Name: Fosfoproteomiczna strategia profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u rzodkiewnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Poznaj fosfoproteomiczną strategię profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u Arabidopsis. Ta metoda umożliwia kompleksową analizę fosfoproteomu roślinnego z wysoką przepustowością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Strategiczny Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk, Grant XDB27040106.

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Zbierz sadzonki kontrolne i poddane działaniu stresu (1 g) w folię aluminiową i błyskawicznie zamroź próbki w ciekłym azocie. 
	UWAGA: Wyższe stężenie białka obserwuje się zwykle u siewek dwutygodniowych niż u dojrzałych roślin. Jeden gram siewek generuje około 10 mg lizatu białkowego, co wystarcza do analizy MS. Wszystkie etapy wirowania odbywają się przy 16 000 x g w kroku 1.</li>
	<li>Zmiel zamrożone sadzonki na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka wypełnionego ciekłym azotem.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu do lizy ((6 M guanidyna-HCl w 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) z 10 mM chlorowodorkiem tris (2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP), 40 mM chloroacetamidu 2-chloroacetamidu (CAA), inhibitorem proteazy i koktajlem inhibitorów fosfatazy) do moździerza i wymieszać za pomocą tłuczka.</li>
	<li>Przenieść lizat roślinny do probówki o pojemności 1,5 ml i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Umieść probówkę na lodzie na 10 minut. Sonikuj probówkę na lodzie przez 10 s, zatrzymaj się na 10 s i powtórz trzykrotnie.</li>
	<li>Odwirować probówkę przez 20 minut i podać 150 μl lizatu roślinnego do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Do probówki dodać 600 μl 100% metanolu. Wiruj i odkręć rurkę.</li>
	<li>Do probówki dodać 150 μl 100% chloroformu. Wiruj i odkręć rurkę.</li>
	<li>Dodać 450 μl ddH2O do probówki. Wirować i odwirowywać probówkę przez 3 minuty.</li>
	<li>Odrzuć górną warstwę wodną. Do probówki dodać 600 μl 100% metanolu. Wirować probówkę przez 3 minuty, a następnie wyrzucić roztwór.</li>
	<li>Granulki białkowe przemyć 600 μL 100% metanolu. Odrzuć roztwór i wysusz na powietrzu osad białka.</li>
	<li>Zawiesić granulki białka w 600 μl buforu wytrawiającego (12 mM deoksycholanu sodu (SDC)/12 mM lauroilosarkozynianu sodu (SLS) w 100 mM Tris-HCl, pH 8,5). Sondować probówkę Sonicing, aż zawiesina zostanie zhomogenizowana.</li>
	<li>Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu BCA i dostosuj stężenie do 4 μg/μl za pomocą buforu wytrawiającego. Przenieś 100 μl lizatu (400 μg białek) do nowej probówki.</li>
	<li>Dodać 292 μl 50 mM wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB) i 8 μl Lys-C (2,5 jednostki/ml) do probówki. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Do probówki dodać 100 μl 50 mM TEAB z 8 μg trypsyny. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.</li>
	<li>Do probówki dodać 25 μl 10% kwasu trifluorooctowego (TFA). Wirować i odwirowywać probówkę przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do kondycjonowanej kolumny odsalającej w celu odsalania. Wysuszyć eluat za pomocą koncentratora wirówki próżniowej. 
	UWAGA: Aktywuj żywicę za pomocą 1 ml metanolu, a następnie 1 ml 0,1% TFA w 80% acetonitrylu (ACN). Przepłukać rozpuszczalnik organiczny co najmniej 3 ml 0,1% TFA w 5% ACN. Załadować zakwaszone próbki peptydów przygotowane w kroku 1.16 do kolumny, a następnie przemyć kolumnę co najmniej 3 ml 0,1% TFA w 5% ACN. W przypadku próbek o wysokim stężeniu soli może być konieczne więcej płukania. Eluować fosfopeptydy za pomocą 1 ml 0,1% TFA w 80% ACN.</li>
</ol>
2. Etykietowanie Tandem Mass Tag (TMT)
<ol>
	<li>Zawiesić wysuszone peptydy w 100 μl 200 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) o pH 8,5.</li>
	<li>Rozpuścić odczynnik TMT dla każdego kanału (0,8 mg) w 40 μl bezwodnego ACN. Wiruj probówkę z odczynnikiem TMT przez 5 minut i odkręć ją.</li>
	<li>Przenieść 40 μl TMT do probówki z próbką i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: W tym eksperymencie kanały od 126 do 128 zostały oznaczone trzema biologicznymi powtórzeniami roślin bez leczenia mannitolem, a kanały od 129 do 131 zostały oznaczone trzema biologicznymi powtórzeniami roślin poddanych działaniu mannitolu.</li>
	<li>Dodać 8 μl 5% hydroksyloaminy i inkubować przez 15 min.</li>
	<li>Wymieszaj 6 próbek w probówce o pojemności 5 ml i dodaj 14 μl 10% TFA.</li>
	<li>Dodać 3,876 μl 0,1% TFA do probówki. Wiruj i zakręć w dół.</li>
	<li>Przenieść roztwór do kondycjonowanej kolumny odsalającej w celu odsalania. Wysuszyć eluat za pomocą parownika.</li>
</ol>
3. Przygotowanie końcówki etapu IMAC
<ol>
	<li>Użyj igły 16 G, aby przebić krążek fryty polipropylenowej. 
	UWAGA: Trzymaj nóż prostopadle do powierzchni dysku i przekręć nóż kilka razy, aby upewnić się, że krążek jest całkowicie wycięty. Umieść dysk na szalce Petriego do przechowywania. Umieścić igłę w końcówce pipety o pojemności 200 μl i wepchnąć frytę do końcówki za pomocą tłoka.</li>
	<li>Delikatnie wciśnij frytę w końcówkę za pomocą tłoka, aby zakryć koniec końcówki.
	<ol>
		<li>Umieść krążek fryty w końcówkach z takim samym naciskiem, co zapewnia lepszą odtwarzalność. Powtarzalność produkcji końcówek etapowych jest ważna dla stałego ciśnienia wstecznego, które wpływa na czas etapów wirówki i odtwarzalność między powtórzeniami technicznymi.</li>
		<li>Jeśli końcówki stolika wykazują wysokie ciśnienie wsteczne podczas etapu kondycjonowania, wyrzuć końcówki, aby uniknąć potencjalnego zatkania końcówki podczas ładowania próbek. Możliwe, że dysk został zbyt mocno wciśnięty na miejsce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwróć kolumnę wirową Ni-NTA i umieść na probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Za pomocą tłoka delikatnie dociśnij frytkę kulek Ni-NTA i wepchnij koraliki do tuby. 
	UWAGA: Upewnij się, że fryta jest delikatnie dociskana, aby uniknąć potencjalnej utraty lub adsorpcji kulek na kolumnie wirowej.</li>
</ol>
4. Przygotowanie końcówki etapu Hp-RP
<ol>
	<li>Przygotuj końcówkę stolika Hp-RP zgodnie z opisem dla końcówki stolika IMAC za pomocą dysku C8. 
	UWAGA: Nie przykładaj dużej siły do dysku, ponieważ może to spowodować gęsto upakowaną frytę i zwiększyć ciśnienie wsteczne końcówki stage. Wszystkie etapy wirowania odbywają się przy 1 000 x g przez 5 minut w kroku 4.</li>
	<li>Zawiesić 1 mg kulek C18 w 100 μl 100% metanolu i przepuścić roztwór kulek przez końcówkę.</li>
	<li>Dodać 20 μl buforu 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2, pH 10,0) do końcówki stolika i przepuścić bufor 8 przez końcówkę przez odwirowanie.</li>
	<li>Dodać 20 μl buforu A (200 mM NH4HCO2) do końcówki stolika i przepuścić bufor A przez końcówkę przez odwirowanie. 
	UWAGA: Zrównoważ wirówkę podczas użytkowania i upewnij się, że końcówka Hp-RP stage nie jest całkowicie wysuszona.</li>
</ol>
5. Przygotowanie adaptera spin
<ol>
	<li>Użyj pęsety z ostrym końcem, aby przebić otwór na środku wieczka probówki o pojemności 1.5 ml.</li>
	<li>Włóż końcówkę stolika IMAC lub końcówkę stolika Hp-RP do otworu adaptera wirowego. 
	UWAGA: Upewnij się, że stage końcówka nie znajduje się blisko dna adaptera wirowania.</li>
</ol>
6. Wzbogacanie fosfopeptydem za pomocą końcówki etapu IMAC
<ol>
	<li>Zawiesić kulki Ni-NTA 10 mg z 400 μl buforu ładującego (6% kwas octowy (AA), pH 3,0) i załadować cały roztwór kulek do każdej końcówki. Przepuścić roztwór przez końcówkę przez odwirowanie. 
	UWAGA: Wszystkie etapy wirowania odbywają się przy 200 x g przez 3 minuty w kroku 6 oprócz kroku 6.8.</li>
	<li>Załaduj 100 μl 50 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), aby usunąć jony niklu z końcówki stopnia IMAC i przepuścić roztwór przez końcówkę przez odwirowanie.</li>
	<li>Załadować 100 μl buforu ładującego do końcówki stolika i przepuścić roztwór przez końcówkę przez odwirowanie.</li>
	<li>Załaduj 100 μl 50 mM FeCl3 w 6% AA do końcówki stolika i przepuść roztwór przez końcówkę przez odwirowanie. Jony Fe3+ będą chelatować do końcówki etapu IMAC.</li>
	<li>Załadować 100 μl buforu ładującego, aby kondycjonować końcówkę stolika i przepuścić roztwór przez końcówkę przez odwirowanie.</li>
	<li>Załadować 100 μl buforu ładującego peptydami próbki przygotowanymi w kroku 2.7 do końcówki stolika i przepuścić roztwór przez końcówkę przez odwirowanie. 
	UWAGA: Weź nową probówkę jako adapter wirowy, aby zebrać przepływ próbki i przechowuj przepływ w zamrażarce do przyszłej analizy.</li>
	<li>Załaduj 100 μl buforu płuczącego (4,5% AA i 25% ACN) do końcówki stolika i przepuść roztwór przez końcówkę przez odwirowanie.</li>
	<li>Wykonaj drugie mycie z buforem załadowczym. Załaduj 100 μl buforu ładującego do końcówki stolika i przepuść roztwór przez końcówkę za pomocą wirówki o pojemności 1000 × g przez 3 min. 
	UWAGA: Upewnij się, że bufor myjący został zastąpiony buforem ładującym w końcówce stage, aby wyeliminować utratę fosfopeptydów podczas etapu elucji. Zrównoważyć końcówkę stopnia IMAC przed elucją, aby upewnić się, że stężenie ACN jest poniżej 5%.</li>
	<li>Przytnij końcówkę stage IMAC z przodu nożyczkami i umieść przyciętą końcówkę stage IMAC wewnątrz końcówki Hp-RP. Upewnij się, że dwie warstwy stage końcówki nie dotykają pokrywy wirówki.</li>
</ol>
7. Frakcjonowanie fosfopeptydem za pomocą końcówki stopnia Hp-RP C18
<ol>
	<li>Dodać 100 μl buforu elucyjnego (200 mM fosforanu amonu (NH4H2PO4)) do przyciętej końcówki stopnia IMAC i przepuścić roztwór przez dwie warstwy końcówek etapu przez odwirowanie. 
	UWAGA: Jeśli roztwór nie przejdzie przez końcówkę stage, zwiększ prędkość wirowania. Wszystkie etapy wirowania odbywają się przy 1 000 x g przez 5 minut w kroku 7. Wszystkie Hp-RP są wymienione w tabeli 1.</li>
	<li>Wyrzuć końcówkę stopnia IMAC za pomocą pęsety i dodaj 20 μl buforu A do końcówki stolika Hp-RP i przepuść bufor przez końcówkę przez odwirowanie. 
	UWAGA: Upewnij się, że cały bufor elucji przechodzi przez IMAC stage końcówka przed jego wyrzuceniem.</li>
	<li>Dodać 20 μl buforu 1 do elucji frakcji 1 i zebrać eluat w nowej probówce przez odwirowanie. Powtórz proces z 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8, aby zebrać każdą frakcję w nowej probówce. Wysuszyć końcowy eluat każdej frakcji za pomocą koncentratora próżniowego. 
	UWAGA: Przygotować świeże frakcjonacyjne. Weź 8 nowych probówek jako adapter wirowania każdej frakcji. Zbierz eluat każdej frakcji w innym adapterze wirowania. Fosfopeptydy nie są stabilne w warunkach zasadowych, dlatego eluaty należy natychmiast wysuszyć koncentratorem lub zakwasić 10% TFA.</li>
</ol>
8. Analiza LC-MS/MS i analiza danych
<ol>
	<li>Dodać 5 μl 0,1% kwasu mrówkowego (FA) i przeanalizować próbkę za pomocą spektrometru mas.</li>
	<li>Uruchom 90-minutowy gradient z buforem B 6-30% (80% ACN i 0,1% FA) dla każdej frakcji.</li>
	<li>Fragmentuj 10 pierwszych znakowanych peptydów za pomocą dysocjacji o wysokiej energii zderzenia (HCD). Przeszukaj bazę danych, aby zidentyfikować miejsca fosforylacji.</li>
	<li>Załaduj surowe pliki do oprogramowania MaxQuant, nazwij eksperymenty i ustaw ułamki oraz PTM. 
	UWAGA: Samouczek oprogramowania MaxQuant można znaleźć pod adresem https://www.maxquant.org/.</li>
	<li>Wybierz jon reporterowy MS2 w typie przebiegu LC-MS/MS i 6plex TMT jako etykiety izobaryczne. Włącz filtrowanie według funkcji PIF i ustaw minimalny PIF na 0,75.</li>
	<li>Wybierz Acetyl (Białko N-term), Utlenianie (M) i Fosfo (STY) do panelu zmiennych modyfikacji. Wybierz Carbamidomethyl (C) jako stałe modyfikacje.</li>
	<li>Ustaw tryb trawienia jako specyficzny, wybierz Trypsynę/P jako enzym trawienny i dwa pominięte rozszczepienia.</li>
	<li>Ustaw współczynnik fałszywych wykryć PSM (FDR) i białko FDR na 0,01. Ustaw minimalny wynik dla zmodyfikowanych peptydów na 40.</li>
	<li>Dodaj bazę danych Arabidopsis thaliana do panelu plików fasta i uruchom przeszukiwanie bazy danych.</li>
	<li>Załaduj plik txt stron Phospho (STY) do oprogramowania Perseus po zakończeniu wyszukiwania. 
	UWAGA: Szczegółowe samouczki dotyczące oprogramowania Perseus można znaleźć na stronie https://www.maxquant.org/perseus/.</li>
	<li>Odfiltruj miejsca odwróconej fosforylacji. Odfiltruj niezlokalizowane miejsca fosforylacji, używając prawdopodobieństwa lokalizacji 75% jako punktu odcięcia.</li>
	<li>Wykorzystaj intensywności miejsc fosforylacji do analizy statystycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cellular+and+molecular+responses+to+high+salinity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Plant+Physiology+Plant+Molecualr+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant cellular and molecular responses to high salinity.</a> Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).</li>
<li>Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+tolerance+in+plants%3A+Changes+at+the+protein+level%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level.</a> Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).</li>
<li>Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+networks+in+the+abscisic+acid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Enzymes%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway.</a> Enzymes. 35, 27-56 (2014).</li>
<li>Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+and+challenges+in+plant+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+proteome-wide+targets+of+protein+kinases+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).</li>
<li>Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+decuple+mutant+reveals+the+importance+of+SnRK2+kinases+in+osmotic+stress+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+identifies+SnRK2+protein+kinase+substrates+and+reveals+the+effectors+of+abscisic+acid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).</li>
<li>Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+nine+sucrose+nonfermenting+1-related+protein+kinases+2+activated+by+hyperosmotic+and+saline+stresses+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).</li>
<li>Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+technologies+and+applications+in+plant+biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 430(2015).</li>
<li>Hsu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+plant+phosphoproteomics+workflow+and+its+application+to+Tomato+signaling+in+response+to+cold+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress.</a> Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068(2018).</li>
<li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+metal+affinity+chromatography+revisited%3A+pH%2Facid+control+toward+high+selectivity+in+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).</li>
<li>Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Ruprecht, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+and+reproducible+phosphopeptide+enrichment+using+iron+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography+%28Fe-IMAC%29+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns.</a> Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).</li>
<li>Sugiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+enrichment+by+aliphatic+hydroxy+acid-modified+metal+oxide+chromatography+for+nano-LC-MS%2FMS+in+proteomics+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications.</a> Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).</li>
<li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+phosphoproteomic+enrichment+through+complementary+metal-directed+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+identification+of+phosphopeptides+from+putative+basophilic+kinase+substrates+using+Ti+%28IV%29+based+IMAC+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment.</a> Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+high-pH+reverse+phase+stageTip+for+sensitive+small-scale+membrane+proteomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling.</a> Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+the+TOR+Kinase+and+ABA+receptor+balances+plant+growth+and+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response.</a> Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+RAF-SnRK2+kinase+cascade+mediates+early+osmotic+stress+signaling+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants.</a> Nature Communications. 11 (1), 613(2020).</li>
<li>Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+phosphoproteomics+reveals+in+vivo+insulin+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).</li>
<li>Bekker-Jensen, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+shotgun+strategy+for+the+rapid+generation+of+comprehensive+human+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes.</a> Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).</li>
<li>Possemato, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+phosphoproteomic+profiling+using+titanium+dioxide+and+immunoaffinity+enrichments+reveals+complementary+phosphorylation+events%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events.</a> Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).</li>
<li>Hogrebe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+common+quantification+strategies+for+large-scale+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics.</a> Nature Communications. 9 (1), 1045(2018).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+of+Arabidopsis+Highly+ABA-Induced1+identifies+AT-Hook-Like10+phosphorylation+required+for+stress+growth+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).</li>
<li>Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((through+signaling+between+wheat+and+the+fungal+pathogen+Septoria+tritici+revealed+by+proteomics+and+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics.</a> Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).</li>
<li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+Mass+Tag+labeling+facilitates+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+hydrophilic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides.</a> Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Zakres dynamiczny i złożoność proteomu roślinnego i fosfoproteomu są nadal czynnikiem ograniczającym głębokość analiz fosfoproteomicznych. Pomimo możliwości jednoetapowej analizy LC-MS/MS w celu zidentyfikowania 10 000 miejsc fosforylacji21,22, pokrycie całego fosfoproteomu rośliny jest nadal ograniczone. W związku z tym w profilowaniu globalnego obrazu sieci sygnalizacyjnych roślin w odpowiedzi na stres środowiskowy wymagany jest fosfoproteomiczny przepływ pracy...

Wysokie zasolenie, niska temperatura i susza powodują stresy osmotyczne, które są głównym czynnikiem środowiskowym wpływającym na produktywność roślin1,2. Fosforylacja białek jest jedną z najważniejszych modyfikacji potranslacyjnych pośredniczących w percepcji i transdukcji sygnału w odpowiedzi roślin na stres osmotyczny3,4,5. Kinaza białkowa 2 związana z SNF1 (SnRK2s) bierze udział w sygnalizacji stresu osmotycznego6. Dziewięciu z dziesięciu członków rodziny SnRK2 wykazuje znaczącą aktywację w odpowiedzi na stres osmotyczny7,8. Mutant snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mający mutacje we wszystkich dziesięciu SnRK2 wykazywał nadwrażliwość na stres osmotyczny. W mutancie snrk2-dec indukowana stresem osmotycznym akumulacja 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3), biosynteza kwasu abscysynowego (ABA) i ekspresja genów są silnie zmniejszone, co podkreśla istotną rolę SnRK2 w odpowiedziach na stres osmotyczny6. Jednak nadal nie jest jasne, w jaki sposób kinazy SnRK2s regulują te procesy biologiczne. Profilowanie zmian fosfoproteomicznych w odpowiedzi na stres osmotyczny jest skutecznym sposobem na wypełnienie tej luki i nakreślenie mechanizmów obronnych wyzwalanych przez stres osmotyczny u roślin.
Spektrometria mas (MS) to potężna technika mapowania fosfoproteomu roślin9. Charakterystyka fosfoproteomiki roślin pozostaje jednak wyzwaniem ze względu na dynamiczny zakres proteomu roślinnego i złożoność lizatu roślinnego4. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy uniwersalny przepływ pracy fosfoproteomicznego roślin, który eliminuje niepożądane zakłócenia, takie jak pigmenty fotosyntetyczne i metabolity wtórne, oraz umożliwia głębokie pokrycie fosfoproteomu roślinnego10. Kilka metod wzbogacania fosfopeptydów, takich jak chromatografia powinowactwa do immobilizowanych jonów metali (IMAC) i chromatografia tlenków metali (MOC), zostało opracowanych w celu wzbogacania fosfopeptydów przed analizą MS11,12,13,14,15,16. Kwaśne niefosfopeptydy współoczyszczające z fosfopeptydami są głównymi zakłóceniami w wykrywaniu fosfopeptydów. Wcześniej ustandaryzowaliśmy wartość pH i stężenie kwasów organicznych w buforze ładującym IMAC, aby wyeliminować wiązanie niefosfopeptydów, aby uzyskać ponad 90% swoistość wzbogacania z pominięciem etapu wstępnego frakcjonowania11.
Utrata próbki w wieloetapowym procesie wzbogacania i frakcjonowania fosfopeptydu ogranicza czułość identyfikacji fosfopeptydu i głębokość pokrycia fosfoproteomicznego. Końcówki do ekstrakcji typu stop-and-go (końcówki etapowe) to końcówki do pipet, które zawierają małe krążki do zaślepienia końca końcówki, które można połączyć z chromatografią do frakcjonowania peptydów i czyszczenia17. Utratę próbki podczas procedury końcówki etapu można zminimalizować, unikając przenoszenia próbki między probówkami. Z powodzeniem wdrożyliśmy końcówkę etapową w Ga3+-IMAC i Fe3+-IMAC w celu oddzielenia mało obfitych peptydów wielokrotnych fosforylowanych od pojedynczo fosforylowanych peptydów, co poprawiło głębokość ludzkiego fosfoproteomu15. Ponadto zastosowanie końcówki fazy odwróconej o wysokim pH (Hp-RP) wykazało szerszy zakres ludzkiego proteomu błonowego w porównaniu z chromatografią silnej wymiany kationowej (SCX) i silnej wymiany anionowej (SAX)18. Dlatego integracja technik etapów IMAC i Hp-RP może zwiększyć pokrycie fosfoproteomem roślin dzięki prostocie, wysokiej specyficzności i wysokiej przepustowości. Wykazaliśmy, że ta strategia zidentyfikowała ponad 20 000 miejsc fosforylacji z siewek rzodkiewnika, co stanowi zwiększoną głębokość fosfoproteomu roślinnego19.
Tutaj przedstawiamy protokół fosfoproteomiki oparty na końcówce etapu do profilowania fosfoproteomicznego u Arabidopsis. Ten przepływ pracy został zastosowany do zbadania zaburzeń fosfoproteomicznych siewek zmutowanych siewek typu dzikiego i snrk2-dec w odpowiedzi na stres osmotyczny. Analiza fosfoproteomiczna ujawniła miejsca fosforylacji zaangażowane w aktywację kinazy i wczesną sygnalizację stresu osmotycznego. Analiza porównawcza danych dotyczących fosfoproteomu typu dzikiego i zmutowanego snrk2-dec doprowadziła do odkrycia kaskady kinazy Raf-podobnej (RAF)-SnRK2, która odgrywa kluczową rolę w sygnalizacji stresu osmore u roślin wysokich.

<table><tbody><tr><td>Probówka 1,5 ml</td><td>eppendorf</td><td>22431081</td><td>Protein LoBind, 1,5 mL, PCR czysta, bezbarwna, 100 probówek</td></tr><tr><td>200 &mikro; L końcówka do pipety</td><td>Gilson</td><td>F1739311</td><td></td></tr><tr><td>2-chloroacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0267</td><td></td></tr><tr><td>kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5438080100</td><td></td></tr><tr><td>acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>wodorotlenek amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>fosforan amonu monbasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216003</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>igła z zakończeniem</td><td>Hamilton</td><td>90516</td><td>Piasta Kel-F (KF), typ punktowy 3, rozstaw 16</td></tr><tr><td>koralików C18-AQ</td><td>Dr. Maisch</td><td>ReproSil-Pur-C18-AQ 5 &micro; m</td><td></td></tr><tr><td>C8 Empore disk</td><td>3 M</td><td>2214</td><td>47 mm</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td> Oprogramowanie <td></td><td></td> do analizy danych Sigma-Aldrich CX1058 <td></td></tr><tr><td></td><td>Perseus 1.6.2.1</td><td>Kwas https://maxquant.net/perseus/</td> etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-Aldrich mrówkowy <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> kwas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>Fryty</td><td>Agilent</td><td>12131024</td><td>do wkładów SPE</td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50933</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1153334000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek żelaza (III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-orbitrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Spektrometr masowy Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTQ-Orbitrap Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>nano LC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Easy-nLC 1000</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA kolumna wirowa</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroilsarkozyna sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>tłok</td><td>Hamilton</td><td>1122-01</td><td>Zespół tłoka N, RN, LT, LTN dla modelu 1702 (25 &mu; l)</td></tr> <tr><td>wyszukiwarka</td><td></td><td>MaxQuant 1.5.4.1</td><td>https://www.maxquant.org</td></tr><tr><td>SEP-PAK Kartridż 50 mg</td><td>Wody</td><td>WAT054960</td><td></td></tr><tr><td>deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD121P</td><td></td></tr><tr><td>TMT 6-plex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>Bufor wodorowęglanu trietyloamonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91707</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosfiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek trizmy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

fosfoproteomiczna strategia profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u rzodkiewnika

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Fosforylacja białek jest kluczowa dla regulacji aktywności enzymu i ekspresji genów w warunkach osmotycznych. Fosfoproteomika oparta na spektrometrii mas (MS) zmieniła sposób badania transdukcji sygnału roślinnego. Jednak wymóg dużej ilości materiałów wyjściowych i wydłużony czas pomiaru MS w celu osiągnięcia głębokości pokrycia był czynnikiem ograniczającym dla wysokoprzepustowych badań globalnych zmian fosfoproteomicznych w roślinach. Aby poprawić czułość i przepustowość fosfoproteomiki roślin, opracowaliśmy podejście fosfoproteomiki oparte na końcówce ekstrakcji stop and go w połączeniu z etykietowaniem Tandem Mass Tag (TMT) w celu szybkiej i kompleksowej analizy zaburzeń fosforylacji roślin w odpowiedzi na stres osmotyczny. Wykorzystując prostotę i wysoką przepustowość techniki końcówek etapowych, cała procedura trwa około godziny przy użyciu dwóch końcówek do zakończenia etapów wzbogacania fosforeptydów, frakcjonowania i czyszczenia próbki, co sugeruje łatwość użycia i wysoką skuteczność tego podejścia. Takie podejście nie tylko zapewnia dogłębną analizę fosfoproteomiki roślin (identyfikacja > 11 000 fosfopeptydów), ale także wykazuje lepszą skuteczność separacji (< 5% nakładania się) między sąsiednimi frakcjami. Co więcej, multipleksowanie osiągnięto przy użyciu znakowania TMT w celu ilościowego określenia zmian fosfoproteomicznych u zmutowanych roślin typu dzikiego i snrk2. Podejście to zostało z powodzeniem wykorzystane do ujawnienia zdarzeń fosforylacji kinaz podobnych do Raf w odpowiedzi na stres osmotyczny, co rzuca światło na zrozumienie wczesnej sygnalizacji osmotycznej u roślin lądowych.

Aby zademonstrować wydajność tego schematu analizy, wykorzystano końcówki typu stage tip IMAC sprzężone z frakcjonowaniem za pomocą końcówek typu stage tip Hp-RP w celu pomiaru zmian fosfoproteomicznych w siewkach typu dzikiego oraz mutantów snrk2-dec z zastosowaniem lub bez zastosowania traktowania mannitolem przez 30 minut. Każda próbka była analizowana w trzech powtórzeniach biologicznych, a schemat eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1. Przetrawione peptydy (40 µg) z każdej...

Przedstawione tutaj jest podejście fosfoproteomiczne, a mianowicie fosfoproteomiczne oparte na końcówce do ekstrakcji stop and go, które zapewnia wysoką przepustowość i głębokie pokrycie fosfoproteomu Arabidopsis. Podejście to wyznacza przegląd sygnalizacji stresu osmotycznego u Arabidopsis.

Fosfoproteomiczna strategia profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u rzodkiewnika

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Strategia ta jest potężnym narzędziem do kompleksowego badania globalnych zmian fosfoproteomów roślinnych w odpowiedzi na stresy biotyczne lub abiotyczne. Technika ta pozwala na dogłębną analizę fosfoproteomiczną w łatwy w użyciu i wysoce przepustowy sposób. Do przygotowania końcówki etapu IMAC użyj igły o końcu w rozmiarze 16, aby przebić krążek fryty propylenowej i użyj tłoka, aby delikatnie wcisnąć frytę w końcówkę.Następnie umieść odwróconą kolumnę wirową niklowo-NTA na 1.5-mililitrowej rurce i za pomocą tłoka delikatnie wciśnij frytę z kulek niklu-NTA do probówki. W celu wzbogacenia fosfopeptydów, za pomocą końcówki etapowej IMAC, dodaj 400 mikrolitrów buforu ładującego do kulek niklu-NTA i załaduj całą objętość roztworu kulek do jednej końcówki stopnia IMAC. Przepuść roztwór przez końcówkę przez odwirowanie i załaduj 100 mikrolitrów 50-milimolowego EDTA, aby usunąć jony niklu z końcówki przez odwirowanie.Potraktuj końcówkę 100 mikrolitrami buforu ładującego przez odwirowanie. Następnie potraktuj końcówkę 100 mikrolitrami 50-milimolowego chlorku żelaza w 6% kwasie octowym przez odwirowanie. Kondycjonować scenę za pomocą 100 mikrolitrów buforu ładującego przez odwirowanie.Następnie odwirowanie ze 100 mikrolitrami buforu ładującego, uzupełnionego peptydami próbki. Po odwirowaniu przepłukać końcówkę dwa razy buforem myjącym o pojemności 100 mikrolitrów na pranie, a następnie jednym płukaniem 100 mikrolitrami buforu ładującego. Pod koniec wirowania użyj nożyczek, aby przyciąć przód końcówki stage IMAC i umieść przyciętą końcówkę w końcówce o wysokim pH i odwróconej fazie.Do frakcjonowania fosfopeptydowego, przy użyciu końcówki etapu C18 o odwróconej fazie o wysokim pH, przepuścić 100 mikrolitrów buforu elucyjnego przez obie warstwy końcówek etapu, przez odwirowanie. Pod koniec wirowania użyj pęsety, aby wyrzucić końcówkę stopnia IMAC i dodaj 20 mikrolitrów buforu A do końcówki stopnia odwróconej fazy o wysokim pH. Po odwirowaniu dodać 20 mikrolitrów buforu 1 do zebranej frakcji i zebrać eluat w nowej probówce przez odwirowanie.Powtarzaj proces z od 2 do 8, aż wszystkie osiem frakcji zostanie zebranych. Następnie wysuszyć końcowy eluat każdej frakcji w koncentratorze próżniowym. W tej reprezentatywnej analizie zidentyfikowano łącznie 8, 107 i 7 248 fosfopeptydów odpowiednio z próbek zmutowanych typu dzikiego i SnRK2, co ilustruje skuteczność przepływu pracy w zapewnianiu dogłębnego pokrycia w celu nakreślenia globalnego obrazu transdukcji sygnału u Arabidopsis.Porównanie liczby zidentyfikowanych fosfopeptydów w ośmiu frakcjach wykazało obecność kilku fosfopeptydów w pierwszych dwóch frakcjach, ale większość fosfopeptydów była równomiernie rozłożona między ostatnimi sześcioma frakcjami. Sugerowanie takiego podejścia daje możliwość oddzielenia złożonych fosfopeptydów od fosfoproteomu roślinnego. Ocena nakładania się fosfopeptydów między dwiema sąsiadującymi frakcjami wykazała, że mniej niż 5% nakładających się fosfopeptydów wystąpiło w sąsiednich frakcjach.Po leczeniu mannitolem w próbce typu dzikiego zwiększono 433 miejsca fosforylacji. Podczas gdy 380 miejsc zostało zwiększonych w próbce mutanta SnRK2 decuple. Spośród nich 312 fosfozytów wykazało indukcję w typie dzikim, ale nie w roślinach z mutacją SnRK2.Ważne jest, aby użyć tej samej siły nacisku do załadowania krążka fryty do końcówek, aby zapewnić lepszą powtarzalność analizy. Wkrótce chromatografia kationowymienna może być stosowana, jako alternatywna metoda, do frakcjonowania wzbogaconych fosfopeptydów, w celu uzyskania szerszego pokrycia fosfoproteomu roślinnego.

phosphoproteomic-strategy-for-profiling-osmotic-stress-signaling

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych 15N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Opisujemy tutaj protokół oczyszczania i charakterystyki kompleksów białek roślinnych. Pokazujemy to, immunoprecypitując pojedyncze białko w kompleksie, dzięki czemu możemy zidentyfikować jego modyfikacje potranslacyjne i oddziałujących partnerów.

Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Znajomość składu soku łyka, jak również mechanizmu jego ładowania i transportu na duże odległości jest niezbędna do zrozumienia długodystansowej sygnalizacji w rozwoju roślin i odpowiedzi na stres/patogen oraz transportu asymilacyjnego. Niniejszy manuskrypt opisuje pobieranie wysięków łyka przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA.

Pobieranie i analiza wysięków łyka Arabidopsis przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA

Ukierunkowana degradacja białek stanowi główny mechanizm regulujący funkcjonowanie komórki. Zachodzi za pośrednictwem konserwatywnego szlaku ubikwityna-proteasom, który przyłącza łańcuchy poliubikwityny do białka docelowego, które następnie służą jako molekularne "znaczniki" dla proteasomu 26S. W tym miejscu opisujemy prosty i niezawodny bezkomórkowy test proteasomalnej degradacji białek.

Oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin

Tutaj opisujemy nową metodę badania importu białek do izolowanych chloroplastów pod wpływem stresu. Metoda jest szybka i prosta i może być stosowana do badania konsekwencji różnych warunków stresowych dla importu białka chloroplastowego i odpowiednich mechanizmów regulacyjnych.

Analiza importu białek do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Prosty, wszechstronny i tani system hydroponiczny in vitro został pomyślnie zoptymalizowany, umożliwiając eksperymenty na dużą skalę w sterylnych warunkach. System ten ułatwia stosowanie substancji chemicznych w roztworze i ich efektywne wchłanianie przez korzenie do badań molekularnych, biochemicznych i fizjologicznych.

Elastyczny, niedrogi system hydroponiczny do oceny reakcji roślin na małe cząsteczki w sterylnych warunkach

Ten artykuł opisuje dwie metody ilościowego określania reakcji obronnych u Arabidopsis thaliana po ekspozycji na elicytory immunologiczne: przejściowy wybuch oksydacyjny i zahamowanie wzrostu siewki.

Testy wybuchu oksydacyjnego wywołanego wzorcem i zahamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana

Zewnątrzkomórkowa systemowa sygnalizacja wapniowa wywołana glutaminianem jest kluczowa dla indukcji reakcji obronnych roślin na mechaniczne zranienia i ataki roślinożerców u roślin. W artykule opisano metodę wizualizacji przestrzennej i czasowej dynamiki obu tych czynników przy użyciu roślin Arabidopsis thaliana wykazujących ekspresję wrażliwych na wapń i glutaminian biosensorów fluorescencyjnych.

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Ten artykuł opisuje dwie metody fenotypowania bez użycia peelingów naskórka do scharakteryzowania genów kontrolujących rozwój aparatów szparkowych. Pierwsza metoda pokazuje, jak analizować fenotyp aparatów szparkowych przy użyciu naskórka roślinnego barwionego błękitem O-toluidyny. Druga metoda opisuje, w jaki sposób identyfikować ligandy szparkowe i monitorować ich aktywność biologiczną.

Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Przedstawiony tutaj protokół obejmuje profilowanie polisomalne w celu wyizolowania translatomów, mRNA związanych z rybosomami, do niepolisomalnych i polisomalnych RNA z Arabidopsis poprzez wirowanie w gradicynacji gęstości sacharozy. Metoda ta demonstruje wydajność translacji Arabidopsis poddanego stresowi cieplnemu.

Test wydajności translacji przy użyciu profili polisomowych pod wpływem stresu cieplnego

Poznaj fosfoproteomiczną strategię profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u Arabidopsis. Ta metoda umożliwia kompleksową analizę fosfoproteomu roślinnego z wysoką przepustowością.

Fosfoproteomiczna strategia profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u rzodkiewnika

Przeglądaj więcej filmów