o sile 120 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić osad komórkowy ze świeżą pożywką glejową i nasionami w szalkach do hodowli komórkowych (około 10,5 komórek/cm2).</li>
	<li>Zastąp pożywkę świeżą pożywką glejową następnego dnia, aby usunąć nieprzyłączone komórki.</li>
	<li>Podawaj naczynia z gleju co 3-4 dni świeżą pożywką glejową. Uderzyć kolbą 5-10 razy ręką, aby usunąć luźno przyczepione komórki przed zmianą podłoża.</li>
	<li>Po 10 dniach hodowli komórki glejowe powinny być prawie zlewające się. Odłącz komórki glejowe za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i wysiew około 105 komórek w nowym naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm. Pozostałe komórki można zamrozić do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Na 3 dni przed dniem hodowli zmień pożywkę glejową na pożywkę do hodowli neuronów (pożywka Neurobasal-A z 1x GlutaMAX-I i 1x suplementem B27).</li>
</ol>
3. Kultura neuronów hipokampa
UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej.
<ol>
	<li>Wypreparuj 6-8 hipokampów od postnatalnych 1-dniowych szczeniąt z myszy ANK3-E22/23f/f z pożywką HBSS na szalce Petriego w temperaturze pokojowej. Pokrój hipokampy nożyczkami preparacyjnymi na mniejsze kawałki. Przenieś hipokampy z szalki Petriego do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Umyj hipokampy 2x 5 ml HBSS w probówce. Po umyciu pozostaw hipokampy w 4,5 ml 1x HBSS.</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml 2,5% trypsyny do 4,5 ml HBSS i inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Odwracaj rurkę co 5 minut. Dobrze strawione hipokampy powinny stać się lepkie i tworzyć skupisko. W razie potrzeby przedłuż trawienie o kolejne 5 minut.</li>
	<li>Umyj hipokampy HBSS 3 razy po 5 minut. Nie używaj odkurzacza do wyjmowania HBSS. Usunięcie hipokampa jest bardzo łatwe.</li>
	<li>Po umyciu dodaj 2 ml HBSS i odpipetuj hipokampy w górę i w dół pipetą Pasteura 15 razy.</li>
	<li>Rozetrzeć tkankę wypolerowaną ogniowo pipetą Pasteura (średnica otworu jest zwężona o połowę) 10 razy. Nie przekraczaj 10 razy, nawet jeśli pozostały jeszcze kawałki. Nadmierne ścinanie zabija neurony.</li>
	<li>Odstaw probówkę na 5 minut, aż wszystkie kawałki opadną na dno. Delikatnie użyj końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby przenieść supernatant zawierający zdysocjowane neurony do szalek posiałkowych (105 komórek/szalka 60 mm). Dodaj go bezpośrednio do wstępnie inkubowanego podłoża galwanicznego i delikatnie potrząśnij płytką.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 3.6-3.7 z pozostałymi kawałkami, aż większość kawałków zniknie.</li>
	<li>2-4 godziny po wysianiu sprawdź naczynia galwaniczne pod mikroskopem świetlnym. Większość neuronów powinna była przyczepić się do szkiełka nakrywkowego. Dołączone komórki są okrągłe i jasne. Odwróć szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszczyków z cienką końcówką do naczyń do karmienia komórek glejowych z wstępnie przygotowanym podłożem do hodowli neuronów, stroną z kropkami woskowymi skierowanymi w dół.</li>
	<li>Neurony mogą rosnąć w naczyniach zasilających komórki glejowe przez okres do 1 miesiąca. Karm neurony co 7 dni 1 ml świeżej pożywki do hodowli neuronów.</li>
	<li>Krok opcjonalny: 1 tydzień po wysiewie dodać arabinozyd cytozyny (1-β-D-arabinofuranozyzycytozynę) do końcowego stężenia 5 μM, aby zahamować proliferację gleju.</li>
</ol>
4. Zakłócenie AIS przez nokaut Ankyrin-G na wcześniejszym etapie rozwoju neuronu
<ol>
	<li>Na 3 div (dzień in vitro) odwróć szkiełka nakrywkowe stroną z kropkami woskowymi skierowaną do góry do naczynia do karmienia komórek glejowych z kondycjonowaną pożywką do hodowli neuronów.</li>
	<li>Wymieszaj 0,25 μg DNA Cre-BFP z 0,5 μg DNA ankyryny-G-GFP (wagowo/zmutowanego) w probówce o pojemności 1,7 ml, aby przetransfekować 4 szkiełka nakrywkowe (stosunek liczby kopii DNA ~ 2:1). Dodać 100 μl pożywki hodowlanej (np. Opti-MEM), wymieszać i odpocząć na stojaku. Jeśli transfekowany jest tylko Cre-BFP, szkielet plazmidu GFP jest używany do dopasowania całkowitej ilości DNA.</li>
	<li>Zmieszać 3 μl odczynnika do transfekcji (np. Lipofectamine 2000) (~ 3 razy DNA) ze 100 μl pożywki hodowlanej w nowej probówce o pojemności 1,7 ml. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zmieszać 100 μl roztworu DNA z kroku 4.2 ze 100 μl odczynnika do transfekcji z kroku 4.3. Odpoczywaj przez 5-10 minut na stojaku.</li>
	<li>Dodaj 50 μl mieszanki DNA z kroku 4.4 bezpośrednio na każde szkiełko nakrywkowe, wkładając końcówkę tuż pod podłoże, nie dotykając szkiełek nakrywkowych. Pipetować powoli, aby uniknąć rozprzestrzeniania się mieszanki DNA.</li>
	<li>Powoli przenieś naczynie z powrotem do inkubatora i inkubuj przez 30-45 minut.</li>
	<li>Odwróć szkiełka nakrywkowe z powrotem do domowego naczynia do karmienia glejem stroną z kropkami wosku skierowaną w dół i włóż płytkę z powrotem do inkubatora.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja początkowego segmentu aksonu
<ol>
	<li>Napraw neurony na 7-10 div i wybarwić markerem AIS zgodnie ze standardowym protokołem immunocytochemicznym dla interesującego białka.</li>
	<li>Zbierz obrazy fluorescencyjne za pomocą żądanej mikroskopii.
	<ol>
		<li>Weź sekcje serii Z, aby zebrać sygnał z całego AIS. Zachowaj tę samą głębię Z dla wszystkich zdjęć.</li>
		<li>Dostosuj intensywność lasera, aby osiągnąć najlepszy zakres dynamiki intensywności pikseli.</li>
		<li>Upewnij się, że wszystkie zdjęcia AIS zostały wykonane przy użyciu tego samego mikroskopu.</li>
		<li>Zawsze sprawdzaj sygnał Cre-BFP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja AIS
	<ol>
		<li>Otwórz zdjęcie z Fidżi (https://fiji.sc).</li>
		<li>Generuj maksymalną projekcję obrazów z serii Z.</li>
		<li>Odejmij sygnał tła pustego szkiełka nakrywkowego od obrazu.</li>
		<li>Narysuj linię wzdłuż AIS. Szerokość linii powinna w pełni pokrywać AIS. Rozpocznij linię przed podniesieniem sygnału AIS ponad tło i zatrzymaj się, gdy opadnie na tło.</li>
		<li>Zmierz średnią intensywność pikseli samą linię i wyeksportuj do arkusza kalkulacyjnego (potrzebne jest ~10-15 AIS).</li>
		<li>Wygeneruj średnią krzywą intensywności AIS za pomocą skryptu MATLAB zaadaptowanego z Berger et al.15.</li>
		<li>Do każdego eksperymentu należy uwzględnić tylko Cre i Cre plus neurony transfekowane ankyryny-G typu dzikiego 480 kDa jako kontrole negatywne i pozytywne, aby upewnić się, że nokaut AIS jest skuteczny, a ratunek się powiedzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li>
<li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li>
<li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332(2017).</li>
<li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li>
<li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+activity+regulates+Na%28%2B%29+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li>
<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li>
<li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li>
<li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Made+for+%22anchorin%22%3A+Kv7.2%2F7.3+%28KCNQ2%2FKCNQ3%29+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li>
<li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G%3A+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Montaż AIS organizowany jest przez 480 kDa ankyrin-G. Jednak ankyryna-G ma krótsze izoformy, które mogą być ukierunkowane na AIS neuronów typu dzikiego, co może prowadzić do trudności w interpretacji analiz struktura-funkcja składania AIS. Poniżej przedstawiamy metodę wykorzystującą neurony myszy ANK3-E22/23-flox, która pozwala na badanie składania się de novo AIS. Poprzez transfekcję Cre-BFP w 3 div eliminujemy wszystkie endogenne izoformy ankyryny-G. Moglibyśmy również współtransfekować 480 kDa ankyry...

Początkowy segment aksonu znajduje się na proksymalnym akkonie u większości neuronów kręgowców. Funkcjonalnie AIS jest miejscem, w którym inicjowane są potencjały czynnościowe ze względu na dużą gęstość kanałów sodowych bramkowanych napięciem w tym regionie. AIS niektórych neuronów pobudzających są również celem interneuronów hamujących poprzez tworzenie synaps GABAergicznych1,2,3. Dlatego AIS jest krytycznym miejscem do integracji sygnalizacji komórkowej i modulowania pobudliwości neuronów. AIS ma zwykle długość 20-60 μm i znajduje się w odległości nie większej niż 20 μm od ciała komórki. Długość i położenie AIS różnią się w neuronach w różnych regionach mózgu, a także w różnych stadiach rozwoju tego samego neuronu4,5. Zgromadzone dowody sugerują, że skład i pozycja AIS są dynamiczne w reagowaniu na zmianę aktywności neuronalnej4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G jest głównym organizatorem AIS. 480 kDa ankyrin-G jest białkiem adaptorowym związanym z błoną, które bezpośrednio wiąże się z kanałami sodowymi bramkowanymi napięciem, a także z innymi głównymi białkami AIS, w tym beta4-spektryną, kanałami KCNQ2/3, które modulują aktywność kanału sodowego8,9, oraz 186 kDa neurofascin, L1CAM, który kieruje synapsy GABA-ergiczne do klasy AIS<sup="xref">2, 10. 480 kDa ankyrin-G ma kanoniczne domeny ankyryny znajdujące się w krótkiej izoformie ankyryny 190 kDa (powtórzenia ANK, domena wiążąca spektrynę, domena regulatorowa), ale wyróżnia się gigantycznym eksonem, który występuje tylko u kręgowców i jest specyficznie wyrażany w neuronach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)11,12. Domena specyficzna dla neuronu ankyryny-G (NSD) o sile 480 kDa jest wymagana do tworzenia AIS12. Ankyryna-G o mocy 190 kDa nie promuje składania AIS ani nie kieruje AIS w neuronach ankyrin-G-null12. Jednak 190 kDa ankyrin-G jest skoncentrowane w AIS zawierającym 480 kDa ankyrin-G12. Ta zdolność ankyryny-G o masie 190 kDa do celowania w wstępnie zmontowany AIS neuronów typu dzikiego była źródłem zamieszania w literaturze i spowolniła zrozumienie krytycznych wyspecjalizowanych funkcji ankyryny-G o masie 480 kDa w montażu AIS. Dlatego tak ważne jest zbadanie montażu AIS w neuronach ankyrynowo-G-zerowych, które nie mają wstępnie zmontowanego AIS.
Tutaj prezentujemy metodę badania montażu i struktury AIS przy użyciu hodowanych neuronów hipokampa myszy ANK3-E22/23-flox, która eliminuje wszystkie izoformy ankyryny-G13 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Poprzez transfekcję neuronów za pomocą konstruktu Cre-BFP przed złożeniem AIS, wygenerowaliśmy neurony z niedoborem ankyryny-G, całkowicie pozbawione AIS (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B, <silna klasa="xfig">Rysunek 2). Montaż AIS jest w pełni uratowany po kotransfekcji plazmidu ankyryny-G-GFP o masie 480 kDa z plazmidem Cre-BFP. Ta metoda umożliwia badanie zespołu AIS w niezmontowanym środowisku AIS. Zmodyfikowaliśmy również system kohodowli gleju i neuronów od Gary'ego Bankera bez użycia antybiotyków, wcześniej zaprojektowany dla neuronów embrionalnych dnia 18, do zastosowania w neuronach myszy po urodzeniu i dostosowaliśmy metodę kwantyfikacji AIS do uśredniania pomiarów AIS z wielu neuronów, aby znormalizować zmienność AIS14,15.

<table><tbody><tr><td>10xHBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>18mm szkło osłonowe (1.5D)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84-1D</td><td></td></tr><tr><td>190kDa ankyryna-G-GFP</td><td>Addgene</td><td>#31059</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Tripsin bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>480kDa ankyrin-G-GFP</td><td>lab made</td><td>Dostarcz na żądanie</td><td></td></tr><tr><td>ANK3-E22/23f/f myszy</td><td>JAX</td><td>Numer katalogowy: 029797</td><td>B6.129-ANK3TM2.1Bnt/J;</td></tr><tr><td>Suplement bez surowicy B27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Sitko komórkowe z siatką 70 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczny stojak do barwienia szkiełek nakrywkowych</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Cre-BFP</td><td>Addgene</td><td>#128174</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>suplement GlutaMAX-I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1286001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>MEM z Earle'em s sole i L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Kwas azotowy 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225711</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana surowica Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26124-78-7</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie pierwotnych hodowanych neuronów hipokampa do badania składania początkowych segmentów aksonów

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Początkowe segmenty aksonów neuronalnych (AIS) są miejscami inicjacji potencjałów czynnościowych i były intensywnie badane pod kątem ich struktury molekularnej, składania i plastyczności zależnej od aktywności. Gigantyczna ankyryna-G, główny organizator AIS, bezpośrednio wiąże się z kanałami sodowymi bramkowanymi napięciem (VSVG) i potasowymi (KCNQ2/3) obejmującymi błonę, a także neurofaszyną 186 kDa, cząsteczką adhezyjną komórek L1CAM. Gigantyczna ankyryna-G wiąże się również i rekrutuje cytoplazmatyczne cząsteczki AIS, w tym beta-4-spektrynę i białka wiążące mikrotubule, EB1 / EB3 i Ndel1. Gigantyczna ankyryna-G jest wystarczająca, aby uratować tworzenie AIS w neuronach z niedoborem ankyryny-G. Ankyrin-G zawiera również mniejszą izoformę o masie 190 kDa zlokalizowaną w kolcach dendrytycznych zamiast AIS, która nie jest w stanie skierować się do AIS ani uratować AIS w neuronach z niedoborem ankyryny-G. Tutaj opisaliśmy protokół wykorzystujący hodowane neurony hipokampa od myszy ANK3-E22 / 23-flox, które po transfekcji Cre-BFP wykazują utratę całej izoformy ankyryny-G i upośledzają tworzenie AIS. Połączyliśmy zmodyfikowany system kohodowli komórek glejowych i neuronów Bankera, opracowaliśmy metodę transfekcji neuronów zerowych ankyryny-G plazmidem ankyryny-G-GFP o masie 480 kDa, który jest wystarczający do uratowania tworzenia AIS. Ponadto stosujemy metodę kwantyfikacji, opracowaną przez Salzera i współpracowników, aby poradzić sobie ze zmiennością odległości AIS od ciał komórek neuronalnych, która występuje w kulturach neuronów hipokampa. Protokół ten umożliwia badania ilościowe montażu de novo i dynamicznego zachowania AIS.

Pełny zestaw eksperymentów powinien obejmować transfekcję samą Cre-BFP jako kontrolę negatywną, kotransfekcję Cre-BFP oraz ankyryny-G 480 kDa jako kontrolę pozytywną oraz warunek bez transfekcji jako kontrolę techniczną. W kontroli z samą Cre-BFP w transfekowanych neuronach brakuje akumulacji markerów AIS, w tym ankyryny-G (ankG), beta4-spektryny (β4), neurofaszyny (Nf) i napięciowo zależnych kanałów sodowych (VSVG) (Rysunek 4A)16. W przeciwieństwie do nich, neurony k...

Tutaj opisaliśmy protokół ilościowego badania montażu i struktury początkowych segmentów aksonów (AIS) neuronów hipokampa, które nie mają wstępnie zmontowanego AIS z powodu braku gigantycznej ankyryny-G.

Wykorzystanie pierwotnych hodowanych neuronów hipokampa do badania składania początkowych segmentów aksonów

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Protokół ten służy do ilościowego badania montażu i struktury początkowych segmentów aksonów neuronów hipokampa, które nie mają wstępnie zmontowanego AIS z powodu braku gigantycznej ankyryny-G. Na początek przeanalizuj sześć do ośmiu hipokampów od poporodowych, jednodniowych szczeniąt z pożywką HBSS na szalce Petriego. Pokrój hipokampy nożyczkami preparacyjnymi na mniejsze kawałki i przenieś je z naczynia do 15-mililitrowej tuby.Umyj hipokampy dwukrotnie pięcioma mililitrami HBSS i pozostaw je w 4,5 mililitrach HBSS po umyciu. Dodaj 0,5 mililitra 2,5% trypsyny do 4,5 mililitra HBSS i inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, odwracając rurkę co pięć minut. Dobrze strawione hipokampy powinny stać się lepkie i tworzyć skupisko.W razie potrzeby przedłuż trawienie o kolejne pięć minut. Umyj hipokampy HBSS trzy razy przez pięć minut na pranie. Po umyciu dodaj dwa mililitry HBSS i odpipetuj hipokampy w górę iw dół pipetą Pasteura 15 razy.Rozetrzeć tkankę wypolerowaną pipetą Pasteura 10 razy i odpocząć probówkę przez pięć minut, aż wszystkie kawałki osiądną na dnie. Powtarzaj rozcieranie z pozostałymi kawałkami, aż większość z nich zniknie. Następnie użyj jednomililitrowej końcówki pipety, aby delikatnie przenieść supernatant zawierający zdysocjowane neurony do naczyń galwanicznych.Dodaj go bezpośrednio do wstępnie inkubowanego podłoża galwanicznego i delikatnie potrząśnij płytką. Dwie do czterech godzin po wysianiu sprawdź naczynia do powlekania pod mikroskopem świetlnym. Większość neuronów powinna być przyczepiona do szkiełka nakrywkowego.Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką odwróć szkiełka nakrywkowe do naczyń do karmienia komórek glejowych zawierających wstępnie kondycjonowaną pożywkę do hodowli neuronów, stroną z kropkami woskowymi skierowanymi w dół. Neurony mogą rosnąć w naczyniach zasilających komórki glejowe przez okres do jednego miesiąca. Karm neurony co siedem dni jednym mililitrem świeżej pożywki do hodowli neuronów.Trzeciego dnia in vitro należy odwrócić szkiełka nakrywkowe stroną z woskową kropką skierowaną do góry do naczynia do karmienia komórek glejowych z kondycjonowaną pożywką do hodowli neuronów. Wymieszać 0,25 mikrograma CRE BFP DNA z 0,5 mikrograma ANKYRIN-G GFP DNA w probówce o pojemności 1,7 mililitra, aby wykonać transfekcję czterech szkiełek nakrywkowych. Dodaj optymalnie 100 mikrolitrów.Następnie wymieszaj probówkę i odpocznij na stojaku. Jeśli transfekowany jest tylko CRE BFP, szkielet plazmatyczny GFP jest używany do dopasowania całkowitej ilości DNA. Wymieszaj trzy mikrolitry odczynnika do transfekcji ze 100 mikrolitrami optimum w nowej probówce o pojemności 1,7 mililitra i inkubuj probówkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów wcześniej zmieszanego DNA ze 100 mikrolitrami mieszanki odczynników do transfekcji i pozostaw na pięć do 10 minut na stojaku. Dodaj 50 mikrolitrów mieszanki DNA na wierzch każdego szkiełka nakrywkowego, wkładając końcówkę tuż pod podłożem bez dotykania szkiełek nakrywkowych. Pipetować powoli, aby uniknąć rozprzestrzeniania się mieszanki DNA.Powoli przenieś naczynie z powrotem do inkubatora i pozostaw je tam na 30 do 45 minut. Odwróć pokrywę z powrotem do domowego karmnika glejowego stroną z woskową kropką skierowaną w dół i włóż naczynie z powrotem do inkubatora. Aby określić ilościowo AIS, otwórz obrazy z serii Z na Fidżi i wygeneruj maksymalną projekcję obrazów.Po odjęciu od obrazu sygnału tła pustego arkusza nakrywkowego narysuj linię wzdłuż AIS, upewniając się, że szerokość linii całkowicie zakrywa AIS. Rozpocznij linię przed podniesieniem sygnału AIS ponad tło i zatrzymaj się, gdy opadnie na tło. Zmierz średnią intensywność pikseli wzdłuż linii i wyeksportuj ją do arkusza kalkulacyjnego.Następnie uruchom skrypt MATLAB, aby wygenerować ostateczną figurę. Eksperyment powinien obejmować transfekcję tylko Cre-BFP jako kontrolę negatywną, Cre-BFP plus kotransfekcję 480 kilodaltonu ankyryny-G jako kontrolę pozytywną oraz stan nietransfekowany jako kontrolę techniki. W grupie kontrolnej tylko Cre-BFP transfekowane neurony nie mają akumulacji markerów AIS, w tym ankyryny-G, spektryny beta 4, neurofaszyny i kanałów sodowych bramkowanych napięciem.W przeciwieństwie do tego, neurony współtransfekowane Cre i 480 kilodaltonem ankyryny-G mają w pełni złożony AIS, o czym świadczy obecność markerów AIS. Ważne jest, aby potwierdzić jakość kultury poprzez porównanie z potrawami nietransfekowanymi. Niezdrowe neurony mają tendencję do wykazywania nieprawidłowej struktury AIS, takiej jak przerwany lub ektopowy AIS.Aby ocenić, w jaki sposób mutacja ludzkiego zaburzenia neurorozwojowego ankyryny-G wpływa na składanie AIS, wykreślono średnią intensywność AIS od somy do dystalnego aksonu. Białka wzbogacone w AIS zwykle wykazują szybki wzrost sygnału z proksymalnego aksonu i powolny spadek sygnału do dystalnego aksonu. Po wyrównaniu z nietransfekowanym AIS, krzywa mutanta jest szersza, a szczyt krzywej jest niższy, co sugeruje zmianę struktury AIS.Dziki typ ankyryny-G zmontowany AIS był ściśle wyrównany z nietransfekowanym.

use-primary-cultured-hippocampal-neurons-to-study-assembly-axon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wyizolowanie i hodowla komórek z konkretnego obszaru mózgu ułatwia badanie parametrów komórkowych i fizjologicznych. Opisujemy metodę pierwotnej hodowli komórek, która pozwala na uzyskanie kultur wzbogaconych w neurony w środowisku bezsurowiczym.

Hodowla pierwotna neuronów hipokampa z noworodków szczurów w dniu P0

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Film demonstruje metodę hodowli neuronów z mysich hipokampów. Początkowo hipokampy przechodzą trawienie enzymatyczne w celu rozbicia zewnątrzkomórkowej macierzy tkankowej. Następnie strawiona tkanka jest mechanicznie rozrywana w celu wyizolowania pojedynczych neuronów. Wreszcie, neurony te są hodowane na komórkach glejowych.

Technika hodowli neuronów hipokampa myszy

Ten film ilustruje metodę ustanawiania pośredniej kokultury neuronów i astrocytów przy użyciu podejścia opartego na podziałach. W tej konfiguracji neurony i astrocyty są przestrzennie oddzielone, ale mają wspólne uwarunkowane podłoże. Czynniki neurotroficzne uwalniane przez astrocyty sprzyjają różnicowaniu neuronów i tworzeniu połączeń synaptycznych, co sugeruje interakcje neuron-glej.

Technika pośredniej kohodowli neuronów i astrocytów do badania interakcji neuron-glej

Opisujemy procedury znakowania i genotypowania nowonarodzonych myszy oraz generowania z nich pierwotnych kultur neuronalnych. Genotypowanie jest szybkie, wydajne i niezawodne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych. Jest to szczególnie przydatne w przypadku myszy ze śmiertelnością noworodków i ich hodowli, które wymagają wcześniejszego zakończenia genotypowania.

Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

Kultury o niskiej gęstości pierwotnych neuronów hipokampa zazwyczaj wymagają warstwy zasilającej glej, aby dostarczyć czynników neurotroficznych i utrzymać długowieczność. Opisujemy tutaj uproszczoną metodę hodowli neuronów o ultra niskiej gęstości na szklanych szkiełkach nakrywkowych w obecności warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości, co ułatwia badanie specyficznych mechanizmów neuronalno-autonomicznych.

Uproszczona metoda długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości

Ten artykuł opisuje protokół hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości rosnących na szklanych szkiełkach nakrywkowych odwróconych na monowarstwie glejowej. Warstwy neuronów i glejowe są oddzielone kulkami wosku parafinowego. Neurony wyhodowane tą metodą nadają się do obrazowania optycznego o wysokiej rozdzielczości i testów funkcjonalnych.

Pierwotna hodowla neuronów hipokampa o niskiej gęstości

Prezentowany tutaj jest protokół spontanicznego generowania neurosfer wzbogaconych w neurony progenitorowe neuronów o dużej gęstości. Podczas tego samego eksperymentu, gdy neurony są powlekane o mniejszej gęstości, protokół powoduje również przedłużone hodowle pierwotnych neuronów szczurów.

Generowanie neurosfer z mieszanych pierwotnych neuronów hipokampa i kory mózgowej wyizolowanych z zarodka szczura E14-E16 Sprague Dawley

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Gotowy do użycia zamrożony zasób neuronów jest potężnym narzędziem do oceny funkcji synaptycznych. Tutaj wprowadzamy łatwą hodowlę pierwotną o niskiej gęstości z zamrożonego wywaru przy użyciu 96-dołkowej płytki.

Łatwa i powtarzalna hodowla pierwotna o niskiej gęstości przy użyciu zamrożonego materiału embrionalnych neuronów hipokampa

Poznaj metodę ilościowej analizy składania segmentów początkowych aksonów w hodowanych neuronach hipokampa. Protokół wykorzystuje transfekcję ankyrin-G GFP do badania struktury AIS i jej wpływu na funkcję neuronów.

Wykorzystanie pierwotnych hodowanych neuronów hipokampa do badania składania początkowych segmentów aksonów

Przeglądaj więcej filmów