Name: Kwantyfikacja wirusa wścieklizny w różnych strukturach mózgu bydła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Poznaj metodę qRT-PCR do kwantyfikacji wirusa wścieklizny w strukturach mózgu bydła. Technika ta umożliwia wykrywanie niskich stężeń RNA wirusowego z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowy Instytut Badań nad Rolnictwem, Leśnictwem i Zwierzętami Gospodarskimi (INIFAP). Dziękujemy Jerzaynowi Fraustro Esquivelowi za współpracę przy tworzeniu filmu związanego z tym dokumentem.

To badanie zostało zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z zaleceniami dotyczącymi wykorzystania zwierząt dostarczonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).
1. Próbki
<ol>
	<li>Do analizy RT-PCR należy użyć różnych obszarów mózgu wypreparowanych z 6 różnych mózgów bydlęcych zakażonych wścieklizną.</li>
</ol>
2. Bezpośrednie przeciwciała fluorescencyjne (DFA) potwierdzające wściekliznę
UWAGA: Wykrywanie antygenu wścieklizny przez DFA jest jakościową metodą określania obecności nukleoproteiny wścieklizny za pomocą przeciwciał znakowanych fluoresceiną. Test został przeprowadzony przy użyciu protokołu dostarczonego przez Dean et al. (1966)20, jak opisano poniżej.
<ol>
	<li>Wykonaj dwa wyciski z każdej tkanki wypreparowanej z różnych struktur mózgu na sterylnym szkiełku o średnicy około 15 mm. Za pomocą drewnianego aplikatora rozsmaruj około 3mm3 część tkanki na sterylnym szkiełku. Aby utworzyć rozmaz, delikatnie dociśnij ręcznie drewniany aplikator do szkiełka.</li>
	<li>Utrwalić szkiełka do rozmazywania próbki, zanurzając je w 100% acetonie na 1 godzinę w temperaturze -20 °C. Po inkubacji suszyć szkiełka na suchej szmatce w temperaturze 21 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 50 μl przeciwciała antynukleoproteinowego znakowanego fluoresceiną do każdego rozmazu mózgu w rozcieńczeniu 1:10, dozując przez strzykawkę.</li>
	<li>Inkubować szkiełka z koniugatem w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po inkubacji przemyć szkiełka dwukrotnie wodą i PBS w celu wyeliminowania nadmiaru koniugatu. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia w temperaturze 21 °C. Ostrożnie osuszyć, aby usunąć nadmiar płynu, a następnie krótko wysuszyć na powietrzu przed montażem.</li>
	<li>Dodaj kroplę 50% gliceryny fosforanowej, aby pokryć powierzchnię sekcji, a następnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj skrawki pod mikroskopem epifluorescencyjnym przy 40-krotnym powiększeniu.
	<ol>
		<li>Przetwarzać i obserwować kontrole dodatnie i ujemne (kontrola pozytywna: mózgi myszy zaszczepione RABV; kontrole negatywne: mózgi bydlęce ujemne pod względem RABV) w taki sam sposób, jak próbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Generowanie kontroli pozytywnej dla RT-PCR
<ol>
	<li>Pozyskać komórki BHK-21 z banku plazmy zarodkowej. Użyj komórek do 70. pasażu, aby zreplikować szczep RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) za pomocą przejścia 2.</li>
	<li>Utrzymuj i rozmnażaj komórki BHK-21 w butelkach zawierających minimalną ilość niezbędnej pożywki (MEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) w temperaturze 37 °C w obecności CO2 (5%) i w wilgotnych warunkach. Hoduj komórki w kolbach hodowlanych o średnicy 25cm2, aż osiągną 80% zbieżności, a następnie subkulturę.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek i przemyć butelkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Zaszczepić kulturę 105 TCID/ml szczepu RABV ERA. Inkubować inokulum wirusa przez 2 godziny przy ciągłym wstrząsaniu w temperaturze 37 °C w obecności CO2 (5 %) i w wilgotnych warunkach.</li>
	<li>Usunąć pożywkę infekcyjną i dodać MEM uzupełniony 5% (surowica płodu bydlęcego) SFB. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C w obecności CO2 (5 %) w wilgotnych warunkach.</li>
	<li>Zbierz RABV 3 dni po inokulacji, gdy komórki wykazują działanie cytopatyczne. Zamrozić zakażone komórki, a następnie rozmrozić je w temperaturze 4 °C w celu lizy komórek. Zebrać pożywkę z butelki, a następnie umieścić komórki w probówce wirówkowej do odwirowania w temperaturze 1 050 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przechowywać supernatanty z RABV w temperaturze -80 °C i przygotować robocze podwielokrotności do przechowywania w temperaturze -70 °C.</li>
	<li>Inokulację domózgową wirusa uzyskanego w poprzednim kroku 21-dniowym samicom myszy CD1. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml, aby zaszczepić 50 μl roztworów zawierających 106 dawek MICLD50 (śmiertelna dawka 50%) dla myszy w kulturach zakaźnych myszy 22.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja RNA
UWAGA: Całkowite RNA zostało wyekstrahowane bezpośrednio z mózgów bydlęcych przy użyciu metody ekstrakcji organicznej zgodnie z następującym protokołem.
<ol>
	<li>Użyj 100 mg tkanki mózgowej z każdej struktury anatomicznej, aby wyekstrahować całkowite RNA przy użyciu dostępnego w handlu odczynnika zawierającego izotiocyjanian guanidu.</li>
	<li>Ręcznie homogenizować łącznie 100 mg tkanki z każdej struktury w 1 ml odczynnika izotiocyjanianu guanidu poprzez wirowanie za pomocą homogenizatora Dounce z małym tłuczkiem wewnątrz mikroprobówki przez 15 s z maksymalną prędkością.</li>
	<li>Próbki inkubować na lodzie przez 5 minut, a następnie dodać 200 μl chloroformu. Mieszać próbki energicznie przez 15 s, inkubować na lodzie przez 2 do 3 minut, a następnie odwirowywać przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść fazę wodną do czystej probówki i dodać 500 μl alkoholu izopropylowego. Inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 21 °C.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać wodny roztwór sklarowany nad osadem przez pipetowanie. Wyizolowany RNA będzie obecny w postaci osadu w probówce.</li>
	<li>Następnie przepłukać osad RNA 1 ml 75% etanolu przez pipetowanie i odwirować przy 7500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i wysuszyć osad RNA na powietrzu w temperaturze pokojowej (21 °C). Następnie rozcieńczyć osad w 50 μl wody wolnej od nukleaz</li>.
	<li>Oznaczyć stężenie i jakość RNA przy długości fali 260 nm za pomocą spektrofotometru. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Usuń DNA z próbek RNA przez trawienie za pomocą DNazy I. Dodaj 2 U DNazy I na 1 μg RNA wyekstrahowanego w poprzednim kroku. Następnie dodać 5 μl 10x buforu reakcyjnego, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Dezaktywować DNazę I, dodając 1 μl EDTA do mieszaniny, a następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze 65 °C.</li>
</ol>
5. synteza cDNA i PCR
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA za pomocą oligo dT i odwrotnej transkryptazy. Na każdy 1 μg RNA dodać 1 μl oligo DT (500 μg/ml), 1 μl 10 mM mieszanki dNTP i wodę destylowaną bez nukleaz do końcowej objętości 12 μl. Inkubować mieszaninę w temperaturze 65 °C przez 5 min.</li>
	<li>Schłodzić mieszaninę reakcyjną do temperatury 4 °C. Odwirować probówkę przez 30 s przy 1 050 x g, a następnie dodać 4 μl buforu reakcyjnego, 2 μl 0,1 M DTT i 1 μl inhibitora rybonukleazy (40 U/μL).</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty, a następnie dodać 1 μl odwrotnej transkryptazy (200 j.). Następnie inkubować mieszaninę reakcyjną przez 50 minut w temperaturze 37 °C, a następnie inaktywować reakcję w temperaturze 70 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Przed użyciem należy przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Aby zweryfikować jakość zsyntetyzowanego cDNA, przed przeprowadzeniem syntezy in vitro należy przeprowadzić amplifikację fragmentu genu N o długości 761 pz. Użyj protokołu opisanego przez Loza-Rubio i wsp.11 zgodnie z opisem w kroku 5.5 poniżej.</li>
	<li>Wykonaj PCR przy użyciu polimerazy DNA Taq w następujących warunkach. Przeprowadzić konfigurację reakcji w następujący sposób: 10x bufor Taq zawierający 20 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 1 polimerazę U Taq, 10 μM każdego startera (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ i SuEli-: 5′ caggctcraacattcttctta 3′), 2,5 μL cDNA i ultraczystą wodę do końcowej objętości 50 μL.</li>
	<li>Wykonaj amplifikację w termocykliku, stosując następujące warunki cyklu: 95 ° C przez 3 min; 35 cykli po 95 ° C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 min; jeden cykl 72 °C przez 7 min.</li>
	<li>Oceń obecność produktów PCR 761 pz za pomocą 1% żelu agarozowego.</li>
</ol>
6. Transkrypcja in vitro
UWAGA: Transkrypcja in vitro generuje mRNA docelowego genu. Użyj pary starterów, która amplifikuje cały gen RABV N i takiej, która jest używana jako kontrola pozytywna w teście qRT-PCR. Te startery są zaprojektowane w celu amplifikacji całego genu N RABV i dodania promotora, który rozpoznaje polimerazę T7 (TAATACGACTCACTATAG).
<ol>
	<li>Aby amplifikować cały gen N RABV, należy użyć starterów Trans-Nrab do przodu (5ʹ gatgagtcactcgaatatgtctt 3ʹ) i odwrotnie (5ʹ caataatacgactcactataggatgccgacaagatt 3ʹ) oraz zestawu do PCR o wysokiej wierności.
	<ol>
		<li>Dla każdej reakcji należy przygotować główną mieszaninę PCR, dodając do czystego buforu reakcyjnego probówki PCR 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTP, 10 μM każdego startera, 0,5 U polimerazy o wysokiej wierności, 1,5 μl cDNA (przygotowanego w kroku 5) i ultraczystej wody do końcowej objętości 50 μL.</li>
		<li>Użyj termocyklera ustawionego na następujące warunki dla amplifikacji: 94 °C przez 1 min; 4 cykle po 94 °C przez 1 min, 40 °C przez 1 min i 72 °C przez 2 min; 35 cykli po 94 °C przez 1 min, 60 °C przez 1 min i 72 °C przez 2 min; końcowe przedłużenie 72 °C przez 2 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby użyć produktu PCR jako matrycy do syntezy in vitro i usunąć składniki reakcji enzymatycznej z kroku 6.1.2, należy oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu koncentratora kolumnowego zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie określić ilościowo za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Do syntezy RNA należy użyć zestawu do transkrypcji in vitro z następującą mieszaniną reakcyjną: 5 μl buforu do transkrypcji T7 5x, 1,9 μl każdego nukleotydu trifosforanowego, 10 μg oczyszczonego DNA RABV N DNA VP2 i 2,5 μl mieszaniny enzymów. Następnie inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Następnie dodać 1 μl 1 U/μg DNazy wolnej od RNaz do mieszaniny reakcyjnej i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu wyeliminowania zanieczyszczenia DNA.</li>
	<li>Oczyść transkrybowane RNA in vitro, a następnie zagęść je za pomocą alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego (25:24:1).</li>
	<li>Oczyszczony osad RNA należy zawiesić ponownie w 70 μl buforu TE, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Powtarzać protokół PCR od kroku 6.1 do momentu uzyskania około 5 μg produktu PCR. Po oczyszczeniu i zagęszczeniu, transkrybowane in vitro mRNA genu N będzie obecne w stężeniu 4,711 μg/μL.</li>
	<li>Potwierdź, że transkrybowane mRNA in vitro odpowiada genowi N zgodnie z krokiem 5 niniejszego protokołu i użyj go jako pozytywnej kontroli dla reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR).</li>
</ol>
7. Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)
<ol>
	<li>W przypadku qRT-PCR należy użyć transkryptu mRNA in vitro kodującego cały gen N jako kontrolę pozytywną wraz z komercyjnym jednoetapowym zestawem qRT-PCR przy użyciu sond hybrydyzacyjnych zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj sondy i starterów opisanych przez Carneiro et al. (2010)23, aby wykryć konserwatywny region genu RABV N (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′ i BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).</li>
	<li>Stosować następujące warunki cykli termicznych: 1 cykl w temperaturze 50 °C przez 10 minut i 95 °C przez 2 minuty; 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s i 50 °C przez 30 s.</li>
</ol>
8. Krzywa kalibracyjna lub krzywa standardowa
<ol>
	<li>Wykonać seryjne rozcieńczenia mRNA transkrybowanego in vitro, seryjnie pipetując 1 μg/μL mRNA do probówek, aż do uzyskania sześciu rozcieńczeń dezuplikacji. Przygotować probówki o objętości 100 μl w trzech egzemplarzach do użycia przy tworzeniu krzywej wzorcowej. Wykonaj qRT-PCR zgodnie z opisem w kroku 7.</li>
	<li>Wykonaj qRT-PCR w termocyklerze z wirnikiem, przetwarzając różne próbki mózgu jednocześnie z trwającymi reakcjami w celu stworzenia krzywej wzorcowej i używając kontroli pozytywnych, kontroli ujemnych i supernatantów wyizolowanych z hodowli komórkowej.</li>
	<li>Aby ocenić granicę wykrywalności, skuteczność testu i czułość testu, należy użyć krzywej wzorcowej w trzech egzemplarzach w tych samych warunkach.</li>
</ol>
9. qRT-PCR próbek biologicznych
<ol>
	<li>Do wykrywania genu N RABV należy użyć RNA z próbek terenowych, kontroli pozytywnych, kontroli ujemnych i supernatantów z hodowli komórkowych do przeprowadzenia qRT-PCR przy użyciu zestawu do PCR opisanego w kroku 7.</li>
	<li>Aby określić liczbę kopii genomu RABV obecnych w próbkach mózgu bydła, należy uzyskać dane Ct z krzywej wzorcowej i próbek biologicznych oraz z próbek interpolowanych z równania krzywej kalibracyjnej.</li>
</ol>

<ol><li>Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+diagnosis+of+human+rabies%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorld+Journal%22%5BJournal%5D)">Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances.</a> ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).</li>
<li>CDC. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html">https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html</a> (2019).</li>
<li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDean%2C+DJ+%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).</li>
<li>Prabhu, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+and+comparative+evaluation+of+fluorescent+antibody%2C+immunohistochemistry%2C+and+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+tests+for+the+detection+of+rabies+virus+antigen+or+nucleic+acid+in+brain+samples+of+animals+suspected+of+rabies+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India.</a> Veterinary Science. 5 (1), 24(2018).</li>
<li>Woldehiwet, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+laboratory+advances+in+the+detection+of+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus.</a> Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).</li>
<li>Singh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+-+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+public+health+concerns+and+advances+in+diagnosis+and+control%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Quarterly%22%5BJournal%5D)">Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review.</a> Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).</li>
<li>David, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+RT-PCR+method+in+ante-mortem+%26+post-mortem+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis.</a> Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).</li>
<li>Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+for+the+diagnosis+of+human+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies.</a> Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).</li>
<li>Wacharapluesadee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+detection+of+rabies+RNA+by+NASBA%2C+real-time+PCR+and+conventional+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR.</a> Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).</li>
<li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+ante+mortem+and+post-mortem+diagnosis+of+human+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li>
<li>Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+multiple+strains+of+rabies+virus+RNA+using+primers+designed+to+target+Mexican+vampire+bat+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants.</a> Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).</li>
<li>Dedkov, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+RT-qPCR+assay+for+fast+and+sensitive+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).</li>
<li>Boldbaatar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+rabies+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).</li>
<li>Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+to+determine+the+stability+of+rabies+virus+genome+in+brains+kept+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).</li>
<li>Dacheux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+combined+Real-Time+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+assay+for+the+diagnosis+of+Lyssavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812(2016).</li>
<li>Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentos+de+la+reacci%C3%B3n+en+cadena+de+la+polimerasa+%28PCR%29+y+de+la+PCR+en+tiempo+real%5BTitle%5D)+AND+%22Investigigaci%C3%B3n+en+Discapacidad%22%5BJournal%5D)">Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.</a> Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).</li>
<li>Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p">https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p</a> (2018).</li>
<li>Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ante-and+post-mortem+diagnosis+of+rabies+using+nucleic+acid-amplification+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests.</a> Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).</li>
<li>Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf">https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf</a> (2017).</li>
<li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDean%2C+DJ+%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).</li>
<li>Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecci%C3%B3n+de+un+virus+r%C3%A1bico+de+origen+vampiro+para+utilizarse+como+cepa+de+desaf%C3%ADo+en+bovino%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinaria+M%C3%A9xico%22%5BJournal%5D)">Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino.</a> Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).</li>
<li>Mendez-Ojeda, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rabies+virus+in+organs+unrelated+to+the+central+nervous+system+of+experimentally+inoculated+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+M%C3%A9xicana+de+Ciencias+Pecuarias%22%5BJournal%5D)">Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats.</a> Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).</li>
<li>Carneiro, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+RNA+in+naturally+infected+vampire+bats%2C+Northeastern+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil.</a> Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).</li>
<li>Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html">http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html</a> (2020).</li>
<li>Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+molecular+typing+of+rabies+virus+in+samples+stored+in+inadequate+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infection+in+Developing+Countries%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions.</a> The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).</li>
<li>Finke, S., Cox, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+transcription+attenuation+of+rabies+virus+genes+by+intergenic+regions%3A+generation+of+recombinant+viruses+overexpressing+the+polymerase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene.</a> Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFooks%2C+AR+%22Rabies%22">Rabies</a>. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).</li>
<li>Bingham, J., Van Der, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+rabies+antigen+in+infected+brain+material%3A+determining+the+reliability+of+different+regions+of+the+brain+for+the+rabies+fluorescent+antibody+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test.</a> Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Wcześniejsze badania wykazały, że DFA może wykryć RABV dopiero w ciągu siedmiu dni od przechowywania próbki w temperaturze pokojowej (21 °C)14. W przeciwieństwie do tego, praca ta wykazała, że czułość RT-PCR zaczyna się zmniejszać po wystawieniu próbek na działanie temperatury pokojowej przez 12 dni. Dlatego genom RABV można wykryć za pomocą qRT-PCR w próbkach wystawionych na działanie temperatury pokojowej przez okres do 23 dni. Pokazuje to, że czułość qRT-PCR jest stosunkowo wyższa w przypadku b...

Wścieklizna może być potwierdzona przedśmiertnie i pośmiertnie za pomocą różnych technik, które umożliwiają wykrycie wirusowych kwasów nukleinowych w mózgu, skórze, moczu lub ślinie1. Wykrywanie genu nukleoproteiny (N) wirusa wścieklizny jest wykorzystywane przede wszystkim do diagnozowania wścieklizny za pomocą testów molekularnych. Gen ten jest również wykorzystywany do genotypowania wirusów. Wściekliznę można zdiagnozować u zwierząt przy użyciu dowolnej części chorego mózgu; Jednak, aby wykluczyć możliwość wystąpienia wścieklizny, należy przebadać tkankę z co najmniej dwóch regionów mózgu2. Istnieje kilka metod diagnostycznych wykrywania wścieklizny u zwierząt; Jednak bezpośredni test immunofluorescencyjny pozostaje standardową techniką referencyjną<klasa SUP="xref">3. Inne testy obejmują testy biologiczne, które obejmują inokulację myszy, infekcję w kulturze tkankowej i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR)4. Wszystkie te techniki są zalecane przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) i Światową Organizację Zdrowia Zwierząt (OIE) do diagnozowania wścieklizny odpowiednio u ludzi i zwierząt5.
Techniki wykrywania i amplifikacji kwasów nukleinowych zrewolucjonizowały diagnostykę wścieklizny w ostatnich latach6 i te techniki odgrywają ważną rolę w diagnozowaniu przedśmiertnym ludzkiej wścieklizny. Kilka testów opartych na PCR zostało ocenionych jako uzupełnienie konwencjonalnych testów do diagnostyki wścieklizny przedśmiertnej i pośmiertnej 7,8,9,10. Większość testów jest ukierunkowana na gen nukleoproteiny wirusa wścieklizny do amplifikacji, który jest najbardziej konserwatywnym regionem w genomie wirusa1,11. W ciągu ostatnich 20 lat opracowano różne testy molekularne do diagnozowania RABV, a niektóre z tych testów zostały wykorzystane do charakterystyki wirusa. Większość badań miała na celu wykrycie konserwatywnych genów w genomie wirusa, najczęściej przy użyciu konwencjonalnych lub ilościowych testów reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)12,13.
PCR to bardzo czuła technika diagnostyczna, która może wykryć genom danego patogenu w tkankach, nawet gdy te tkanki są rozłożone. Stosując metody oparte na PCR, minimalne ilości czynnika zakaźnego można wykryć w próbce klinicznej poprzez selektywną i powtarzalną amplifikację sekwencji nukleotydów DNA14. qRT-PCR, który zawiera sondy fluorescencyjne (np. TaqMan) lub barwniki wiążące DNA (np. SYBR Green), był stosowany w badaniach klinicznych do diagnozowania RABV zarówno przed, jak i pośmiertnie z wysoką czułością; Takie podejście wymaga jednak specjalistycznego sprzętu. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, zaproponowano amplifikację izotermiczną za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP), w oparciu o jej niski koszt, prostotę i pożądane cechy wykrywania RABV. Ten test jest szczególnie ważny, ponieważ może być stosowany w krajach rozwijających się15.
qRT-PCR opiera się na wykrywaniu i kwantyfikacji cząsteczki, gdzie wzrost sygnału fluorescencyjnego jest wprost proporcjonalny do ilości produktu PCR w pojedynczej reakcji. Wraz ze wzrostem liczby kopii docelowego kwasu nukleinowego rośnie również fluorescencja. Niespecyficzne barwniki interkalacyjne, takie jak zielony barwnik wiążący DNA SYBR lub specyficzne dla sekwencji sondy oligonukleotydowe przenoszące fluorofor i wygaszacz, są powszechnie stosowane w celu zapewnienia odczytu fluorescencyjnego w qRT-PCR. Ten test ma zalety w porównaniu z konwencjonalnym RT-PCR, takie jak krótszy czas testu (2-4 godziny), zmniejszone ryzyko zanieczyszczenia dzięki systemowi zamkniętej probówki (brak manipulacji amplifikowanymi produktami po PCR) oraz możliwość jednoczesnego wykrywania różnych celów16. qRT-PCR może być stosowany do diagnozowania wścieklizny przedśmiertnie ze śliny i innych próbek. Test ten może być również używany jako uniwersalny test w czasie rzeczywistym do wykrywania różnych gatunków lub linii wirusa Lyssa RABV15. W tym łączonym podejściu RT-PCR stosuje się dwie reakcje. Pierwszy wykrywa różne linie genetyczne RABV, a drugi wykrywa gatunki Lyssavirus. Oba etapy obejmują testy qRT-PCR, z których pierwszy wykorzystuje sondy hybrydyzacyjne, a drugi wykorzystuje barwniki15. Ze względu na dużą liczbę testów, które wykazały skuteczne wykrywanie molekularne RABV przy użyciu tej techniki, aktualny podręcznik naziemny OIE (2018) zaleca stosowanie PCR do molekularnego wykrywania RABV17.
Meksyk to kraj o znacznym potencjale hodowlanym. Stany o najwyższej produkcji zwierzęcej obejmują zarówno wilgotne regiony tropikalne, jak i suche regiony, które są zagrożone wybuchami wścieklizny ze względu na obecność nietoperza wampira Desmodus rotundus, głównego przekaźnika wścieklizny. W związku z tym konieczne jest opracowanie większej liczby narzędzi do zapobiegania i kontroli paralitycznej wścieklizny bydła (BPR) w Meksyku. Na tej podstawie celem pracy było zastosowanie ilościowego qRT-PCR do określenia liczby cząstek wirusa w różnych strukturach anatomicznych mózgów bydła po śmierci z powodu zakażenia wścieklizną.
Sześć mózgów uzyskanych od bydła z dodatnim wynikiem RABV zostało przekazanych przez zewnętrzne laboratorium do wykorzystania w rozwoju protokołu qRT-PCR opisanego poniżej. Próbki struktury mózgu bydlęcego przetransportowano łańcuchem chłodniczym do laboratorium INIFAP CENID-MA BBL-2 i przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Mózgi pozyskano od zwierząt ze stanów Campeche, Jukatan i Querétaro. Przed otrzymaniem wycięto różne struktury z mózgu. Struktury te obejmowały róg Ammona, móżdżek, korę, rdzeń, most i wzgórze18,19. Materiał genetyczny pobrano w sposób opisany poniżej. Rozpoznanie RABV potwierdzono przy użyciu przeciwciał bezpośrednio fluorescencyjnych (DFA)20. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano mózgi myszy, które zostały zaszczepione RABV21. Dodatkowo, cztery RABV-ujemne mózgi bydła (określone przez DFA) zostały użyte jako kontrole negatywne.

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>SIGMA</td><td>C7559</td><td>Ułatwia odzyskiwanie fazy wodnej PCR, które zostały pokryte olejem mineralnym.</td></tr><tr><td>DNA Czyste i Koncentrator-500</td><td>Zimo</td><td>D4031</td><td>DNA Czyste & Concentrator-500 (DCC-500) jest przeznaczony do szybkiego, wielkoformatowego oczyszczania i zagęszczania do 500 &mikro; g wysokiej jakości DNA z próbek, w tym z trawienia endonukleazy restrykcyjnej na dużą skalę i zanieczyszczonych preparatów DNA.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Amresco</td><td>193-500</td><td>Oczyszczanie kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>Zestaw FastStart High Fidelity PCR System, dNTPack</td><td>Roche</td><td>3553400001</td><td>Enzym o wysokiej wierności do amplifikacji produktów PCR unikający losowych zmian zasad</td></tr><tr><td>GelDoc XR</td><td>BioRad</td><td>XR+</td><td>Analizuje większe żele białkowe i DNA</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Nowa generacja barwników żelowych z kwasami nukleinowymi posiada nowatorskie cechy chemiczne zaprojektowane w celu zminimalizowania szansy na interakcję barwników z kwasami nukleinowymi w żywych komórkach.</td></tr><tr><td>iCycler Thermal Cycler Gradient</td><td>BioRad</td><td>582BR</td><td>Temperatura może być monitorowana i kontrolowana za pomocą algorytmu przyrządu, sondy w próbce lub trybu bloku próbki Sondy</td></tr><tr><td>uniwersalne iTaq Zestaw jednoetapowy</td><td>BioRad</td><td>1725141</td><td>Mieszanina reakcyjna do przeprowadzania reakcji PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu sond hybrydyzacyjnych typu TaqMan</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Amresco</td><td>0918-500</td><td>Wytrącanie kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>Zestawy QIAquick zawierają zespół membrany krzemionkowej do wiązania DNA w buforze o wysokiej zawartości soli i elucji z buforem o niskiej zawartości soli lub wodą. Procedura oczyszczania usuwa startery, nukleotydy, enzymy, olej mineralny, sole, agarozę, bromek etydyny i inne zanieczyszczenia z próbek DNA</td></tr><tr><td>M-MLV Odwrotna transkryptaza</td><td>Invitrogen</td><td>28025-021</td><td>Odwrotna transkryptaza wirusa białaczki mysiej Moloneya (M-MLV RT) wykorzystuje jednoniciowy RNA lub DNA w obecności startera do syntezy komplementarnej nici DNA.</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo-Scientific</td><td>ND2000</td><td>Spektrofotometr mikroobjętościowy</td></tr><tr><td>Podkład Oligo(dT)18</td><td>Invitrogen</td><td>SO132</td><td>Starter oligo (dT)18 jest syntetycznym jednoniciowym 18-merowym oligonukleotydem z końcami 5'- i 3'-hydroksylowymi.</td></tr><tr><td>Zestaw RiboMAX Large Scale RNA Production Systems SP6 i T7</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>Reakcje transkrypcji in vitro służą do syntezy mikrogramowych ilości sond RNA z rekombinowanych matryc DNA. Większość reakcji transkrypcyjnych zaprojektowanych do generowania sond RNA jest zoptymalizowana pod kątem maksymalizacji włączenia rybonukleotydów znakowanych radioaktywnie, a nie do wytwarzania dużych ilości RNA</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraza</td><td>Invitrogen</td><td>#EP0402</td><td>Polimeraza DNA Taq jest wysoce termostabilną polimerazą DNA termofilnej bakterii Thermus aquaticus. Enzym katalizuje 5' oraz 3' synteza DNA &nbsp;</td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Odczynnik TRIzol jest kompletnym, gotowym do użycia odczynnikiem, przeznaczonym do izolacji wysokiej jakości całkowitego RNA lub jednoczesnej izolacji RNA, DNA i białek z różnych próbek biologicznych.</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja wirusa wścieklizny w różnych strukturach mózgu bydła

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

Porąbna wścieklizna bydła (BPR) jest formą wirusowego zapalenia mózgu, która ma duże znaczenie gospodarcze w całej Ameryce Łacińskiej, gdzie stanowi duże ryzyko chorób odzwierzęcych. W tym przypadku naszym celem było wykorzystanie protokołu laboratoryjnego do określenia względnej liczby kopii genomu wirusa wścieklizny (RABV) w różnych strukturach anatomicznych mózgu bydła przy użyciu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). qRT-PCR określa ilościowo określoną liczbę kopii genów obecnych w próbce na podstawie fluorescencji emitowanej po amplifikacji, która jest wprost proporcjonalna do ilości docelowego kwasu nukleinowego obecnego w próbce. Metoda ta jest korzystna ze względu na krótki czas trwania, zmniejszone ryzyko zanieczyszczenia i możliwość łatwiejszego wykrywania wirusowych kwasów nukleinowych w różnych próbkach w porównaniu z innymi technikami. Mózgi sześciu wściekłych zwierząt były podzielone na sześć struktur anatomicznych, a mianowicie róg Ammona, móżdżek, korę, rdzeń, most i wzgórze. Wszystkie mózgi zostały zidentyfikowane jako pozytywne dla antygenów RABV na podstawie bezpośredniego testu immunofluorescencyjnego. Oceniono również te same struktury anatomiczne z mózgów czterech bydła z ujemnym wynikiem RABV. RNA wyekstrahowano z każdej struktury i użyto do qRT-PCR. Przeprowadzono test w celu określenia liczby kopii genów RABV przy użyciu transkrybowanego genu nukleoproteinowego in vitro. Krzywa standardowa użyta do ilościowego oznaczania wirusowego RNA wykazała skuteczność 100% i liniowość 0,99. Analiza wykazała, że kora, rdzeń i wzgórze były idealnymi częściami OUN do wykorzystania w wykrywaniu RAPV, w oparciu o obserwację, że struktury te posiadały najwyższe poziomy RABV. Swoistość testu wynosiła 100%. Wszystkie próbki były pozytywne, nie wykryto żadnych wyników fałszywie dodatnich. Metoda ta może być stosowana do wykrywania RABV w próbkach, które zawierają niski poziom RABV podczas diagnozy BPR.

Wyniki DFA wykazały odpowiednio 100%, 100%, 83,3%, 66% i 50% pozytywnych wyników dla RABV w korze mózgu, wzgórzu, rdzeniu przedłużonym, moście i rogach. Wyniki te potwierdziły wcześniejsze ustalenia, a co najmniej trzy z przeanalizowanych struktur z każdego mózgu były pozytywne pod kątem RABV. Reprezentatywne pozytywne barwienie DAF przedstawiono na Rysunku 1.
Rysunek 2 przedstawia amplifikację fragmentu genu N RABV (krok 5.5) z wykor...

Ten protokół przedstawia oparte na qRT-PCR podejście do określania liczby kopii genu nukleoproteiny (N) wirusa wścieklizny w różnych strukturach anatomicznych mózgu bydlęcego za pomocą transkrypcji in vitro.

Kwantyfikacja wirusa wścieklizny w różnych strukturach mózgu bydła

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

Oznaczanie ilościowe wirusa wścieklizny w różnych strukturach mózgu bydła. Meksyk to kraj o znacznym potencjale hodowlanym. Stany o najwyższej produkcji zwierzęcej obejmują zarówno wilgotne regiony tropikalne, jak i suche regiony, które są zagrożone wybuchami wścieklizny ze względu na obecność nietoperza wampira, Desmodus rotundus, głównego nosiciela wścieklizny.Wykrywanie genu nukleoproteiny N wirusa wścieklizny jest wykorzystywane przede wszystkim do diagnozowania wścieklizny za pomocą testów molekularnych. Stosując podejścia oparte na PCR, można wykryć minimalne ilości czynnika zakaźnego w próbce klinicznej poprzez selektywną i powtarzalną amplifikację sekwencji nukleotydów DNA. qRT-PCR opiera się na wykrywaniu i kwantyfikacji cząsteczki, w której wzrost sygnału fluorescencji jest wprost proporcjonalny do ilości produktu PCR w pojedynczej reakcji.Wraz ze wzrostem liczby kopii docelowego kwasu nukleinowego rośnie również fluorescencja. Na tej podstawie celem pracy było zastosowanie ilościowego qRT-PCR do określenia liczby cząstek wirusa w różnych strukturach anatomicznych mózgów bydła, po zgonie z powodu zakażenia wścieklizną. Całkowite RNA wyekstrahowano bezpośrednio z mózgów bydła przy użyciu metody ekstrakcji organicznej zgodnie z następującym protokołem.Użyj 100 miligramów tkanki mózgowej z każdej struktury anatomicznej, aby wyekstrahować całkowite RNA przy użyciu dostępnego w handlu odczynnika zawierającego izotiocyjanian guanidyny. Ręcznie homogenizować łącznie 100 miligramów tkanki z każdej struktury w jednym mililitrze odczynnika izotiocyjanianu guanidyny, wirując za pomocą homogenizatora Dounce z małym tłuczkiem wewnątrz mikroprobówki przez 15 sekund z maksymalną prędkością. Inkubować próbki na lodzie przez pięć minut, a następnie dodać 200 mikrolitrów chloroformu.Mieszać próbki energicznie przez 15 sekund. Inkubować na lodzie przez dwie do trzech minut, a następnie odwirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś fazę wodną do czystej probówki i dodaj 500 mikrolitrów alkoholu izopropylowego.Inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 21 stopni Celsjusza. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać wodny roztwór nadsadzony przez pipetowanie.Wyizolowany RNA będzie obecny w postaci osadu w probówce. Następnie przemyć osad RNA jednym mililitrem 75% etanolu za pomocą pipetowania i odwirować przy 7,500 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować supernatant i wysuszyć na powietrzu osad RNA w temperaturze pokojowej 21 stopni Celsjusza.Następnie rozcieńczyć osad w 50 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Określić stężenie i jakość RNA przy 260 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Transkrypcja in vitro generuje mRNA docelowego genu.Użyj pary starterów, która amplifikuje cały gen RABV N, i takiej, która jest używana jako kontrola pozytywna w teście qRT-PCR. Te startery są zaprojektowane w celu amplifikacji całego genu RABV N i dodania promotora, który rozpoznaje polimerazę T7. Aby amplifikować cały gen N RABV, użyj starterów trans i RAB do przodu i do tyłu oraz zestawu do PCR o wysokiej wierności.Dla każdej reakcji należy przygotować wzorcową mieszaninę PCR, dodając do czystego buforu reakcyjnego w probówce PCR z 10 mikromolami każdego startera i 0,5 jednostki polimerazy o wysokiej wierności. Aby użyć produktu PCR jako matrycy do syntezy in vitro i usunąć składniki reakcji enzymatycznej, należy oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu koncentratora opartego na kolumnie, zgodnie z instrukcjami producenta. A następnie określić ilościowo za pomocą spektrofotometru.Do syntezy RNA należy użyć zestawu do transkrypcji in vitro z następującą mieszaniną reakcyjną: pięć mikrolitrów buforu transkrypcyjnego T7 5X, 1,9 mikrolitra każdego nukleotydu trifosforanowego, 10 mikrogramów oczyszczonego RABV N DNA i 2,5 mikrolitrów mieszaniny enzymów. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Następnie dodać jeden mikrolitr jednej jednostki na mikrogram DNazy wolnej od rnazy do mieszaniny reakcyjnej i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wyeliminować zanieczyszczenie DNA.Oczyść transkrybowane RNA in vitro, a następnie zagęścić je za pomocą alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego w stosunku 25:24:1. Ponownie zawiesić oczyszczoną osadkę RNA w 70 mikrolitrach buforu TE, a następnie przechowywać ją w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu użycia. Powtarzać protokół PCR do momentu uzyskania około pięciu mikrogramów produktu PCR.Po oczyszczeniu i zagęszczeniu, transkrybowany in vitro gen N mRNA będzie obecny w stężeniu 4,711 mikrogramów na mikrolitr. Potwierdź, że transkrybowane mRNA in vitro odpowiada genowi N zgodnie z krokiem piątym tego protokołu i użyj go jako pozytywnej kontroli dla łańcuchowej reakcji polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym, qRT-PCR. W przypadku reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym należy użyć transkryptu mRNA in vitro do kodowania całego genu N jako kontroli pozytywnej.Wraz z komercyjnym jednoetapowym zestawem qRT-PCR, wykorzystującym sondy hybrydyzacyjne zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj sondy we starterach opisanych przez Coronado i współpracowników 2010, aby wykryć konserwatywny region RABV przy użyciu następujących warunków cyklu termicznego. Wykonać seryjne rozcieńczenia transkrybowanego mRNA in vitro, seryjnie pipetując jeden mikrogram na mikrolitr mRNA do probówek, aż do uzyskania sześciu rozcieńczeń oddzielonych.Przygotuj probówki o objętości 100 mikrolitrów w trzech egzemplarzach do użycia przy tworzeniu krzywej wzorcowej. Wykonaj qRT-PCR zgodnie z wcześniejszym opisem. Wykonaj qRT-PCR w termocyklerze z wirnikiem, przetwarzając różne próbki mózgu jednocześnie z trwającymi reakcjami w celu stworzenia krzywej standardowej i używając kontroli pozytywnych, kontroli ujemnych i supernatantów wyizolowanych z hodowli komórkowej.Aby ocenić granicę wykrywalności, skuteczność testu i czułość testu, należy użyć krzywej wzorcowej w trzech egzemplarzach w tych samych warunkach. Do wykrywania genu N RABV należy użyć RNA z próbek terenowych, kontroli pozytywnych, kontroli ujemnych i supernatantów z hodowli komórkowych do przeprowadzenia qRT-PCR przy użyciu opisanego wcześniej zestawu do PCR. Aby określić liczbę kopii genomu RABV obecnych w próbkach mózgu bydlęcego, należy uzyskać dane CT z krzywej standardowej i próbek biologicznych oraz z próbek interpolowanych z równania krzywej kalibracyjnej Rysunek ten przedstawia tkanki mózgowe bydła wykazujące dodatnie barwienie zgodnie z bezpośrednią immunofluorescencją.Wyniki wskazują na 100%100%83,3%66%i 50% dodatnich wyników dla RABV odpowiednio w korze mózgowej, wzgórzu, rdzeniu, moście i rogu. Wyniki te potwierdzają poprzednie wyniki, a co najmniej trzy struktury wypreparowane z każdego mózgu były pozytywne dla RABV. Z drugiej strony równanie krzywej standardowej pokazuje zależność między ilością zawartości genetycznej RABV w próbce a wielkością amplifikowanego fragmentu PCR.Ilość zawartości genetycznej RABV w nanogramach wydedukowano przez interpolację wartości CT w krzywej kalibracyjnej przy użyciu równania przedstawionego na tym rysunku. Korzystając z tego równania, stwierdzono, że granica wykrywalności wynosząca od 10 do 5 mikrogramów na mikrolitr wirusowego RNA odpowiada 36 kopiom genomu RAPV. Wyniki te pokazują, że test jest czuły i może być używany do wykrywania wirusa w próbkach zawierających niewielką liczbę kopii genu RABV N.Skuteczność testu obliczono przy użyciu nachylenia krzywej wzorcowej, które wynosiło 3,28. Próbki użyte do qRT-PCR wykazały amplifikację genu RABV N. Aby określić liczbę obecnych kopii wirusa, wartości CT dla każdej próbki interpolowano przy użyciu równania krzywej kalibracyjnej.Wyniki uzyskane w nanogramach podstawiono do opisanego tu wzoru. Poniższa tabela przedstawia wyniki porównawcze między qRT-PCR i DFA. Wyniki testów qRT-PCR były zgodne z wynikami uzyskanymi przy użyciu DFA.Zgodnie z wynikami uzyskanymi w teście qRT-PCR w przypadkach C i D, wzgórze jest strukturą, która posiada największą liczbę kopii genu RABV N. Sugeruje to, że wczesne zakażenie neuronów podwzgórza i wzgórza jest ważne w rozwoju choroby, biorąc pod uwagę, że neurony te kontrolują funkcje wegetatywne zwierzęcia. Liczba kopii genu RABV N, które wykryto w każdej strukturze każdej próbki, to: czułość i swoistość testu qRT-PCR, oboje jesteśmy w 100%, ponieważ wszystkie próbki były pozytywne.Wynik ten jest zgodny ze wstępnymi diagnozami próbek. qRT-PCR jest bardzo czułą techniką. Niektóre z kroków mają kluczowe znaczenie dla uzyskania najlepszych wyników.Jednym z nich jest właściwe obchodzenie się z próbkami do ekstrakcji RNA. Ten krok jest kluczowy, ponieważ RNA łatwo ulega degradacji, co może mieć wpływ na wyniki. Rozważ utrzymanie próbki w niskich temperaturach, około czterech stopni Celsjusza podczas procesu.Ponadto należy wziąć pod uwagę, że przeprowadza się kilka rund aplikacji PCR, jak wspomniano w transkrypcji in vitro. Test qRT-PCR przeprowadzony w tym badaniu może wykryć zaledwie 36,3 kopii genu N RABV na miligram tkanki. Najbardziej odpowiednimi strukturami mózgu do qRT-PCR były kora mózgowa i wzgórze.Opiera się to na obserwacjach, że w tych strukturach wykryto wyższe stężenia genu N RAPV, a także stwierdzono, że są one dodatnie za pomocą testu referencyjnego RAPV. Test był w stanie wykryć bardzo niskie stężenia, 0,00023 razy 10 do dziewiątych kopii wirusa w różnych próbkach. Oprócz ilościowego określenia cząstek wirusa w próbce, test wydaje się stanowić dobre alternatywne narzędzie diagnostyczne i badawcze do wykrywania RABV przedstawione tutaj.

quantitation-of-rabies-virus-in-various-bovine-brain-structures

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wirus infekuje neurony piramidowe w korze mózgowej, a ekspresja białek wirusowych lokalizuje się w wewnątrzcytoplazmatycznych strukturach ziarnistych znanych jako ciała inkluzyjne.

Wykrywanie białek wirusowych w tkance mózgowej myszy zakażonej wirusem wścieklizny

Ten film demonstruje barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny w zakażonej tkance mózgowej myszy. Proces ten obejmuje deparatynizację i leczenie alkoholem, a następnie leczenie proteolityczne w celu zwiększenia dostępności antygenu. Barwienie immunohistochemiczne ujawnia czerwone osady, potwierdzające obecność antygenów wścieklizny w skrawku tkankowym.

Barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenów wirusa wścieklizny

Źródło: Zaeck, L., et al. Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem. J. Vis. exp. (2019).  Ten film pokazuje proces przygotowania i obrazowania tkanki mózgowej myszy zakażonej wirusem wścieklizny (RABV) w celu oceny postępu infekcji. Przedstawiono w nim kluczowe etapy, w tym barwienie tkanek za pomocą markerów fluorescencyjnych, odwodnienie, oczyszczanie i montaż do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej,...

Trójwymiarowa wizualizacja zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej myszy

Nowatorskie, kompatybilne z barwieniem immunologicznym techniki oczyszczania tkanek, takie jak ostateczne obrazowanie 3D organów oczyszczonych rozpuszczalnikiem, pozwalają na wizualizację 3D infekcji mózgu wirusem wścieklizny i jego złożonego środowiska komórkowego. Grube, znakowane przeciwciałami wycinki tkanki mózgowej są optycznie przezroczyste, aby zwiększyć głębokość obrazowania i umożliwić analizę 3D za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem

Bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT) stanowi uznaną przez Światową Organizację Zdrowia Zwierząt i Światową Organizację Zdrowia (OIE/WHO) alternatywę dla testu na przeciwciała fluorescencyjne (DFA) do diagnozowania wścieklizny. Test ten pozwala na zastosowania w terenie, które można wykonać w ciągu około 1 godziny po pobraniu wycisków mózgu za pomocą mikroskopii świetlnej.

Wzmocniony nadzór nad wścieklizną za pomocą bezpośredniego szybkiego testu immunohistochemicznego

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie bezpiecznych technik sekcji zwłok na małych i dużych zwierzętach, aby uzyskać zadowalające próbki tkanek do badania wścieklizny.

Techniki sekcji zwłok wścieklizny u dużych i małych zwierząt

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Tutaj prezentujemy protokół testu immunohistochemicznego do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny jako alternatywny test diagnostyczny dla tkanek utrwalonych w formalinie.

Test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa z tkanek utrwalonych formaliną

Tutaj prezentujemy szybki i ekonomiczny proces charakteryzowania genomów wirusa wścieklizny (RABV) za pomocą technologii nanoporowej. Przepływ pracy ma na celu wsparcie nadzoru opartego na genomice na poziomie lokalnym, dostarczając informacji na temat krążących linii RABV i ich umiejscowienia w regionalnych filogenezach w celu ukierunkowania środków kontroli wścieklizny.

Sekwencjonowanie całego genomu w celu szybkiej charakterystyki wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej

Protokół ten demonstruje test reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR) pan-lizawirusa LN34 w czasie rzeczywistym od pobierania tkanek do interpretacji wyników, w tym aktualizacje sekwencji primerów i formuł poprawiających wydajność testu dla niektórych lizawirusów i zalegowców niezwiązanych z wścieklizną. Demonstrujemy także konfigurację testu dla multipleksowanego formatu LN34 z pojedynczym dołkiem (LN34M).

Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Poznaj metodę qRT-PCR do kwantyfikacji wirusa wścieklizny w strukturach mózgu bydła. Technika ta umożliwia wykrywanie niskich stężeń RNA wirusowego z wysoką czułością.

Kwantyfikacja wirusa wścieklizny w różnych strukturach mózgu bydła

Przeglądaj więcej filmów