Name: Test ex vivo do badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj test ex vivo do badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym. Ta metoda wykorzystuje homogenaty jelitowe i barwienie immunofluorescencyjne do analizy sygnałów środowiskowych regulujących przejścia morfogenetyczne grzybów w jelitach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za zasoby i wsparcie ze strony ośrodka badawczego Midwestern University Cellular and Molecular Core Research.

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), jak opisano wcześniej57. Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Środkowo-Zachodnim zatwierdził to badanie zgodnie z protokołem MWU IACUC #2894. Polityka MWU w zakresie opieki nad zwierzętami jest zgodna z Polityką Publicznej Służby Zdrowia (PHS) dotyczącą humanitarnej opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych oraz zasadami określonymi w ustawie o dobrostanie zwierząt (AWA).
1. Standardowy protokół badania na myszach
<ol>
	<li>Użyj samców i samic myszy C57BL/6J w wieku co najmniej sześciu tygodni. Uzupełnij je sterylną wodą z cefoperazonem lub bez niego (0,5 mg/ml).
	<ol>
		<li>Myszy trzymane razem w grupach po 5 sztuk, przy czym każda klatka zawiera wszystkie samce lub samice myszy. Przez cały czas dostarczaj myszom standardową karmę dla myszy i wodę (w butelce o pojemności 400 ml).</li>
		<li>Codziennie sprawdzaj klatki, aby upewnić się, że poziom pożywienia i wody jest wystarczający, a także badaj myszy pod kątem oznak niepokoju.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wodę z cefoperazonem należy wymieniać co 48 godzin, aby zapewnić dopływ świeżego antybiotyku niezależnie od pozostałej wody w butelkach do karmienia w klatce.</li>
	<li>Po 5-7 dniach leczenia cefoperazonem, należy poddać myszy eutanazji przez uduszenie CO2 zgodnie z ustalonym protokołem IACUC. Potwierdź zgon przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Wypreparuj myszy za pomocą wysterylizowanych w autoklawie nożyczek z ostrymi końcami i kleszczy sterylizowanych w autoklawie.
	<ol>
		<li>Po eutanazji przymocuj zwierzę do powierzchni preparacji, przypinając wszystkie kończyny tak, aby brzuch był odsłonięty.</li>
		<li>Spryskaj okolice brzucha 70% etanolem, aby zapobiec przywieraniu futra do kleszczy, nożyczek lub skrawków jelit podczas sekcji.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby uszczypnąć i podnieść fragment skóry u podstawy brzucha i wykonaj małe nacięcie przez skórę i leżącą pod nią powięź za pomocą nożyczek. Zachowaj szczególną ostrożność podczas wykonywania tego nacięcia, aby uniknąć przebicia jelita ślepego lub ściany jelita.</li>
		<li>Przedłuż to cięcie do klatki piersiowej, częściowo odsłaniając jamę otrzewnej. Wykonaj cięcie zaczynając od punktu początkowego nacięcia po obu stronach, rozciągając się w górę i na boki.</li>
		<li>Pociągnij te płaty na boki i przypnij do powierzchni preparucyjnej, aby całkowicie odsłonić jamę otrzewnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń przewód pokarmowy za pomocą kleszczy, jednocześnie używając nożyczek do wykonania nacięć nad żołądkiem i w dystalnym obszarze jelita grubego, aby zapewnić pobranie jak największej ilości treści jelitowej z każdej sekcji.</li>
	<li>Podczas usuwania przewodu pokarmowego należy uważać, aby nie doszło do pęknięcia poszczególnych elementów. Oddziel żołądek, jelito cienkie, jelito ślepe i jelito grube indywidualnie za pomocą nożyczek na ich bliższych i dalszych końcach.</li>
	<li>Aby pobrać każdą zawartość jelita z każdej sekcji, wykonaj pojedyncze nacięcie na dystalnym końcu każdej sekcji za pomocą nożyczek, a następnie ręcznie wyrzuć zawartość jelita do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Zawartość jelit należy przechowywać w temperaturze -80 °C do testów ex vivo.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytek agarowych z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YPD)
<ol>
	<li>Do szklanej butelki o pojemności 1 l dodaj 25 g ekstraktu drożdżowego w postaci bulionu peptonowo-dekstrozowego w proszku, 10 g agaru i ultraczystą wodę do końcowej objętości 500 ml.</li>
	<li>Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 30 minut w cyklu płynnym w celu sterylizacji pożywki.</li>
	<li>Pod okapem z przepływem laminarnym wlej około 20 ml podłoża agarowego do sterylnej płytki Petriego. 500 ml podłoża agarowego powinno dać około 25 płytek.</li>
	<li>Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie ex vivo do testu morfogenezy strzępek
<ol>
	<li>Świeżą kulturę C. albicans SC5314 rozmieścić na płytce agarowej YPD i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Wybierz dwie do trzech średniej wielkości indywidualnych kolonii z wyhodowanej przez noc kultury C. albicans SC5314 i ponownie zawiesić w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Wyjmij zamrożoną zawartość jelit z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmroź w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Zważ około 150 mg treści jelitowej do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Ponownie zawiesić zawartość jelitową w 150 μl PBS (zawartość jelit i PBS w stosunku wagowym 1:1 do objętości).</li>
	<li>Wiruj z dużą prędkością przez 30 sekund, aby ujednorodnić zawartość jelit i pozostaw w temperaturze pokojowej na około minutę.</li>
	<li>Odwirować homogenaty przy 1000 x g przez 3 min.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.7 i 3.8, aby usunąć wszystkie zanieczyszczenia z supernatantu.</li>
	<li>Dodać 10 μl inokulum C. albicans SC5314 przygotowanego powyżej do tego supernatantu</li>
	<li>Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4-5 godzin.</li>
</ol>
4. Egzogenne dodawanie metabolitów do ekstraktów homogenatu jelitowego do badania morfogenezy strzępek
<ol>
	<li>Pobrać zamrożoną zawartość jelit z zamrażarki o temperaturze -80 °C i ponownie zawiesić w PBS w stosunku 1:1 (waga: objętość).</li>
	<li>Dodaj pożądane stężenie metabolitów jelitowych do treści jelitowej i mieszaniny PBS.</li>
	<li>Wirować z dużą prędkością przez 30 s w celu homogenizacji treści jelitowej zawierającej metabolity i pozostawić w temperaturze pokojowej na około 10 minut.</li>
	<li>Odwirować homogenaty przy 1000 x g przez 3 min.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć kroki 4.4 i 4.5, aby usunąć wszystkie zanieczyszczenia z supernatantu.</li>
	<li>Dodać 10 μl inokulum C. albicans SC5314 przygotowanego powyżej do tego supernatantu. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4-5 godzin.</li>
</ol>
5. Test morfogenezy C. albicans (barwienie immunologiczne i obrazowanie)
<ol>
	<li>Odwirować próbki o masie 1000 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant przez pipetowanie.</li>
	<li>Utrwalić próbki w 100 μl 2% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut.</li>
	<li>Odwirować przy 1000 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant przez pipetowanie.</li>
	<li>Próbki należy przemyć dwukrotnie 1 ml PBS. Aby umyć próbki, należy ponownie zawiesić osad w PBS, delikatnie pipetując. Nie należy wirować próbki, ponieważ może to uszkodzić struktury strzępek. Po ponownym zawieszeniu odwirować przy 1000 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant przez pipetowanie.</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze pokojowej w 100 μl PBS zawierającego poliklonalne przeciwciało C. albicans (rozcieńczenie 1:100) przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyć próbki trzykrotnie 1 ml PBS. 
	UWAGA: W przypadku stosowania przeciwciała fluorescencyjnego zaleca się, aby wszystkie etapy rozcieńczania i mycia były wykonywane w słabym świetle, aby uniknąć wybielania fotograficznego i wydłużyć żywotność próbki.</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut w 100 μl PBS zawierającego przeciwciało anty-IgG IgG Alexafluor 488 w rozcieńczeniu 1:500. Wykonaj inkubację w ciemnej szufladzie lub pokoju, aby uniknąć wybielania zdjęć.</li>
	<li>Umyć próbki trzykrotnie 1 ml PBS.</li>
	<li>Ponownie zawiesić próbki w 100 μl PBS i przenieść na 96-dołkową płytkę w celu obrazowania. 
	UWAGA: Gdy nie jest obrazowana, zaleca się, aby 96-dołkowa płytka była owinięta folią aluminiową, aby uniknąć wybielania fotograficznego.</li>
	<li>Obrazuj komórki grzybów za pomocą soczewek obiektywowych 20x i 40x za pomocą mikroskopu obrazowania fluorescencyjnego. Użyj filtra z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) (długość fali wzbudzenia 470/40 i długość fali emisji 525/50) do wykrywania fluorescencji.</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Opisana metoda przedstawia nowatorski sposób badania wpływu wpływu antybiotyków, diety, ksenobiotyków i terapii na morfogenezę strzępek C. albicans w przewodzie pokarmowym. Ponieważ większość zakażeń ogólnoustrojowych pochodzi z przewodu pokarmowego 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34, a tworzenie strzępek jest krytycznym czynnikiem wirulencji, który sprzyja<sup class=...

Candida albicans jest oportunistycznym, polimorficznym patogenem grzybiczym, który zwykle jest komensalny, ale może ulec zmianie morfologicznej do postaci zjadliwej, zdolnej do wywoływania zagrażających życiu infekcji u osób z obniżoną odpornością1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans jest główną przyczyną ogólnoustrojowych zakażeń szpitalnych, ze śmiertelnością 40-60% nawet przy leczeniu przeciwgrzybiczym2,14,15. Chociaż C. albicans zamieszkuje różne nisze żywicielskie, w tym żeński układ rozrodczy16,17, jama ustna zdrowych osobników18 i przewód pokarmowy (GI)19,20, większość zakażeń ogólnoustrojowych pochodzi z przewodu pokarmowego, a ponadto często potwierdza się, że źródłem infekcji ogólnoustrojowej jest przewód pokarmowy21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32, 33,34. Na patogenność C. albicans w przewodzie pokarmowym wpływa wiele czynników; Jednak główną cechą niezbędną do zjadliwości jest przejście od morfologii komórek drożdży do morfologii zjadliwych komórek strzępkowych35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. Przyczepianie się i rozprzestrzenianie C. albicans z przewodu pokarmowego podczas infekcji jest silnie związane z jego zdolnością do przekształcania się z drożdży komensalnych w zjadliwe strzępki, co pozwala grzybom na wywołanie choroby inwazyjnej44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
Różne czynniki w jelitach, w tym n-acetyloglukozamina, regulują tworzenie strzępek przez C. albicans. Dlatego tak ważne jest zawężenie luki w wiedzy na temat morfogenezy strzępek tego patogenu grzybowego w przewodzie pokarmowym 54,55,56. Najnowsze dowody wskazują, że różne metabolity jelitowe w różny sposób kontrolują morfogenezę strzępek C. albicans in vitro57,58,59,60. Jednak ograniczenia techniczne stwarzają problemy przy próbie zbadania tworzenia strzępek C. albicans w próbkach jelit in vivo, zwłaszcza barwienia komórek drożdży i strzępek oraz ilościowej analizy rozwoju strzępek. Aby zrozumieć morfogenezę strzępek C. albicans w przewodzie pokarmowym, opracowano metodę ex vivo z wykorzystaniem rozpuszczalnych ekstraktów o homogenizowanej zawartości jelitowej od myszy w celu zbadania wpływu metabolitów na morfogenezę strzępek grzybów. Wykorzystując próbki jelit od myszy, które są oporne i podatne na zakażenie C. albicans, metoda ta pomoże zidentyfikować i zbadać wpływ metabolitów, antybiotyków i ksenobiotyków na morfogenezę strzępek grzybów w przewodzie pokarmowym.

<table><tbody><tr><td>1 - 10 &mikro; L Końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-454</td><td>Misc</td></tr><tr><td>100 - 1000 &micro; L Końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-400</td><td>Różne</td></tr><tr><td>20 - 200 &mikro; L Końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-451</td><td></td></tr><tr><td>Różne Kwas 2-metylomasłowy</td><td>Sigma</td><td>193070-25G</td><td>związek hamujący działanie hipalne</td></tr><tr><td>488 kozi anty-królik IgG</td><td>Invitrogen (Fisher)</td> <td>A11008</td><td>IF Barwienie wtórne ab</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>Składnik agarowy YPD</td></tr><tr><td>Automatyczny mikroskop obrazowania</td><td>Keyence</td><td>BZX700</td><td></td></tr><tr><td>Candida Albicans Przeciwciało</td><td>Invitrogen (Fisher)</td> <td>PA1-27158</td><td>IF Barwienie pierwotne ab</td></tr><tr><td>cefoperazon</td><td>Kajman</td><td>16113</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>kwas dezoksycholowy</td><td>Sigma</td><td>30960</td><td>związek hamujący działanie układu nasennego</td></tr><tr><td>D-Glukoza Fisher</td><td></td><td>D16-500</td> kleszcze <td>złożone promujące działanie układu pokarmowego</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>08-885</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mlekowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAAL13242-06</td><td>związek hamujący działanie kwasu</td></tr><tr><td>hipochalowego kwas litocholowy</td><td>Sigma</td><td>L6250-10G</td><td>związek hamujący działanie kwasu hifalicznego</td></tr><tr><td>kwas palmitynowy</td><td>Sigma</td><td>P5585-10G</td><td>związek hamujący działanie układu hifalicznego</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td>IF Utrwalacz barwiący</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10x</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62692</td><td>PBS składnik</td></tr><tr><td>kwas p-tolilooctowy</td><td>SCBT</td><td>sc-257959</td><td>związek hamujący działanie układu nasennego</td></tr><tr><td>kwas sebacynowy</td><td>Sigma</td><td>283258-250G</td><td>związek hamujący działanie nasenne</td></tr><tr><td>nożyczki z ostrymi końcami</td><td>Fisher</td><td>28301</td><td></td></tr><tr><td>sterylna woda Milli-Q</td><td>nie</td> dotyczy <td>nie dotyczy</td><td>Różne</td></tr><tr><td>YPD Bulion</td><td>BD Biosciences</td><td>242810</td><td>Składnik agarowy YPD</td></tr></tbody></table>

test ex vivo do badania morfogenezy strzępek candida albicans w przewodzie pokarmowym

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Morfogeneza strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym (GI) jest ściśle kontrolowana przez różne sygnały środowiskowe i odgrywa ważną rolę w rozprzestrzenianiu się i patogenezie tego oportunistycznego patogenu grzybowego. Jednak metody wizualizacji strzępek grzybów w przewodzie pokarmowym in vivo są trudne, co ogranicza zrozumienie sygnałów środowiskowych w kontrolowaniu tego procesu morfogenezy. Opisany tutaj protokół demonstruje nowatorską metodę ex vivo do wizualizacji morfogenezy strzępek w ekstraktach homogenatów jelitowych. Wykorzystując test ex vivo, badanie to pokazuje, że treść jelita ślepego u myszy leczonych antybiotykami, ale nie od nieleczonych myszy kontrolnych, sprzyja morfogenezie strzępek C. albicans w treści jelitowej. Co więcej, dodanie z powrotem określonych grup metabolitów jelitowych do treści jelita ślepego myszy leczonych antybiotykami w różny sposób reguluje morfogenezę strzępek ex vivo. Podsumowując, protokół ten stanowi nowatorską metodę identyfikacji i badania sygnałów środowiskowych, które kontrolują morfogenezę strzępek C. albicans w przewodzie pokarmowym.

Wyniki te, wraz z wcześniejszymi ustaleniami laboratorium Thangamaniego60, wskazują, że gdy C. albicans jest hodowany ex vivo w ekstraktach z homogenatów jelit pobranych z żołądka, jelita cienkiego i jelita grubego myszy z grupy kontrolnej oraz myszy leczonych antybiotykami, C. albicans zazwyczaj rozwija się w morfologii drożżakowej (Ryc. 1B). Jednakże, w przypadku hodowli w ekstrakcie z kątnicy myszy leczonych antybiotykami, C. albicans łat...

Test ex vivo opisany w tym badaniu z wykorzystaniem ekstraktów homogenatu jelitowego i barwienia immunofluorescencyjnego stanowi nowatorską metodę badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym. Metoda ta może być wykorzystana do badania sygnałów środowiskowych regulujących przemianę morfogenetyczną w jelitach.

Test ex vivo do badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Protokół zademonstrowany w tym filmie pozwala nam zrozumieć rolę metabolitów jelitowych w morfogenezie strzępek grzybów. Ta technika ex vivo jest mniej więcej najbliższym przybliżeniem jelita do badania morfogenezy strzępek grzybów w sposób, którego nie można powtórzyć w żadnym badaniu in vitro. Metoda ta może być stosowana do badania roli metabolitów jelitowych w innych patogenach jelitowych.Wypreparuj myszy za pomocą autoklawowanych, sterylizowanych, ostro zakończonych nożyczek i kleszczy. Po eutanazji przymocuj zwierzę do powierzchni sekcyjnej, przypinając wszystkie kończyny, aby odsłonić brzuch. Spryskaj okolice brzucha 70% etanolem, aby zapobiec przywieraniu futra do kleszczy, nożyczek lub odcinków jelita.Użyj kleszczy, aby uszczypnąć i unieść fragment skóry u podstawy brzucha i wykonaj małe nacięcie przez skórę i leżącą pod nią powięź, uważając, aby uniknąć przebicia jelita ślepego lub ściany jelita. Rozciągnij to cięcie do klatki piersiowej, częściowo odsłaniając jamę otrzewnej, a następnie wykonaj cięcie, zaczynając od miejsca początkowego nacięcia po obu stronach i rozciągając się w górę i na boki. Pociągnij te klapki na boki i przypnij je do powierzchni preparującej, aby całkowicie odsłonić jamę otrzewnej.Usuń przewód pokarmowy za pomocą kleszczy, używając nożyczek, aby wykonać cięcia lepsze od żołądka i w dystalnym obszarze jelita grubego, aby zapewnić zebranie jak największej ilości treści jelitowej. Podczas usuwania przewodu pokarmowego należy uważać, aby nie doszło do pęknięcia poszczególnych elementów. Oddziel żołądek, jelito cienkie, jelito ślepe i jelito grube na ich bliższych i dalszych końcach.Aby zebrać zawartość jelita z każdej sekcji, wykonaj pojedyncze nacięcie na dystalnym końcu, a następnie ręcznie wyrzuć zawartość jelita do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej za pomocą kleszczy. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do testów ex vivo. Umieść świeżą kulturę C.albicans SC5314 na płytce agarowej YPD i inkubuj ją przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Następnego dnia wybierz dwie lub trzy średniej wielkości pojedyncze kolonie i umieść je ponownie w jednym mililitrze PBS. Wyjmij zamrożoną zawartość jelit z zamrażarki i rozmroź ją w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Przenieś około 150 miligramów zawartości jelit do nowej 1,5-mililitrowej probówki i ponownie zamieszaj je ze 150 mikrolitrami PBS.Wirować próbkę z dużą prędkością przez 30 sekund w celu homogenizacji zawartości jelit i pozostawić ją w temperaturze pokojowej na około minutę. Odwirować homogenaty w temperaturze 1000 razy G przez trzy minuty, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra, uważając, aby nie przenieść żadnych zanieczyszczeń. Po powtórzeniu wirowania dodać 10 mikrolitrów inokulum C.albicans do supernatantu, dobrze wymieszać i inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery do pięciu godzin.Aby przetestować wpływ egzogennych metabolitów na C. albicans, dodaj pożądane stężenie metabolitów do treści jelitowej i mieszaniny PBS, a następnie wiruj próbkę z dużą prędkością przez 30 sekund, pozostaw ją w temperaturze pokojowej na 10 minut i przeprowadź wirowanie i inokulację, jak opisano wcześniej. Odwirować kulturę komórkową grzybów w temperaturze 1 000 razy G przez dwie minuty i odrzucić supernatant. Umieścić próbki w 100 mikrolitrach 2% PFA przez 15 minut, następnie powtórzyć wirowanie i wyrzucić supernatant.Przemyć próbki dwukrotnie jednym mililitrem PBS zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej w 100 mikrolitrach PBS z poliklonalnym przeciwciałem C. albicans przez 30 minut. Po inkubacji umyj próbkę jeszcze trzy razy PBS, pracując w słabym świetle, aby uniknąć fotowybielania. W ciemnym pomieszczeniu inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 15 minut w 100 mikrolitrach PBS zawierających przeciwciało anty-królicze IgG Alexa Fluor 488 w rozcieńczeniu od jednego do 500.Po trzykrotnym umyciu próbki jednym mililitrem PBS, ponownie zawiesić ją w 100 mikrolitrach PBS i przenieść na 96-dołkową płytkę w celu obrazowania. Zobrazuj komórki grzybów za pomocą mikroskopu do obrazowania fluorescencyjnego przy użyciu soczewek obiektywowych 20X i 40X oraz zielonego fluorescencyjnego filtra białkowego. Kiedy C. albicans jest hodowany ex vivo w ekstraktach homogenatu jelitowego pobranych z żołądka, jelita cienkiego i jelita grubego myszy nieleczonych kontrolą i leczonych antybiotykami, na ogół rozwija się z morfologią drożdży.Jednak w przypadku wzrostu w ekstrakcie z jelita ślepego od myszy leczonych antybiotykami, C. albicans łatwo ulega morfogenezie, w wyniku czego powstają drożdże i strzępki. Wskazuje to, że antybiotykoterapia powoduje zmiany w środowisku jelita ślepego, które indukują morfogenezę strzępek C. Albicans. Egzogenne dodanie glukozy do homogenatu jelita ślepego myszy leczonych antybiotykiem wykazało masywny rozwój strzępek ex vivo.Wyniki te sugerują, że dodanie metabolitów jelitowych z powrotem do homogenatu jelita ślepego myszy leczonych antybiotykami w różny sposób reguluje morfogenezę C. albicans. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że optymalizacja rozcieńczenia treści jelitowej zapewnia wystarczające zbieranie metabolitów jelitowych bez gromadzenia się zanieczyszczeń. Nie należy przekraczać rozcieńczenia zawartości pożywki do jelita dwa do jednego i dążyć do mniejszego rozcieńczenia, jeśli to możliwe.Technika ta jest obecnie wykorzystywana do zbadania, w jaki sposób określone metabolity w jelitach wpływają na rozwój strzępek, co pozwala naukowcom lepiej zrozumieć rolę metabolitów jelitowych w patogenezie grzybów.

an-ex-vivo-assay-to-study-candida-albicans-hyphal-morphogenesis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje rozwój mysiego modelu in vivo do badania tworzenia biofilmu Candida albicans w tkance podskórnej. Eksperyment polega na wszczepieniu urządzeń zakażonych Candida w okolicy pleców zwierzęcia w celu rozwoju biofilmu.

Candida albicans (Candida albicans) Tworzenie biofilmu w mysim modelu in vivo

Ten film demonstruje technikę in vitro do badania wpływu przeciwciał na biofilmy grzybów. Chorobotwórczy grzyb Candida tropicalis wydziela czynnik wirulencji wydzielający proteinazę aspartylową 2 (Sap2), ułatwiając tworzenie biofilmu. Po wprowadzeniu inaktywowanej termicznie surowicy zawierającej przeciwciała specyficzne dla Sap2, które hamują dojrzewanie biofilmu, ocenia się żywotność komórek grzyba za pomocą testu chromogennego.

Test in vitro w celu oceny wpływu przeciwciał na biofilm Candida tropicalis

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów.  Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Przedstawiamy eksperymentalną procedurę rozwoju biofilmu Candida albicans w mysim modelu podskórnym. Biofilmy grzybów określono ilościowo, określając liczbę jednostek tworzących kolonie oraz nieinwazyjne obrazowanie bioluminescencyjne, w którym ilość wytwarzanego światła odpowiada liczbie żywotnych komórek.

Candida albicans (Candida albicans) Rozwój biofilmu na istotnych z medycznego punktu widzenia ciałach obcych w mysim modelu podskórnym, a następnie obrazowanie bioluminescencyjne

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Ten protokół opisuje użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji tworzenia biofilmu u Candida albicans w warunkach fizjologicznych gospodarza.

Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół badania oddychania mitochondrialnego i funkcji glikolitycznej u Candida Albicans za pomocą dodatkowego analizatora strumienia.

Badanie bioenergetyczne Candida albicans przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Celem tego protokołu jest wizualizacja kształtu i lokalizacji komórek Candida albicans w przewodzie pokarmowym ssaków.

Wizualizacja Candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Ten manuskrypt opisuje metodę badania przesiewowego bibliotek mutantów Candida albicans średniej wielkości pod kątem fenotypów morfogenezy podczas aktywnej infekcji u ssaków za pomocą nieinwazyjnej mikroskopii konfokalnej.

Zastosowanie obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy u zmutowanych szczepów Candida albicans podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza

Tworzymy mysi model infekcji związanej z cewnikiem (CRI) związanej z C.albicans, w której na cewniku tworzy się biofilm, a interakcja między C.albicans a gospodarzem dobrze koreluje z klinicznym CRI. Model ten pomaga w badaniach przesiewowych w kierunku CRI związanego z biofilmem C. albicans, kładąc podwaliny pod transformację kliniczną.

Model zakażenia Candida albicans związany z cewnikiem u myszy

Poznaj test ex vivo do badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym. Ta metoda wykorzystuje homogenaty jelitowe i barwienie immunofluorescencyjne do analizy sygnałów środowiskowych regulujących przejścia morfogenetyczne grzybów w jelitach.

Test ex vivo do badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym

Przeglądaj więcej filmów