Fosfoproteomiczna strategia profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u rzodkiewnika

Przedstawione tutaj jest podejście fosfoproteomiczne, a mianowicie fosfoproteomiczne oparte na końcówce do ekstrakcji stop and go, które zapewnia wysoką przepustowość i głębokie pokrycie fosfoproteomu Arabidopsis. Podejście to wyznacza przegląd sygnalizacji stresu osmotycznego u Arabidopsis.

Strategia ta jest potężnym narzędziem do kompleksowego badania globalnych zmian fosfoproteomów roślinnych w odpowiedzi na stresy biotyczne lub abiotyczne. Technika ta pozwala na dogłębną analizę fosfoproteomiczną w łatwy w użyciu i wysoce przepustowy sposób. Do przygotowania końcówki etapu IMAC użyj igły o końcu w rozmiarze 16, aby przebić krążek fryty propylenowej i użyj tłoka, aby delikatnie wcisnąć frytę w końcówkę.

Następnie umieść odwróconą kolumnę wirową niklowo-NTA na 1.5-mililitrowej rurce i za pomocą tłoka delikatnie wciśnij frytę z kulek niklu-NTA do probówki. W celu wzbogacenia fosfopeptydów, za pomocą końcówki etapowej IMAC, dodaj 400 mikrolitrów buforu ładującego do kulek niklu-NTA i załaduj całą objętość roztworu kulek do jednej końcówki stopnia IMAC. Przepuść roztwór przez końcówkę przez odwirowanie i załaduj 100 mikrolitrów 50-milimolowego EDTA, aby usunąć jony niklu z końcówki przez odwirowanie.

Potraktuj końcówkę 100 mikrolitrami buforu ładującego przez odwirowanie. Następnie potraktuj końcówkę 100 mikrolitrami 50-milimolowego chlorku żelaza w 6% kwasie octowym przez odwirowanie. Kondycjonować scenę za pomocą 100 mikrolitrów buforu ładującego przez odwirowanie.

Następnie odwirowanie ze 100 mikrolitrami buforu ładującego, uzupełnionego peptydami próbki. Po odwirowaniu przepłukać końcówkę dwa razy buforem myjącym o pojemności 100 mikrolitrów na pranie, a następnie jednym płukaniem 100 mikrolitrami buforu ładującego. Pod koniec wirowania użyj nożyczek, aby przyciąć przód końcówki stage IMAC i umieść przyciętą końcówkę w końcówce o wysokim pH i odwróconej fazie.

Do frakcjonowania fosfopeptydowego, przy użyciu końcówki etapu C18 o odwróconej fazie o wysokim pH, przepuścić 100 mikrolitrów buforu elucyjnego przez obie warstwy końcówek etapu, przez odwirowanie. Pod koniec wirowania użyj pęsety, aby wyrzucić końcówkę stopnia IMAC i dodaj 20 mikrolitrów buforu A do końcówki stopnia odwróconej fazy o wysokim pH. Po odwirowaniu dodać 20 mikrolitrów buforu 1 do zebranej frakcji i zebrać eluat w nowej probówce przez odwirowanie.

Powtarzaj proces z od 2 do 8, aż wszystkie osiem frakcji zostanie zebranych. Następnie wysuszyć końcowy eluat każdej frakcji w koncentratorze próżniowym. W tej reprezentatywnej analizie zidentyfikowano łącznie 8, 107 i 7 248 fosfopeptydów odpowiednio z próbek zmutowanych typu dzikiego i SnRK2, co ilustruje skuteczność przepływu pracy w zapewnianiu dogłębnego pokrycia w celu nakreślenia globalnego obrazu transdukcji sygnału u Arabidopsis.

Porównanie liczby zidentyfikowanych fosfopeptydów w ośmiu frakcjach wykazało obecność kilku fosfopeptydów w pierwszych dwóch frakcjach, ale większość fosfopeptydów była równomiernie rozłożona między ostatnimi sześcioma frakcjami. Sugerowanie takiego podejścia daje możliwość oddzielenia złożonych fosfopeptydów od fosfoproteomu roślinnego. Ocena nakładania się fosfopeptydów między dwiema sąsiadującymi frakcjami wykazała, że mniej niż 5% nakładających się fosfopeptydów wystąpiło w sąsiednich frakcjach.

Po leczeniu mannitolem w próbce typu dzikiego zwiększono 433 miejsca fosforylacji. Podczas gdy 380 miejsc zostało zwiększonych w próbce mutanta SnRK2 decuple. Spośród nich 312 fosfozytów wykazało indukcję w typie dzikim, ale nie w roślinach z mutacją SnRK2

Ważne jest, aby użyć tej samej siły nacisku do załadowania krążka fryty do końcówek, aby zapewnić lepszą powtarzalność analizy. Wkrótce chromatografia kationowymienna może być stosowana, jako alternatywna metoda, do frakcjonowania wzbogaconych fosfopeptydów, w celu uzyskania szerszego pokrycia fosfoproteomu roślinnego.