Name: Plasmodium falciparum (Plasmodium falciparum) Hodowla gametocytów i infekcja komarów poprzez sztuczne karmienie błoną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę hodowli gametocytów Plasmodium falciparum i infekcji komarów poprzez sztuczne karmienie błoną. Protokół ten umożliwia badanie biologii transmisji malarii i generowanie sporozoitów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Bloomberg Philanthropies za wsparcie finansowe dla Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Prace te nie byłyby możliwe bez specjalistycznej wiedzy zapewnionej przez główne ośrodki JHMRI w zakresie owadów i parazytologii.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Malaria+Report%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">World Malaria Report.</a> World Health Organization. , (2018).</li>
<li>Sinden, R. E., Smalley, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametocytogenesis+of+Plasmodium+falciparum+in+vitro%3A+The+cell-cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle.</a> Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).</li>
<li>Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+Development+of+Malarial+Parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Sexual Development of Malarial Parasites.</a> Advances in Parasitology. 22, 153-216 (1983).</li>
<li>Joice, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+transmission+stages+accumulate+in+the+human+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow.</a> Science Translational Medicine. 6 (244), 5(2014).</li>
<li>Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+Plasmodium+falciparum+gametocytes+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow.</a> American Journal of Hematology. 85 (12), 943(2010).</li>
<li>Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+sporozoite+invasion+of+the+mosquito+salivary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).</li>
<li>Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+malaria+parasites+in+the+mosquito+midgut%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The development of malaria parasites in the mosquito midgut.</a> Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).</li>
<li>Trager, W., Jenson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+malarial+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cultivation of malarial parasites.</a> Nature. 273 (5664), 621-622 (1978).</li>
<li>Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+Plasmodium+falciparum+gametocytes+for+malaria+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery.</a> Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).</li>
<li>Delves, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+in+vitro+culture+of+P.+Falciparum+gametocytes+to+evaluate+novel+transmission-blocking+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).</li>
<li>Habtewold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+SMFA+and+mosquito+dark-feeding+regime+significantly+improve+malaria+transmission-blocking+assay+robustness+and+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity.</a> Malaria Journal. 18 (1), 24(2019).</li>
<li>Demanga, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+sexual+stage+malaria+gametocytes+in+a+Wave+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+and+Vectors%22%5BJournal%5D)">The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor.</a> Parasites and Vectors. 10 (1), 216(2017).</li>
<li>Brockelman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+favoring+gametocytogenesis+in+the+continuous+culture+of+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).</li>
<li>Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeibalan%2C+E+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22">Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine</a>. 7, (2017).</li>
<li>Essuman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gametocyte+biomarker+for+superior+molecular+detection+of+the+plasmodium+falciparum+infectious+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs.</a> Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).</li>
<li>Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+of+plasmodium+is+anopheles+species+specific+and+infection+intensity+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent.</a> mBio. 8 (5), 01631(2017).</li>
<li>Oakley, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+based+detection+of+Plasmodium+falciparum+development+in+Anopheles+stephensi+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes.</a> Scientific Reports. 8, 11568(2018).</li>
<li>Saraiva, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromobacterium+spp.+mediate+their+anti-Plasmodium+activity+through+secretion+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+romidepsin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin.</a> Scientific Reports. 8, 6176(2018).</li>
<li>Tao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-partitioning+of+the+Plasmodium+falciparum+stage+V+gametocyte+proteome+provides+insight+into+falciparum-specific+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).</li>
<li>Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+enhanced+chemiluminescent-ELISA+for+the+detection+of+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+antigen+in+midguts+of+Anopheles+stephensi+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes.</a> Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).</li>
<li>Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimalarial+iron+chelator+FBS0701+blocks+transmission+by+Plasmodium+falciparum+gametocyte+activation+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).</li>
<li>Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametocytocidal+screen+identifies+novel+chemical+classes+with+Plasmodium+falciparum+transmission+blocking+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity.</a> PLoS One. 9 (8), 105817(2014).</li>
<li>Lindner, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomics+and+proteomics+reveal+two+waves+of+translational+repression+during+the+maturation+of+malaria+parasite+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites.</a> Nature Communications. 10, 4964(2019).</li>
<li>McLean, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Transmission-Competent+Human+Malaria+Parasites+with+Chromosomally-Integrated+Fluorescent+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters.</a> Scientific Reports. 9, 13131(2019).</li>
<li>Espinosa, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+Cleavage+of+the+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+Is+a+Target+of+Protective+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).</li>
<li>Swearingen, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+Plasmodium+Sporozoite+Surface%3A+Identification+of+Surface-Exposed+Proteins+and+Demonstration+of+Glycosylation+on+CSP+and+TRAP+by+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606(2016).</li>
<li>Ifediba, T., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+in+vitro+maturation+of+Plasmodium+falciparum+gametocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes.</a> Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).</li>
<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inter-laboratory+comparison+of+standard+membrane-feeding+assays+for+evaluation+of+malaria+transmission-blocking+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines.</a> Malaria Journal. 15, 463(2016).</li>
<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualification+of+Standard+Membrane-Feeding+Assay+with+Plasmodium+falciparum+Malaria+and+Potential+Improvements+for+Future+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays.</a> PLoS One. 8 (3), 57909(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj metody są z powodzeniem stosowane w Johns Hopkins Malaria Research Institute od ponad 10 lat 15,16,17,18,19,20,21,22. Gametocyty wytworzone przy użyciu tego protokołu zostały wykorzystane do wysokoprzepustowych testów gametocytocydowych<sup cl...

Malaria jest wywoływana przez pasożyty Plasmodium i jest przenoszona na ich kręgowców poprzez zakaźne ukąszenie samic komarów Anopheles. Według raportu Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) z 2019 r. odnotowano około 405 000 zgonów z łącznej liczby 228 milionów przypadków malarii1. Większość zgonów związanych z malarią koncentrowała się w regionie Afryki, zwłaszcza wśród dzieci poniżej piątego roku życia. Podczas gdy ogólny wskaźnik zachorowalności na malarię spadł na całym świecie od 2010 r., w ostatnich latach spadek ustabilizował się i pilnie potrzebne są dodatkowe strategie kontroli w celu wyeliminowania choroby.
Cykliczne bezpłciowe stadia pasożytów malarii we krwi powodują patogenezę choroby, a niewielka część z nich różnicuje się na gametocyty żeńskie i męskie. Gametocyty Plasmodium falciparum są wyjątkowe z natury, ponieważ rozwijają się w ciągu 7-10 dni przez pięć morfologicznie odrębnych etapów. Niedojrzałe gametocyty od stadium I do IV są sekwestrowane w miąższu szpiku kostnego i w dużej mierze pozostają nieobecne w krążeniu obwodowym2,3,4,5. Erytrocyty zakażone dojrzałymi gametocytami V stopnia są uwalniane do krwiobiegu i swobodnie krążą, aby zostać wchłonięte przez komary. Po dostaniu się do jelita środkowego komara gametocyty są aktywowane poprzez zmianę temperatury i wystawienie na działanie środowiska jelita środkowego, przekształcają się w gamety żeńskie i męskie i rozpoczynają rozwój stadiów komara, których kulminacją są zakaźne stadia sporozoitów w gruczołach ślinowych komarów6,7.
Odkąd Trager i Jenson8 opisali ustandaryzowaną metodę hodowli P. falciparum, badania nad bezpłciowymi stadiami krwi znacznie się rozwinęły. Jednak brak wiarygodnego systemu hodowli dla stadiów płciowych utrudnił badanie gametocytów P. falciparum, biologii transmisji i stadiów komarów. W ostatnich latach opublikowano kilka metod, które pomogły laboratoriom w tworzeniu kultur gametocytów9,10,11,12. Manuskrypt ten opisuje ustandaryzowany i niezawodny protokół hodowli gametocytów P. falciparum, które mogą stanowić cenne źródło informacji dla społeczności badawczej zajmującej się malarią. Metoda ta umożliwia solidną produkcję dojrzałych i zakaźnych gametocytów, co wraz ze znormalizowanym protokołem karmienia komarów skutkuje wysoce wiarygodną zakaźnością komarów. Metody te zostały opracowane w celu utrzymania nieprzerwanego dopływu gametocytów i pasożytów w stadium komarów. W tym manuskrypcie opisujemy dokładny protokół hodowli gametocytów (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1), przygotowanie karmników z membraną szklaną i zakażenie komarów za pomocą tych karmników membranowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2), rozwarstwienie jelita środkowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3) i gruczołu ślinowego komarów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4) oraz ilościowe określenie infekcji u komarów po rozwarstwieniu jelita środkowego i ślinianki.

<table><tbody><tr><td>10% roztwór cukru</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10ml pipeta serologiczna</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubka stożkowa</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>1ml pipeta serologiczna</td><td>Falcon</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipeta serologiczna</td><td>Falcon</td><td>357535</td><td></td></tr><tr><td>37&deg; C Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurka stożkowa</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>5ml pipeta serologiczna</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9-calowa szklana pipeta</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Anopheles Komary</td><td>JHMRI, rdzeń owadobójczy</td><td></td><td>Używamy licznika</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td></td>komórek</tr> A. stephensi lub A. gambiae (keele) <tr>Kąpiel <td></td><td></td><td></td>w<td>wodzie cyrkulacyjnej</td></tr><tr><td>kleszcze z cienką końcówką</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Bejca Geimsa</td><td>Sigma</td><td>GS1L</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td></td><td></td><td></td>szklany</tr><tr><td>Podajnik</td> <td>z membraną szklanąChemglass Life Sciences</td><td>CG183570</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka krew O+</td><td>JHU</td><td></td><td>Umyj erytrocyty krwinkami czerwonymi trzykrotnie za pomocą RPMI i wstaw do lodówki przy 50% hematokrycie</td></tr><tr><td>Surowica ludzka O+</td><td>Międzystanowy bank</td><td></td> krwi <td>Zbierz co najmniej 6 jednostek surowicy od różnych dawców i zamroź porcje w temperaturze -20& stopień C.</td></tr><tr><td>Hipoksantyna</td><td>Sigma</td><td>H9337</td><td>Zrób 500x zapas w 1M</td></tr><tr><td>NaOH Mercurochrome</td><td>Sigma</td><td>M7011</td><td>Przygotuj 1% roztwór podstawowy w PBS, który w razie potrzeby można rozcieńczyć do 0,1%</td></tr><tr><td>Mikroskop mikropipetowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td>Każdy mikroskop z obiektywem 10x, 40x i 100x będzie działał.</td></tr><tr><td>Kubeczki na komary</td><td>Neptun Miseczki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-acetyloglukozaminy</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td>Opcjonalne i potrzebne tylko wtedy, gdy wymagane są czyste gametocyty.</td></tr><tr><td>Siatka</td><td></td><td></td><td>Upewnij się, że może zawierać komary i umożliwiać karmienie krwią</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Thermo Scientific</td><td>249964</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki</td><td></td><td></td><td></td>do pipet</tr><tr><td>Pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmodium falciparum NF54</td><td>BEI Resources</td><td>MRA-1000</td><td>Zamroź dużą liczbę kultur wczesnego pasażu, aby upewnić się, że masz stały dopływ</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>CV-041-CV</td><td>Pożywka zawiera glutaminę i HEPES</td></tr><tr><td>Podgrzewacz</td><td></td><td></td><td></td>do slajdów</tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td>Opcjonalnie dla pożywki, dodawać tylko w przypadku stosowania mieszanki gazów malarii podczas kąpieli wodnej</td></tr><tr><td></td><td></td> inkubacji hodowli<td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas ksanturenowy</td><td>Sigma</td><td>D120804</td><td>Do pożywek wiciowych</td></tr></tbody></table>

plasmodium falciparum (plasmodium falciparum) hodowla gametocytów i infekcja komarów poprzez sztuczne karmienie błoną

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Malaria pozostaje jednym z najważniejszych problemów zdrowia publicznego, powodując znaczną zachorowalność i śmiertelność. Malaria jest chorobą przenoszoną przez komary przenoszoną przez zakaźne ukąszenie samicy komara Anopheles. Zwalczanie malarii będzie ostatecznie opierać się na wielu podejściach, które obejmują sposoby blokowania przenoszenia się na, przez i od komarów. Aby zbadać stadia pasożytów malarii w laboratorium, zoptymalizowaliśmy protokół hodowli wysoce zakaźnych gametocytów Plasmodium falciparum, stadium pasożyta wymaganego do przeniesienia się z ludzkiego gospodarza na wektora komara. Gametocyty P. falciparum dojrzewają w pięciu morfologicznie odrębnych etapach, co trwa około 1-2 tygodni. Hodowla gametocytów opisana w tym protokole jest zakończona w ciągu 15 dni i są zakaźne dla komarów od 15 do 18 dni. Protokoły te zostały opracowane w celu utrzymania ciągłego cyklu infekcji kompetentnych gametocytów i utrzymania nieprzerwanego dostarczania komarów w stadiach pasożyta. Tutaj opisujemy metodologię hodowli gametocytów i sposób zakażania komarów tymi pasożytami za pomocą karmników ze szklaną membraną.

W niniejszym rozdziale przedstawiamy wyniki serii karmienia membranowego z wykorzystaniem kultur gametocytów P. falciparum NF54 wygenerowanych zgodnie z powyższym protokołem (patrz (Rysunek 5). Hodowlę gametocytów rozpoczęto w Dniu 0 od około 0,5% kultury aseksualnej w mieszanych stadiach, która do Dnia 4 i Dnia 5 osiągnęła szczytową parasytemię na poziomie około 15%. Jak pokazano na Rysunku 5A, przy tak wysokiej parasitemii pasożyty są poddane stresowi...

Szczegółowe badania nad stadiami pasożytów malarii u komarów są niezbędne do opracowania skutecznych strategii blokowania transmisji. Protokół ten pokazuje, jak skutecznie hodować zakaźne gametocyty, a następnie karmić te gametocyty komarami w celu wytworzenia stadiów komara P. falciparum.

Plasmodium falciparum (Plasmodium falciparum) Hodowla gametocytów i infekcja komarów poprzez sztuczne karmienie błoną

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease ...

Gametocyty są odpowiedzialne za przenoszenie pasożytów malarii. Generowanie zakaźnych gametocytów w laboratorium jest kluczem do badania biologii transmisji w stadiach komarów oraz do generowania sporozoitów w celu uzyskania późniejszych wyników. Metody te są proste do przyjęcia przez każde laboratorium, a demonstracja wizualna pomoże w dzieleniu się tymi procedurami z ogólnoświatową społecznością zajmującą się malarią.Procedurę zademonstrują ze mną moi koledzy, Godfree Mlambo, nasz starszy pracownik naukowy, i Sachie Kanatani, nasz adiunkt, oboje z Johns Hopkins Malaria Research Institute. Aby założyć hodowlę gametocytów, odwiruj pięć mililitrów kultury karmowej w wirówce i ponownie zawiesić osad w 30 mililitrach kompletnego podłoża. Wymieszaj 1,2 mililitra upakowanych czerwonych krwinek z zawartością probówki i dodaj pięć mililitrów powstałej zawiesiny do każdej studzienki sześciodołkowej płytki hodowlanej.Następnie umieść talerz w słoiku ze świecą w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Każdego dnia przez następne 15 do 18 dni ostrożnie odsysaj 70 do 80% supernatantu kultury z każdej studzienki i użyj pipety serologicznej, aby dodać pięć mililitrów świeżej pożywki bez krwinek po ści

plasmodium-falciparum-gametocyte-culture-mosquito-infection-through

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie opornego na wirusa dengue, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom wirusowym u komarów. Niniejszy protokół ilustruje sposób badania stopnia zakażenia komarów wirusem dengue. Przedstawiono techniki namnażania wirusa w kulturze, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania miana wirusa w jelicie środkowym komara.

Protokół infekcji denga w komarach (A. aegypti) i określanie fenotypu infekcji

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie odpornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom Plasmodium w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy stopnia infekcji komarów przez Plasmodium. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania mian wirusów w jelicie środkowym komara.

Protokół zakażania komarów *Plasmodium falciparum* i określania fenotypu zakażenia

Ten film demonstruje generowanie eksperymentalnego mysiego modelu malarii mózgowej. Sporozoity wyizolowane z samic komarów zakażonych Plasmodium berghei są wstrzykiwane do uwięzionych żył ogonowych myszy, co prowadzi do przerwania bariery krew-mózg i zapalenia mózgu, powodując malarię mózgową. Ten zakażony model myszy stanowi cenne narzędzie do badania in vivo patologii mikrokrążenia związanej z malarią mózgową.

Wygenerowanie mysiego modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem sporozoitów pochodzących od komarów gospodarzy

Gruźlica i malaria to dwie z najbardziej rozpowszechnionych infekcji u ludzi oraz główne przyczyny zachorowalności i śmiertelności w zubożałych populacjach w tropikach. Stworzyliśmy eksperymentalny system modelowy do badania wyników koinfekcji malarią i gruźlicą u myszy po prowokacji obydwoma patogenami za pośrednictwem ich naturalnej drogi zakażenia.

Model eksperymentalny do badania koinfekcji gruźlicą i malarią po naturalnym przenoszeniu Mycobacterium tuberculosis i Plasmodium berghei

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Tutaj opisujemy nową metodę, która pomaga wyjaśnić mechanizmy odporności komórkowej na Plasmodium podczas fazy infekcji krwi. Jest to test in vitro, który mierzy zabijanie zakażonych krwinek czerwonych przez limfocyty cytotoksyczne.

In vitro Test zabijania krwinek czerwonych zakażonych zarodźcem przez limfocyty cytotoksyczne

Malaria jest przenoszona przez inokulację stadium sporozoitu Plasmodium przez zakażone komary. Transgeniczne zarodźce pozwoliły nam lepiej zrozumieć biologię malarii i bezpośrednio przyczyniły się do opracowania szczepionki przeciwko malarii. W tym miejscu opisujemy uproszczoną metodologię generowania transgenicznych sporozoitów Plasmodium berghei.

Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei

Genetyka chemiczna polega na zastąpieniu reszty strażnika aminokwasem zawierającym inny łańcuch boczny w docelowym locus. W tym przypadku wygenerowaliśmy zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 i zidentyfikowaliśmy szlaki kompensacyjne przyjęte przez pasożyta na tle mutacji.

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

Rozwój płciowy zarodźca zachodzi w jelicie środkowym komara. Celowanie w stadia płciowe pasożyta jest obiecującą strategią blokowania transmisji. Opracowaliśmy Ookluc, transgeniczny P. berghei wykazujący ekspresję nanolucyferazy po utworzeniu zygoty, umożliwiający wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków blokujących transmisję. W tym artykule szczegółowo opisano metody badań przesiewowych przy użyciu Ookluc.

Ookluc: Linia Plasmodium berghei do identyfikacji związków blokujących transmisję

Poznaj metodę hodowli gametocytów Plasmodium falciparum i infekcji komarów poprzez sztuczne karmienie błoną. Protokół ten umożliwia badanie biologii transmisji malarii i generowanie sporozoitów.

Plasmodium falciparum (Plasmodium falciparum) Hodowla gametocytów i infekcja komarów poprzez sztuczne karmienie błoną

Przeglądaj więcej filmów