Name: Mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj model narażenia płodu na stan zapalny matki u myszy, który pozwala badać mechanizmy uszkodzenia jelit noworodka po chorioamnionitis. Ta metoda symuluje sterylną reakcję zapalną bez bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez National Institutes of Health (DK097335 & T32AI007260) oraz University of Iowa Stead Family Department of Pediatrics.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Iowa (Protokół #8041401). Wszystkie zwierzęta były trzymane w wiwarium zatwierdzonym przez Stowarzyszenie Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AALAC) na Uniwersytecie Iowa. Wszystkie myszy były dzikim szczepem C57Bl/6J.
1. Ustanowienie FEMI u ciężarnych myszy
<ol>
	<li>Przygotowanie LPS
	<ol>
		<li>Stosować LPS pochodzący z Escherichia coli O55:B5 (stężenie podstawowe 2 mg/ml).</li>
		<li>Rozcieńczyć stężenie podstawowe LPS 1:100 sterylnym roztworem soli fizjologicznej do stężenia roboczego 20 μg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknięcie matczynego LPS
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć ciężarne matki w dniu ciąży e15. Ten punkt czasowy wynosi około 75% przez ciążę mysią, co czyni ten model rozwojowo podobnym do wczesnego trzeciego trymestru ciąży u ludzi, kiedy to występuje większość przedwczesnych porodów z powodu zapalenia błony płodowej.</li>
		<li>Zważyć ciężarne myszy bezpośrednio przed wstrzyknięciem, aby określić odpowiednie dawkowanie LPS.</li>
		<li>Obliczyć dawkę stężenia roboczego, korzystając z następującego wzoru: 5 μl x gram masy ciała (gbw), dla całkowitej dawki LPS wynoszącej 100 μg/kg. W przypadku zwierząt kontrolnych należy użyć równoważnej objętości soli fizjologicznej do wstrzykiwań.</li>
		<li>Wirować roztwór LPS trzy razy przez 15 sekund na haju przed każdym wstrzyknięciem.</li>
		<li>Pobrać objętość LPS do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Powstrzymaj ciężarną mysz za pomocą techniki scruffingu. Utrzymać w pozycji leżącej grzbietowej i wykonać wstrzyknięcie.
		<ol>
			<li>Włóż igłę o rozmiarze 30 x 8 mm do góry nad prawym dolnym kwadrantem brzucha (aby uniknąć pęcherza i naczyń brzusznych) pod kątem 30\u201240°. Włożyć około 1/4 do 1/2 długości igły.</li>
			<li>Przed wstrzyknięciem należy odciągnąć tłok strzykawki, aby zapewnić podciśnienie. Kontynuować wstrzykiwanie, jeśli występuje podciśnienie.</li>
			<li>Po wstrzyknięciu należy monitorować myszy przez około 30 minut, a następnie wrócić do klatek na pozostałą część ciąży.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Dostarczanie i opieka nad potomstwem oraz pobieranie jelit
<ol>
	<li>Młode należy urodzić normalnie drogą pochwową w temperaturze e20, 
	UWAGA: Ten model ma oczekiwany wskaźnik utraty płodu zależny od dawki, który można zobaczyć w Rysunek 1 i jest omówiony w poniższych wynikach.</li>
	<li>Pozwól szczeniętom pozostać z matkami i otrzymywać karmienie ad libitum.</li>
	<li>W dniu zbiorów, zazwyczaj w 14. dniu po urodzeniu (P14), należy poddać szczenięta eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek i kleszczy wykonaj pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha, przez skórę i otrzewną, na całej długości brzucha. Wytnij jelito cienkie od żołądka do jelita ślepego nożyczkami i usuń krezkę kleszczami. </li>
	<li>Wyizoluj i zachowaj dystalną 1/3 jelita cienkiego (sekcja reprezentatywna dla ludzkiego jelita krętego), odrzucając proksymalne jelito cienkie, jelito ślepe i okrężnicę.</li>
	<li>Podziel część jelita krętego na pół za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Umieść proksymalną połowę w roztworze stabilizującym RNA w celu późniejszej kwantyfikacji RNA.</li>
	<li>Umieść dystalną połowę w 10% neutralnej buforowanej formalinie w celu przygotowania szkiełka.</li>
</ol>
3. Punktacja urazów jelitowych
<ol>
	<li>Tkankę zatopioną w parafinie podzielić na plastry o grubości 5 μm i zamontować na szkiełkach podstawowych. 
	 
	UWAGA: Wysyłamy próbki do rdzenia histologicznego w celu zatopienia, przekrojenia i zamontowania parafiny na szkiełkach.</li>
	<li>Odparafinować szkiełka zgodnie ze standardowymi procedurami.</li>
	<li>Wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną zgodnie ze standardowymi procedurami.</li>
	<li>Oceniaj sekcje w 3-punktowej skali dla urazów jelit, jak opisano wcześniej42,43.
	<ol>
		<li>Korzystając z mikroskopii świetlnej, oceń uogólnione uszkodzenie jelit przez dwóch oddzielnych zaślepionych badaczy na 3-punktowej skali oceniającej integralność kosmków i oddzielenie od błony podstawnej43 (Rysunek uzupełniający 1). Uraz jelit najlepiej oceniać przy 20-krotnym powiększeniu i aperturze numerycznej 0,50.</li>
		<li>Przypisz wynik 0, aby opisać normalną błonę śluzową.</li>
		<li>Przypisz wynik 1 opisujący łagodne urazy, które obejmują rozwój podnabłonkowej przestrzeni Gruenhagena, wakuolizację lub podnabłonkowe uniesienie ograniczone do blaszki właściwej lub końcówek kosmków.</li>
		<li>Przypisz wynik 2, aby opisać ciężkie uszkodzenie, na które wskazuje uniesienie nabłonka i wakuolizację większą niż połowa kosmków, zniekształcenie kosmków lub owrzodzenie błony śluzowej i rozpad blaszki właściwej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja komórek Paneth i kubków
<ol>
	<li>Po deparafinowaniu zabarwić szkiełka skrawków tkanek z kroku 2.8 barwieniem Schiffa Alcian Blue/Periodic Acid, aby oznaczyć zarówno komórki kielichowe, jak i Panetha, jak opisano wcześniej44,45 zgodnie z następującymi krokami. 
	UWAGA: Chociaż barwienie Schiffa Alcian Blue/Periodic Acid nie jest specyficzne ani dla komórek Paneth, ani dla komórek kubkowych, z naszego doświadczenia wynika, że zaślepieni doświadczeni badacze mają równoważną kwantyfikację komórkową przy użyciu tego barwnika w porównaniu z przeciwciałami ukierunkowanymi na komórki, ze znacznie mniejszym barwieniem tła46.</li>
	<li>Odparafinować, plamić i odwadniać szkiełka w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Zanurz szkiełka w ksylenie na 10 minut dwa razy. 
		UWAGA: Ksylen powinien być używany w dygestorium.</li>
		<li>Spłukać 100% EtOH.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w 100% EtOH na 3 min, następnie w 90% EtOH na 3 min, następnie 70% EtOH na 3 min, a na koniec zanurz szkiełka w 50% EtOH na 3 min.</li>
		<li>Myć pod bieżącą wodą pod bieżącą wodą przez 5 min. 
		UWAGA: Skieruj sekcję z dala od bieżącej wody, aby zapobiec utracie próbki tkanki.</li>
		<li>Przefiltruj roztwór niebieskiej plamy Alcian za pomocą standardowego filtra do kawy.</li>
		<li>Bejca ślizga się w bejcy Alcian blue przez 15 minut, a następnie myje pod bieżącą wodą z kranu przez 2 minuty.</li>
		<li>Rozcieńczyć 1 mg kwasu okresowego w 200 ml podwójnie destylowanej wody. Zanurz slajdy w tym roztworze na 5 minut. Następnie myj pod bieżącą wodą pod bieżącą wodą przez 1 min.</li>
		<li>Barwieć odczynnikiem Schiffa przez 10 min. Myć pod bieżącą wodą pod bieżącą wodą przez 5 min.</li>
		<li>Szkiełka należy barwić hematoksyliną przez 1 min, a następnie myć pod bieżącą wodą z kranu przez 2 min.</li>
		<li>Zanurz je w kwaśnym alkoholu (1 ml kwasu solnego zmieszanego z 99 ml 70% EtOH) na 1 minutę.</li>
		<li>Zanurz się w wodzie z kranu Scotta (stężenie 0,1% NaHCO3 w wodzie z kranu) na 1 minutę, a następnie umyj pod bieżącą wodą z kranu przez 1 minutę.</li>
		<li>Odwodnić szkiełka.
		<ol>
			<li>Zanurz każde szkiełko 10 razy w 70% EtOH, następnie zanurz 10 razy w 90% EtOH i 10 razy w 100% EtOH.</li>
			<li>Zanurz szkiełka w 100% EtOH na 10 minut, a następnie zanurz dwukrotnie w świeżym ksylenie na 3 minuty każde.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść kroplę podłoża montażowego na próbce i umieść na niej szkiełko nakrywkowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liczenie komórek w kielichu
	<ol>
		<li>Za pomocą mikroskopii świetlnej policz komórki kubkowe (rysunek uzupełniający 2). Dla każdego fragmentu tkanki jelitowej policz liczbę komórek kubkowych i 500 komórek nabłonkowych i wyraź stosunek komórek kubkowych jako stosunek na 100 komórek nabłonka. Komórki kielichowe najlepiej liczyć przy 20-krotnym powiększeniu i aperturze numerycznej 0,5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zliczanie komórek Panetha
	<ol>
		<li>Za pomocą mikroskopii świetlnej policz komórki Panetha (rysunek uzupełniający 2). Dla każdego fragmentu tkanki jelitowej wyraź jako stosunek komórek Panetha na kryptę jelitową. Policz 100 krypt jelitowych na każdy fragment tkanki jelitowej. Komórki Panetha najlepiej liczyć przy powiększeniu 20x-60x i aperturze numerycznej 0,50-1,30.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zapalenie błony płodowej dotyka 2–4% porodów porodowych i 25–30% porodów przedwczesnych 8,9. Jednak wpływ zapalenia błony płodowej może trwać długo po urodzeniu, ponieważ wykazano, że ma on znaczący wpływ na płód i noworodka 10,11,12,13,14,15,16.<sup class=...

Błony kosmówkowe odgrywają integralną rolę w ciąży ssaków. Należą do nich kosmówka i owodnia, które pełnią wiele funkcji. Otaczają i chronią płód, ułatwiają sygnalizację parakrynną między przedziałami matki i płodu1 i tworzą lokalne pętle sprzężenia zwrotnego w błonach kosmówkowych, które mogą być zaangażowane w inicjowanie porodu1. Obecna wiedza na temat błon wskazuje, że owodnia pełni funkcję bariery strukturalnej, a kosmówka zapewnia bufor immunologiczny przede wszystkim w celu ochrony rozwijającego się płodu przed matczynym układem odpornościowym2. Zapalenie tych błon jest znane jako zapalenie błon płodowych. Historycznie rzecz biorąc, rozpoznanie klinicznego zapalenia błony płodowej było stawiane na podstawie obecności gorączki matki oraz jednego lub więcej wyników klinicznych u płodu lub matki3,4. Jednak, chociaż ta definicja jest klinicznie użyteczna, jej brak precyzji sprawił, że badania nad zapaleniem błony płodowej są trudne. W 2015 roku, próbując wyjaśnić diagnozę, warsztat panelu ekspertów zorganizowany przez Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka Eunice Kennedy Shriver zdefiniował zapalenie błony płodowej jako wewnątrzmaciczne zapalenie błony płodowej lub infekcję, lub jedno i drugie (potrójne I)3. To wyjaśnienie jest ważne, ponieważ chociaż infekcja wywołana przez drobnoustroje jest ważną przyczyną zapalenia macicy/owodni, występuje rzadziej niż sterylne zapalenie macicy/owodni5,6,7. Ogólnie rzecz biorąc, zapalenie błony płodowej pozostaje poważnym problemem zdrowia publicznego, co widać w 2\u20124% porodów porodowych i 25\u201230% porodów przedwczesnych8,9.
Zapalenie błony płodowej może mieć znaczący wpływ na płód i noworodka. Zostało dobrze udokumentowane w literaturze, że zapalenie błony płodowej wiąże się ze zwiększonym ryzykiem wielu chorób wcześniaków, w tym dysplazji oskrzelowo-płucnej10, uszkodzenie istoty białej mózgu11, krwotok dokomorowy12, retinopatia wcześniaków13, oraz zarówno podejrzenie, jak i potwierdzona wczesna sepsa noworodków14,15. Ponieważ interesują nas mechanizmy urazu i naprawy niedojrzałego przewodu pokarmowego, ważne jest, aby zauważyć, że zapalenie błony płodowej wiąże się również z późniejszym rozwojem martwiczego zapalenia jelit (NEC)15,16. NEC to wyniszczająca choroba żołądkowo-jelitowa wcześniaków, która powoduje rozregulowaną odpowiedź gospodarza na stan zapalny i późniejszą martwicę jelit17. Każdego roku NEC dotyka ponad 4000 niemowląt w Stanach Zjednoczonych, a nawet jedna trzecia z tych niemowląt umiera z powodu choroby18. Patogeneza NEC prawdopodobnie obejmuje kombinację niedojrzałości jelitowej, rozregulowania niedojrzałego układu odpornościowego, zapalenia jelit i translokacji bakteryjnej19, czego kulminacją jest ostateczny wspólny szlak martwicy jelit. Co ważne, początek NEC często występuje kilka tygodni po urodzeniu i potencjalnym narażeniu na zapalenie błon płodowych, co sprawia, że mechanistyczny związek między zapaleniem błony płodowej a późniejszym rozwojem NEC jest niejasny20. Jednym z potencjalnych mechanizmów, dzięki którym zapalenie błony płodowej może przyczyniać się do patofizjologii NEC, jest regulacja w górę układu odpornościowego matki, a następnie wytwarzanie silnej reakcji zapalnej płodu, która może zakłócić normalne wzorce rozwojowe płodu21,22,23.
U gryzoni i owiec istnieje wiele modeli ssaków zapalenia błon płodowych u gryzoni i owiec24,25,26,27,28,29,30,31,32. Istnieje jednak niewiele danych dotyczących rozwoju przewodu pokarmowego po początkowym okresie noworodkowym po narażeniu płodu na zapalenie błon płodowych wywołane zapaleniem błon płodowych (FEMI). W celu zbadania związku między FEMI a późniejszym rozwojem uszkodzenia niedojrzałego przewodu pokarmowego, dostosowaliśmy model FEMI indukowany lipopolisacharydem (LPS). Lipopolisacharydy są głównym składnikiem powierzchni zewnątrzkomórkowej bakterii Gram-ujemnych i są silnym stymulantem wrodzonego układu odpornościowego wielu gatunków eukariotycznych, w tym ludzi33. Wstrzyknięcie LPS u matki powoduje jałową kaskadę zapalną bez zakłócających skutków żywych bakterii i jest to dobrze znany model indukcji przedwczesnego porodu34, a także model ostrego zapalenia błony płodowej i zespołu odpowiedzi zapalnej płodu (FIRS), który jest najcięższą postacią zapalenia błony płodowej24,35. Wykazano również, że wywołuje zarówno uszkodzenie istoty białej, jak i szarej mózgu w modelu owcy36 i modelu mysim37,38,39,40. Jednak, zgodnie z naszą wiedzą, jesteśmy pierwszymi, którzy używają tego modelu zapalenia błony płodowej i FEMI do zbadania jego wpływu na rozwój przewodu pokarmowego po urodzeniu, a także do zbadania możliwego mechanistycznego związku między zapaleniem błony płodowej a późniejszym rozwojem NEC41,42.

<table><tbody><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Alcian niebieska plama</td><td>Nowożeńcy dostarczają</td><td>1003A</td><td></td></tr><tr><td>myszy C57Bl6/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik hematoksylinowy</td><td>Leica</td><td>381562</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Mikroskop Ni-U</td><td>Nikon</td><td>2CE-MQVJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas okresowy</td><td>ACROS</td><td>H5106</td><td>CAS# 10450-59-9</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermofisher</td><td>Am7021</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Schiffa</td><td>Sigma</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Secor Imager 2400</td><td>Wykrywanie w skali mezo (MSD)</td><td></td><td></td></tr>Test <tr><td>V-Plex</td><td>Odkrywanie w skali mezo (MSD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Zapalenie błony płodowej jest częstym czynnikiem powodującym przedwczesne porody i jest związane z wieloma chorobami wcześniaków, w tym z martwiczym zapaleniem jelit (NEC). Jednak mechanistyczny związek między tymi dwoma warunkami nie został jeszcze odkryty. Przyjęliśmy mysi model zapalenia błony płodowej z narażeniem płodu na stan zapalny matki wywołany lipopolisacharydem (LPS). Ten model FEMI indukuje sterylną kaskadę zapalną matki, łożyska i płodu, która jest również obecna w wielu przypadkach klinicznego zapalenia błon płodowych. Chociaż istnieją modele, które wykorzystują żywe bakterie i dokładniej naśladują patofizjologię wstępującej infekcji skutkującej zapaleniem błon płodowych, metody te mogą mieć pośredni wpływ na rozwój niedojrzałego przewodu pokarmowego i związany z nim rozwijający się mikrobiom. Korzystając z tego protokołu, wykazaliśmy, że FEMI wywołane przez LPS powoduje zależny od dawki wzrost utraty ciąży i przedwczesnego porodu, a także zakłócenie normalnego rozwoju jelit u potomstwa. Ponadto wykazaliśmy, że FEMI znacznie zwiększa uszkodzenie jelit i cytokiny surowicy u potomstwa, jednocześnie zmniejszając liczbę komórek kielichowych i Panetha, które zapewniają pierwszą linię wrodzonej odporności na zapalenie jelit. Chociaż podobny model FEMI wywołany przez LPS został wykorzystany do modelowania związku między zapaleniem błony płodowej a późniejszymi nieprawidłowościami ośrodkowego układu nerwowego, według naszej wiedzy, protokół ten jest pierwszym, który próbuje wyjaśnić mechanistyczny związek między zapaleniem błony płodowej a późniejszymi zaburzeniami w rozwoju jelit jako potencjalny związek między zapaleniem błony płodowej a NEC.

Ekspozycja na FEMI w 15. dniu embrionalnym prowadzi do zależnej od dawki utraty ciąży oraz zależnej od dawki częstości występowania przedwczesnego porodu (Rysunek 1)42. Do eksperymentów zdecydowano się użyć dawki LPS wynoszącej 10 µg/kg, aby zminimalizować utratę ciąży i przedwczesność (50% strat obejmujących zarówno przedwczesność, jak i obumarcie płodu wewnątrzmacicznie), zapewniając jednocześnie płodom ekspozycję na znaczną stymulację stanu zapalnego.
<p class=...

Opracowaliśmy model zapalenia błony płodowej, aby symulować narażenie płodu na stan zapalny matki (FEMI) bez komplikacji związanych z żywymi organizmami, aby zbadać wpływ FEMI na rozwój przewodu pokarmowego potomstwa. Pozwala to na badanie mechanistycznych przyczyn rozwoju uszkodzenia jelit po zapaleniu błony płodowej.

Mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Ten protokół FEMI umożliwia zbadanie długoterminowych skutków dla noworodków po narażeniu płodu na stan zapalny matki. Jest to szczególnie istotne w przypadku rozwoju martwiczego zapalenia jelit lub NEC. Ta technika naśladuje sterylny stan zapalny, który często występuje w zapaleniu błon płodowych, a brak żywych bakterii może mieć mylący wpływ na rozwijający się przewód pokarmowy i mikrobiom.Najważniejszym krokiem tego protokołu jest wstrzyknięcie LPS w celu wywołania FEMI. Niezwykle ważne jest, aby zastosować odpowiednią dawkę LPS i aby wstrzyknięcie nie spowodowało wewnątrzotrzewnowego urazu myszy grawitacyjnej. Zacznij od rozcieńczenia wywaru LPS od jednego do 100 sterylnym roztworem soli fizjologicznej do stężenia roboczego 20 mikrogramów na mililitr.Ciężarne matki należy wstrzykiwać w dniu ciąży E15. Zważyć myszy bezpośrednio przed wstrzyknięciem w celu ustalenia właściwego dawkowania LPS, używając równoważnej objętości soli fizjologicznej dla zwierząt kontrolnych. Wiruj roztwór LPS trzy razy przez 15 sekund na wysokich obrotach.Następnie wciągnąć go do jednomililitrowej strzykawki. Użyj techniki chrupania, aby powstrzymać ciężarną mysz i przytrzymaj ją w pozycji grzbietowej. Włóż około jednej czwartej do połowy igły o rozmiarze 30 i ośmiomilimetrowym skosie w górę, nakładając się na prawy dolny kwadrant brzucha pod kątem od 30 do 40 stopni.Odciągnąć tłok strzykawki, aby zapewnić podciśnienie. Następnie należy przystąpić do wstrzykiwania, jeśli występuje podciśnienie. Monitoruj myszy przez około 30 minut, a następnie umieść je z powrotem w klatkach do końca ciąży.Urodzić młode drogą pochwową w E20 i pozwolić im pozostać z matkami, otrzymując karmienie ad libitum. Zbierz jelita w 14 dniu po urodzeniu. Użyj nożyczek i kleszczy, aby wykonać pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha, przez skórę i otrzewną, na całej długości brzucha.Wytnij jelito cienkie od żołądka do jelita ślepego i usuń krezkę. Wyizoluj dystalną trzecią część jelita cienkiego, odrzucając proksymalne jelito cienkie, jelito ślepe i okrężnicę. Podziel część jelita krętego na pół za pomocą nożyczek.Następnie umieść proksymalną połowę w roztworze stabilizującym RNA w celu ilościowego określenia RNA, a dystalną połowę w 10% neutralnej buforowanej formalinie w celu przygotowania szkiełka. Pokrój tkankę zatopioną w parafinie na plastry o grubości pięciu mikrometrów i umieść je na szkiełkach podstawowych. Odparafinować szkiełka, a następnie zabarwić skrawki hematoksyliną i eozyną zgodnie ze standardowymi procedurami.Użyj mikroskopii świetlnej, aby ocenić uogólnione uszkodzenie jelit przez dwóch oddzielnych zaślepionych badaczy na trzypunktowej skali, oceniając integralność kosmków i oddzielenie od błony podstawnej. Przypisz wynik zerowy, aby opisać normalną błonę śluzową. Przypisz wynik jeden, aby opisać łagodne uszkodzenie, które obejmuje rozwój podnabłonkowej przestrzeni Gruenhagena, wakuolizację lub podnabłonkowe podnabłonkowe podnoszenie ograniczone do blaszki właściwej lub końcówek kosmków.Przypisz wynik dwa, aby opisać ciężkie uszkodzenie, na które wskazuje uniesienie nabłonka i wakuolizację większą niż połowa kosmków, zniekształcenie kosmków lub owrzodzenie błony śluzowej i rozpad blaszki właściwej. Zanurz szkiełka w ksylenie dwa razy na 10 minut. Następnie spłucz je 100% etanolem.Zanurz szkiełka na trzy minuty w 100% etanolu, 90% etanolu, 70% etanolu i 50% etanolu. Następnie umyj szkiełka pod bieżącą wodą przez pięć minut, kierując sekcję z dala od wody, aby zapobiec utracie próbki tkanki. Przefiltruj roztwór niebieskiej bejcy Alcian za pomocą standardowego filtra do kawy i użyj go do barwienia szkiełek przez 15 minut.Następnie umyj je pod bieżącą wodą z kranu przez dwie minuty. Rozcieńczyć jeden miligram kwasu okresowego w 200 mililitrach podwójnie destylowanej wody i zanurzyć szkiełka w tym roztworze na pięć minut. Po minutowym umyciu pod bieżącą wodą zabarwić szkiełka odczynnikiem Schiffa przez 10 minut i myć je ponownie przez pięć minut.Następnie zabarwij je hematoksyliną przez jedną minutę i myj wodą przez dwie minuty. Zanurz je w kwaśnym alkoholu na minutę, następnie w wodzie z kranu Scotta na minutę, a następnie umyj pod bieżącą wodą z kranu na minutę. Aby odwodnić szkiełka, zanurz każdą szkiełko 10 razy w 70% etanolu, 90% etanolu, a następnie 100% etanolu.Zanurz szkiełka w 100% etanolu na 10 minut, a następnie zanurz dwukrotnie w świeżym ksylenie na trzy minuty za każdym razem. Umieść kroplę podłoża montażowego na próbce i szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Policz komórki kubkowe pod mikroskopem.Dla każdego kawałka tkanki jelitowej policz liczbę komórek kubkowych i 500 komórek nabłonkowych. Następnie ekspresja komórek kubkowych w stosunku na 100 komórek nabłonka. Policz komórki Panetha.Dla każdego fragmentu tkanki jelitowej zapisz stosunek komórek Panetha na kryptę jelitową, licząc 100 krypt jelitowych na każdy fragment tkanki jelitowej. Narażenie płodu na stan zapalny matki (FEMI) w 15. dniu zarodka prowadzi do zależnej od dawki utraty ciąży i zależnego od dawki wskaźnika porodu przedwczesnego. FEMI wywołuje znaczne uszkodzenie jelit po urodzeniu i w ósmym tygodniu życia.Uraz ten występuje przy braku jakichkolwiek dodatkowych bodźców dla zwierząt, co sugeruje, że sam FEMI zakłóca normalną homeostazę nowonarodzonego mysiego przewodu pokarmowego. Określono ilościowo liczbę komórek kubkowych wytwarzających mucynę i komórek Panetha wytwarzających peptydy przeciwdrobnoustrojowe w dystalnej jednej trzeciej przewodu jelita cienkiego. Stwierdzono, że FEMI zaburza prawidłowy skład nabłonka jelitowego poprzez indukowanie utraty obu typów komórek, w porównaniu ze zwierzętami bez FEMI.Aby zbadać wpływ FEMI na odpowiedź zapalną noworodków, określono ilościowo różne markery stanu zapalnego w surowicy, w tym interleukinę-1 beta, interleukinę-10, KCMRO i interleukinę-6, z surowicy młodych z FEMI i bez FEMI. FEMI znacznie zwiększył kaskadę zapalną dla wszystkich cytokin w P0. Kaskada zapalna w późniejszym wieku różniła się w zależności od punktu czasowego i cytokiny. Co ciekawe, podobne poziomy IL6 występowały w grupach od P7 do P28 w grupach FEMI i pozorowanych.Jednak w grupie FEMI stwierdzono znacznie wyższe poziomy w P56, pomimo braku wtórnej interwencji. Bardzo ważne jest, aby wykonać początkową krzywą dawki LPS, ponieważ różne zapasy LPS mogą mieć różną moc. Odkryliśmy, że nasze wyniki noworodkowe zależą od dawki LPS zastosowanej do wywołania FEMI.

a-murine-model-fetal-exposure-to-maternal-inflammation-to-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj opisana jest procedura przeprowadzania infekcji ogólnoustrojowej u noworodka szczura za pomocą kultur Escherichia coli K1. Ten nieinwazyjny zabieg pozwala na kolonizację przewodu pokarmowego, translokację patogenu do krążenia ogólnoustrojowego oraz inwazję ośrodkowego układu nerwowego w splocie naczyniówkowym.

Nieinwazyjny model neuropatogennego zakażenia Escherichia coli u nowonarodzonego szczura

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

Encefalopatia wcześniaków obejmuje nieprawidłowości ośrodkowego układu nerwowego związane z uszkodzeniem spowodowanym przedwczesnym porodem. W niniejszym raporcie opisano klinicznie istotny szczurzy model przejściowego ogólnoustrojowego niedotlenienia i niedokrwienia w macicy oraz podawania lipopolisacharydów owodniowych (LPS), który naśladuje zapalenie błon płodowych i związanego z tym wpływu bodźców zakaźnych i niedostatecznej perfuzji łożyska na rozwój OUN.

Modelowanie encefalopatii wcześniaków za pomocą prenatalnej hipoksji-niedokrwienia lipopolisacharydem wewnątrzowodniowym u szczurów

To badanie szczegółowo opisuje proces podawania precyzyjnych ilości probiotyków noworodkom myszy. Konfiguracja eksperymentalna została zoptymalizowana tak, aby obejmowała między innymi dawkowanie probiotyków, metody podawania i oznaczanie ilościowe bakterii w jelitach.

Badania probiotyczne na nowonarodzonych myszach z użyciem zgłębnika

Zakażenie noworodków myszy bioluminescencyjnym E. coli O1:K1:H7 powoduje infekcję septyczną ze znacznym zapaleniem płuc i patologią płuc. W tym miejscu opisano procedury modelowania i dalszego badania sepsy noworodków za pomocą podłużnego obrazowania przyżyciowego równolegle z wyliczaniem ogólnoustrojowych obciążeń bakteryjnych, profilowaniem stanu zapalnego i histopatologią płuc.

Noworodkowy model obrazowania posocznicy bakteryjnej Gram-ujemnej

Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest najcięższą chorobą przewodu pokarmowego (GI), która często występuje u wcześniaków, szczególnie u niemowląt o bardzo niskiej masie urodzeniowej, z wysoką śmiertelnością i niejasną patogenezą. Przyczyna NEC może być związana z nieprawidłowościami w zakresie regulacji immunologicznej. Model zwierzęcy NEC jest niezbędnym narzędziem do badań immunologicznych nad chorobą NEC. Modele zwierzęce NEC zwykle wykorzystują nowonarodzone myszy C57BL/6J; Myszy...

Mysi model martwiczego zapalenia jelit u noworodków BALB/c

Ten protokół opisuje model in vitro martwiczego zapalenia jelit (NEC), który może być wykorzystany do mechanistycznych badań nad patogenezą choroby. Posiada chip mikroprzepływowy wysiany enteroidami jelitowymi pochodzącymi z ludzkiego jelita noworodka, komórek śródbłonka i mikrobiomu jelitowego noworodka z ciężkim NEC.

Mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit zawierający enteroidy jelitowe ludzkiego noworodka i mikrobiom dysbiotyczny

Wcześniaki (poród &lt; 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Ten protokół opisuje noworodkowy model mysiego nektyzującego enterokolitisu (NEC) oraz późniejsze izolację komórek odpornościowych z blaszki właściwej jelita cienkiego noworodków.

Model myszy noworodkowej nekrotyzującego enterokolitu i izolacji lamina propria w celu profilaktyki komórek odpornościowych

Artykuł zawiera kompleksowy protokół do wygenerowania modelu mysiego aktywacji immunologicznej matki (MIA) w celu zbadania wpływu wczesnego zapalenia w czasie ciąży na neurorozwój, w tym kluczowe wskaźniki, aby zapewnić niezawodność i powtarzalność.

Generowanie wczesno-ciążowego modelu aktywacji odporności matczynej u myszy w celu oceny prenatalnego stanu zapalnego na neurorozwój

Poznaj model narażenia płodu na stan zapalny matki u myszy, który pozwala badać mechanizmy uszkodzenia jelit noworodka po chorioamnionitis. Ta metoda symuluje sterylną reakcję zapalną bez bakterii.

Mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka (Wideo) | JoVE Journal

Mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka

Przeglądaj więcej filmów