Mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka

Opracowaliśmy model zapalenia błony płodowej, aby symulować narażenie płodu na stan zapalny matki (FEMI) bez komplikacji związanych z żywymi organizmami, aby zbadać wpływ FEMI na rozwój przewodu pokarmowego potomstwa. Pozwala to na badanie mechanistycznych przyczyn rozwoju uszkodzenia jelit po zapaleniu błony płodowej.

Ten protokół FEMI umożliwia zbadanie długoterminowych skutków dla noworodków po narażeniu płodu na stan zapalny matki. Jest to szczególnie istotne w przypadku rozwoju martwiczego zapalenia jelit lub NEC. Ta technika naśladuje sterylny stan zapalny, który często występuje w zapaleniu błon płodowych, a brak żywych bakterii może mieć mylący wpływ na rozwijający się przewód pokarmowy i mikrobiom.

Najważniejszym krokiem tego protokołu jest wstrzyknięcie LPS w celu wywołania FEMI. Niezwykle ważne jest, aby zastosować odpowiednią dawkę LPS i aby wstrzyknięcie nie spowodowało wewnątrzotrzewnowego urazu myszy grawitacyjnej. Zacznij od rozcieńczenia wywaru LPS od jednego do 100 sterylnym roztworem soli fizjologicznej do stężenia roboczego 20 mikrogramów na mililitr.

Ciężarne matki należy wstrzykiwać w dniu ciąży E15. Zważyć myszy bezpośrednio przed wstrzyknięciem w celu ustalenia właściwego dawkowania LPS, używając równoważnej objętości soli fizjologicznej dla zwierząt kontrolnych. Wiruj roztwór LPS trzy razy przez 15 sekund na wysokich obrotach.

Następnie wciągnąć go do jednomililitrowej strzykawki. Użyj techniki chrupania, aby powstrzymać ciężarną mysz i przytrzymaj ją w pozycji grzbietowej. Włóż około jednej czwartej do połowy igły o rozmiarze 30 i ośmiomilimetrowym skosie w górę, nakładając się na prawy dolny kwadrant brzucha pod kątem od 30 do 40 stopni.

Odciągnąć tłok strzykawki, aby zapewnić podciśnienie. Następnie należy przystąpić do wstrzykiwania, jeśli występuje podciśnienie. Monitoruj myszy przez około 30 minut, a następnie umieść je z powrotem w klatkach do końca ciąży.

Urodzić młode drogą pochwową w E20 i pozwolić im pozostać z matkami, otrzymując karmienie ad libitum. Zbierz jelita w 14 dniu po urodzeniu. Użyj nożyczek i kleszczy, aby wykonać pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha, przez skórę i otrzewną, na całej długości brzucha.

Wytnij jelito cienkie od żołądka do jelita ślepego i usuń krezkę. Wyizoluj dystalną trzecią część jelita cienkiego, odrzucając proksymalne jelito cienkie, jelito ślepe i okrężnicę. Podziel część jelita krętego na pół za pomocą nożyczek.

Następnie umieść proksymalną połowę w roztworze stabilizującym RNA w celu ilościowego określenia RNA, a dystalną połowę w 10% neutralnej buforowanej formalinie w celu przygotowania szkiełka. Pokrój tkankę zatopioną w parafinie na plastry o grubości pięciu mikrometrów i umieść je na szkiełkach podstawowych. Odparafinować szkiełka, a następnie zabarwić skrawki hematoksyliną i eozyną zgodnie ze standardowymi procedurami.

Użyj mikroskopii świetlnej, aby ocenić uogólnione uszkodzenie jelit przez dwóch oddzielnych zaślepionych badaczy na trzypunktowej skali, oceniając integralność kosmków i oddzielenie od błony podstawnej. Przypisz wynik zerowy, aby opisać normalną błonę śluzową. Przypisz wynik jeden, aby opisać łagodne uszkodzenie, które obejmuje rozwój podnabłonkowej przestrzeni Gruenhagena, wakuolizację lub podnabłonkowe podnabłonkowe podnoszenie ograniczone do blaszki właściwej lub końcówek kosmków.

Przypisz wynik dwa, aby opisać ciężkie uszkodzenie, na które wskazuje uniesienie nabłonka i wakuolizację większą niż połowa kosmków, zniekształcenie kosmków lub owrzodzenie błony śluzowej i rozpad blaszki właściwej. Zanurz szkiełka w ksylenie dwa razy na 10 minut. Następnie spłucz je 100% etanolem.

Zanurz szkiełka na trzy minuty w 100% etanolu, 90% etanolu, 70% etanolu i 50% etanolu. Następnie umyj szkiełka pod bieżącą wodą przez pięć minut, kierując sekcję z dala od wody, aby zapobiec utracie próbki tkanki. Przefiltruj roztwór niebieskiej bejcy Alcian za pomocą standardowego filtra do kawy i użyj go do barwienia szkiełek przez 15 minut.

Następnie umyj je pod bieżącą wodą z kranu przez dwie minuty. Rozcieńczyć jeden miligram kwasu okresowego w 200 mililitrach podwójnie destylowanej wody i zanurzyć szkiełka w tym roztworze na pięć minut. Po minutowym umyciu pod bieżącą wodą zabarwić szkiełka odczynnikiem Schiffa przez 10 minut i myć je ponownie przez pięć minut.

Następnie zabarwij je hematoksyliną przez jedną minutę i myj wodą przez dwie minuty. Zanurz je w kwaśnym alkoholu na minutę, następnie w wodzie z kranu Scotta na minutę, a następnie umyj pod bieżącą wodą z kranu na minutę. Aby odwodnić szkiełka, zanurz każdą szkiełko 10 razy w 70% etanolu, 90% etanolu, a następnie 100% etanolu.

Zanurz szkiełka w 100% etanolu na 10 minut, a następnie zanurz dwukrotnie w świeżym ksylenie na trzy minuty za każdym razem. Umieść kroplę podłoża montażowego na próbce i szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Policz komórki kubkowe pod mikroskopem.

Dla każdego kawałka tkanki jelitowej policz liczbę komórek kubkowych i 500 komórek nabłonkowych. Następnie ekspresja komórek kubkowych w stosunku na 100 komórek nabłonka. Policz komórki Panetha.

Dla każdego fragmentu tkanki jelitowej zapisz stosunek komórek Panetha na kryptę jelitową, licząc 100 krypt jelitowych na każdy fragment tkanki jelitowej. Narażenie płodu na stan zapalny matki (FEMI) w 15. dniu zarodka prowadzi do zależnej od dawki utraty ciąży i zależnego od dawki wskaźnika porodu przedwczesnego. FEMI wywołuje znaczne uszkodzenie jelit po urodzeniu i w ósmym tygodniu życia.

Uraz ten występuje przy braku jakichkolwiek dodatkowych bodźców dla zwierząt, co sugeruje, że sam FEMI zakłóca normalną homeostazę nowonarodzonego mysiego przewodu pokarmowego. Określono ilościowo liczbę komórek kubkowych wytwarzających mucynę i komórek Panetha wytwarzających peptydy przeciwdrobnoustrojowe w dystalnej jednej trzeciej przewodu jelita cienkiego. Stwierdzono, że FEMI zaburza prawidłowy skład nabłonka jelitowego poprzez indukowanie utraty obu typów komórek, w porównaniu ze zwierzętami bez FEMI.

Aby zbadać wpływ FEMI na odpowiedź zapalną noworodków, określono ilościowo różne markery stanu zapalnego w surowicy, w tym interleukinę-1 beta, interleukinę-10, KCMRO i interleukinę-6, z surowicy młodych z FEMI i bez FEMI. FEMI znacznie zwiększył kaskadę zapalną dla wszystkich cytokin w P0. Kaskada zapalna w późniejszym wieku różniła się w zależności od punktu czasowego i cytokiny. Co ciekawe, podobne poziomy IL6 występowały w grupach od P7 do P28 w grupach FEMI i pozorowanych.

Jednak w grupie FEMI stwierdzono znacznie wyższe poziomy w P56, pomimo braku wtórnej interwencji. Bardzo ważne jest, aby wykonać początkową krzywą dawki LPS, ponieważ różne zapasy LPS mogą mieć różną moc. Odkryliśmy, że nasze wyniki noworodkowe zależą od dawki LPS zastosowanej do wywołania FEMI.