Name: Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Poznaj metodę przygotowania przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej do oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę sztywności podłoża i składu białkowego w sposób ekonomiczny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Uniwersytetu w Cincinnati. Autorzy dziękują również Ronowi Flennikenowi z laboratorium Advanced Materials Characterization Uniwersytetu w Cincinnati za wsparcie.

Autorzy nie zgłosili potencjalnego konfliktu interesów.

SC mogą wspomagać regenerację nerwów ze względu na ich transformację fenotypową i potencjał regeneracyjny po uszkodzeniu nerwu. Jednak sposób, w jaki sygnały ECM regulują tę zdolność regeneracyjną, pozostaje w większości niejasny, co może utrudniać nie tylko rozwój biomateriałów, które mają na celu promowanie regeneracji nerwów, ale także zrozumienie mechanizmów związanych z regeneracją nerwów. Aby rozpocząć badanie tej wzajemnej zależności, stworzono substraty do hodowli komórkowych, w których można kontrolować sygnały ...

Urazy obwodowego układu nerwowego (PNS) pozostają głównym wyzwaniem klinicznym w opiece zdrowotnej, pogarszając jakość życia pacjentów i wywierając znaczący wpływ poprzez mnogość czynników społeczno-ekonomicznych1,2. Komórki Schwanna (SC), jako główne komórki glejowe w PNS, dostarczają niezbędnych wskazówek molekularnych i fizycznych do indukowania regeneracji PNS i pomagają w powrocie do sprawności funkcjonalnej w urazach z krótkimi przerwami. Wynika to z niezwykłej zdolności SC do dedyferencjacji do fenotypu komórki "naprawczej" z fenotypu mielinizacyjnego lub Remak3. Naprawczy SC jest charakterystycznym fenotypem komórkowym pod kilkoma względami. Po urazie SC zwiększają tempo proliferacji, ponownie wchodząc w cykl komórkowy i rozpoczynając ekspresję kilku czynników transkrypcyjnych, aby ułatwić ponowne unerwienie. Czynniki te, takie jak c-Jun i p75 NTR, są regulowane w górę, podczas gdy mielinizujące markery SC, takie jak zasadowe białko mieliny (MBP), są regulowane w dół4,5. Ponadto SC zmieniają morfologię, wydłużając się i ustawiając się względem siebie, tworząc pasma Büngnera w poprzek miejsca urazu6. Zapewnia to fizyczny mechanizm naprowadzania aksonów na rozciąganie się do właściwego dystalnego celu7. Jednak pomimo zdolności SC do wspomagania regeneracji nerwów w urazach z krótkimi przerwami, wyniki powrotu do sprawności pozostają słabe w przypadku poważnych urazów. Jest to częściowo spowodowane utratą wskazówek naprowadzających macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), a także niezdolnością SC do utrzymania fenotypu regeneracyjnego przez długi czas8.
Proces regeneracji i regeneracji nerwów jest ściśle związany ze stanem blaszki podstawy po urazie. Blaszka podstawna to warstwa ECM wokół nerwu, która ułatwia prowadzenie i zapewnia wskazówki związane z ECM dla aksonów i SC w przypadkach, gdy pozostaje nienaruszona po urazie9. Stan ECM i jego zdolność do dostarczania sygnałów związanych z matrycą do komórek jest niezwykle ważny i był wcześniej badany w wielu różnych kontekstach10,11,12,13,14. Na przykład wykazano, że sztywność ECM może kierować funkcjami komórki, takimi jak proliferacja i różnicowanie11,15,16. Skład ECM może również prowadzić do wyraźnej odpowiedzi komórkowej i regulować zachowania komórek, takie jak migracja i różnicowanie poprzez wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe17,18. Co więcej, morfologia komórek, w tym obszar rozprzestrzeniania się i wydłużanie komórek, odgrywają główną rolę w regulacji funkcji i mogą być regulowane przez wskazówki związane z ECM19,20. Wiele wcześniejszych badań koncentrowało się na komórkach macierzystych różnicujących się w określone linie, jednak SC mają podobną zdolność do zmiany fenotypu z homeostatycznego, dorosłego SC w zdrowym nerwie, na naprawczy SC zdolny do wydzielania białek i czynników wzrostu podczas przebudowy ECM po uszkodzeniu nerwu5,21. Dlatego szczególnie ważne jest zidentyfikowanie mechanizmów leżących u podstaw związku między wrodzoną zdolnością regeneracyjną SC a sygnałami związanymi z ECM, aby wgląd ostatecznie wykorzystał tę zdolność do regeneracji nerwów.
Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy szczegółową metodologię produkcji substratu do hodowli komórkowych, gdzie sztywność mechaniczna i typ liganda mogą być łatwo dostrojone w fizjologicznie odpowiednich zakresach. Polidimetylosiloksan (PDMS) został wybrany jako substrat ze względu na jego wysoce przestrajalną mechanikę w porównaniu z żelem poliakrylamidowym, gdzie maksymalny moduł Younga wynosi około 12 kPa, w przeciwieństwie do PDMS na poziomie około 1000 kPa22,23,24. Jest to korzystne dla wykonywanej pracy, ponieważ ostatnie badania wykazały, że moduł Younga nerwu kulszowego królika może przekraczać 50 kPa podczas rozwoju, co sugeruje, że zakres sztywności nerwów w PNS jest szerszy niż wcześniej badano. Różne białka są zdolne do adsorpcji na podłożach PDMS w celu analizy kombinatorycznej regulacji mechaniki i ligandów na zachowanie SC. Pozwala to na badanie wielu sygnałów mikrośrodowiskowych obecnych w procesie regeneracji PNS i porównanie wysokiego stopnia przestrajania z pracą, skupiając się wyłącznie na sztywności podłoża25. Co więcej, te zmodyfikowane substraty do hodowli komórkowych są kompatybilne z wieloma metodami analizy ilościowej, takimi jak immunohistochemia, western blot i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (q-PCR).
Ta platforma hodowli komórkowych jest wysoce odpowiednia do analizy ścieżek mechanistycznych, ze względu na wysoki poziom indywidualnej przestrajania każdego sygnału związanego z ECM. Ponadto, popularne metody mikrowzorcowania komórek, w tym druk mikrokontaktowy, mogą być osiągnięte na podłożach, aby umożliwić kontrolowaną adhezję komórkową w celu analizy kształtu komórki w odniesieniu do innych wskazówek związanych z ECM24. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ substraty o wzorze liniowym, które sprzyjają wydłużaniu się populacji komórek, dostarczają narzędzia do naśladowania i badania wydłużonych i regeneracyjnych SC w pasmach Büngnera podczas regeneracji nerwów. Co więcej, morfologia komórkowa jest silnym regulatorem wielu funkcji komórek i może potencjalnie wprowadzać mylące wyniki eksperymentalne, jeśli nie jest kontrolowana26,27. Obecnie wiele uwagi poświęca się mechanizmom rządzącym fenotypem regeneracyjnym SC regulowanym przez ECM cues28,29,30. Jest to niezbędne, aby zapewnić wgląd w projektowanie biomateriałów, które mogą być stosowane jako kanały prowadzenia nerwów w celu pomocy w regeneracji nerwów PNS. Te szczegółowe protokoły mogą ostatecznie zostać wykorzystane jako potencjalne narzędzie do rozszyfrowania mechanizmów funkcji SC i innych typów komórek, regulowanych przez sygnały związane z ECM.

<table><tbody><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej (BSA), koniugat Texas Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A23017</td><td>Barwienie BSA w celu pokazania mikrowzorów</td></tr><tr><td>Przeciwciało IgG przeciw myszy, technologia</td><td>sygnalizacji komórkowej</td> przeciwciał sprzężona z HRP <td>Przeciwciało 7076S</td><td>używane do analizy western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężonych z HRP</td><td></td><td>Przeciwciało 7074S</td><td>używane do analizy</td></tr> <tr><td>western blotBrdU</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B23151</td><td>Odczynnik stosowany do pomiaru proliferacji komórek</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne BrdU sprzężone z Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B35130</td><td>Służy do wizualizacji BrdU w testach proliferacji komórek</td></tr><tr><td>Kolagen I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10483-01</td><td>Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Maszyna do badania siły ściskającej</td><td>TestResources</td><td></td><td>Przyrząd do ilościowego określania właściwości mechanicznych polimerów</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych uzupełniająca</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33010-018</td><td>Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Fluorescencja mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td><td>Mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Halt Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78440</td><td>Inhibitor proteazy i fosfatazy</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017015</td><td>Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe z DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36971</td><td>Mocowanie szkiełek nakrywkowych i barwienie jąder</td></tr><tr><td>Mysz C-Jun pierwotne przeciwciało Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>711202</td><td>Pierwszorzędowe przeciwciało do wizualizacji białka c-Jun</td></tr><tr><td>Mysz &beta-aktyna pierwotne przeciwciało</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3700S</td><td>Kontrola ładowania dla eksperymentów western blot</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych uzupełniająca</td></tr><tr><td>Photoresist SU 2010</td><td>KAYAKU</td><td>SU8-2010</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-2443</td><td>Blokuj niespecyficzne wiązanie białek</td></tr><tr><td>Pierwotne przeciwciało królika c-Jun</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9165S Przeciwciało</td><td>pierwszorzędowe do wizualizacji białka c-Jun</td></tr><tr><td>Podstawowe przeciwciało podstawowe białka mieliny królika</td><td>Abcam</td><td>ab40390</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe do wizualizacji MBP</td></tr><tr><td>Królik p75NTR</td><td>przeciwciało pierwotne Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>8238S Przeciwciało</td><td>pierwotne do wizualizacji p75NTR</td></tr><tr><td>Falloidyna rodaminowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R415</td><td>Wizualizacja cytoszkieletu komórkowego</td></tr><tr><td>Bufor RIPA</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td>Bufor do lizy komórek</td></tr><tr><td>RT4-D6P2T Linia komórkowa Schwanna</td><td>ATCC</td><td>CRL-2768</td><td>Linia komórkowa stosowana w </td></tr><tr><td>eksperymenty SYLGARD 184 PDMS baza i utwardzacz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036</td><td>Przestrajalny polimer stosowany do powlekania szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15090-046</td><td>Odczynnik do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>UV-Środek czyszczący do ozonu</td><td>Novascan</td><td></td><td>Zwiększ hydrofilność PDMS</td></tr><tr><td>Versene (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td>Dysocjacja komórek Odczynnik</td></tr></tbody></table>

przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek schwanna

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Urazowe urazy obwodowego układu nerwowego (PNS) obecnie nie mają odpowiednich metod leczenia, aby odzyskać pełną sprawność. Komórki Schwanna (SC), jako główne komórki glejowe PNS, odgrywają istotną rolę w promowaniu regeneracji PNS poprzez dedyferencjację do fenotypu komórki regeneracyjnej po urazie. Jednak stan odróżnicowania SC jest trudny do utrzymania przez okres potrzebny do regeneracji i ma na niego wpływ zmiany w otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). W związku z tym niezbędne jest określenie złożonej zależności między SC a różnymi ECM w celu uzyskania wskazówek dotyczących potencjału regeneracyjnego SC. Aby rozwiązać ten problem, stworzono strategię, w ramach której różne białka ECM zostały zaadsorbowane na przestrajalnym podłożu z polidimetylosiloksanu (PDMS), który zapewnił platformę, na której można modulować sztywność i skład białka. SC wysiewano na przestrajalnych podłożach i mierzono krytyczne funkcje komórkowe reprezentujące dynamikę fenotypu SC. Aby zilustrować wzajemne oddziaływanie między ekspresją białka SC a morfologią komórkową, wykorzystano różne gęstości wysiewu SC oprócz indywidualnych drukowanych wzorów komórkowych w mikrokontakcie i scharakteryzowano je za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i western blot. Wyniki pokazały, że komórki o mniejszym obszarze rozprzestrzeniania się i większym stopniu wydłużenia komórkowego promowały wyższe poziomy regeneracyjnych markerów fenotypowych SC. Metodologia ta nie tylko zaczyna odkrywać istotny związek między ECM a funkcją komórkową SC, ale także dostarcza wskazówek dla przyszłej optymalizacji biomateriałów w naprawie nerwów obwodowych.

Aby przeanalizować i ilościowo określić wpływ sztywności podłoża oraz składu białkowego na fenotyp SC, opracowano regulowane podłoże do hodowli komórkowej z PDMS (Rycina 1A). W celu wyznaczenia modułu Younga (E) podłoża przeprowadzono testy ściskania polimeru przy różnych stosunkach bazy do czynnika sieciującego (Rycina 1B). Uzyskany zakres wartości modułu odpowiada fizjologicznie istotnym warunkom podłoża. Po przygotowaniu podłoży hodowano komórki SC i analizow...

Ta metodologia ma na celu zilustrowanie mechanizmów, za pomocą których sygnały macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność substratu, skład białka i morfologia komórki, regulują fenotyp komórek Schwanna (SC).

Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Protokół ten zapewnia platformę do hodowli komórkowych, na której właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność, skład białka i morfologia komórki, mogą być precyzyjnie kontrolowane w opłacalny i łatwy sposób. Metoda jest opłacalna i nie wymaga specjalnego szkolenia ani zaplecza. Jest również kompatybilny z wieloma metodami kwantyfikacji komórek, takimi jak barwienie immunofluorescencyjne i western blot.Technika ta zapewnia mechanistyczne zrozumienie biologii komórki Schwanna. Dzięki dodatkowemu wglądowi w projektowanie biomateriałów do regeneracji układu nerwowego, można go zastosować do dowolnych komórek zależnych od zakotwiczenia. Najtrudniejszą częścią tego protokołu jest druk mikrokontaktowy.Przed rozpoczęciem protokołu drukowanie mikrokontaktowe na podłożu za pomocą fluorescencyjnego znacznika białka w celu wizualnej weryfikacji końcowego wydruku do wzoru. Rozpocząć od energicznego wymieszania elastomeru bazowego PDMS i utwardzaczy za pomocą końcówki pipety, aż pęcherzyki zostaną jednorodnie rozproszone w mieszaninie. Następnie usuń pęcherzyki za pomocą suszenia próżniowego.Umieść kroplę wysuszonej mieszaniny PDMS na kwadratowym lub okrągłym szkiełku nakrywkowym i obracaj szkiełko nakrywkowe na powlekarce wirowej z prędkością 2 500 obr./min przez 30 sekund. Inkubować szkiełko nakrywkowe w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin lub w temperaturze pokojowej przez noc. Aby przygotować podłoże z mikrowzorem, umieść wzorzystą płytkę krzemową w okrągłej szalce Petriego o średnicy 150 milimetrów i wysokości 15 milimetrów i wlej odgazowaną PDMS na płytkę.Zestaliliśmy PDMS w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez noc. Pozwól PDMS ostygnąć do temperatury pokojowej. Następnie za pomocą skalpela chirurgicznego wytnij stemple o wymiarach 30 na 30 milimetrów kwadratowych zawierających odpowiednie wzory, uważając, aby nie uszkodzić płytki silikonowej.Wysterylizuj stemple PDMS i strojone szkiełka nakrywkowe, zanurzając je w 70% etanolu na 30 minut. Aby potwierdzić skuteczność mikrowzoru, należy osuszyć powierzchnię stempli PDMS za pomocą przefiltrowanego strumienia powietrza i odpipetować 15 mikrogramów na mililitr roztworu BSA, aby pokryć całą wzorzystą stronę stempla. Inkubować stempele z roztworem BSA przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję białek, a następnie wysuszyć stempelki na powietrzu, aby usunąć roztwór BSA.Użyj przefiltrowanego strumienia powietrza, aby wysuszyć powierzchnię strojonych szkiełek nakrywkowych. Doprowadź wzorzystą stronę stempla do konforemnego kontaktu z regulowanym szkiełkiem nakrywkowym, aby umożliwić adsorpcję BSA na powierzchni szkiełka nakrywkowego, a następnie delikatnie dociśnij stempel do szkiełka nakrywkowego przez pięć minut. Zbadaj mikrowzór za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem FITC.Aby wydrukować obszary kleju komórkowego, a nie wzory fluorescencyjne, zastąp lamininę białkiem BSA. Usunąć stemple ze szkiełek nakrywkowych i przenieść je do wysterylizowanej płytki sześciodołkowej. Dodaj dwa mililitry 0,2% roztworu Pluronic F-127 do każdej studzienki, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego i inkubować płytkę przez godzinę w temperaturze pokojowej.Odessać roztwór F-127 i przemyć szkiełka nakrywkowe pięć razy PBS, raz pożywką do hodowli komórkowych, a następnie wysiać komórki Schwanna o gęstości wysiewu 1000 komórek na centymetr kwadratowy. 45 minut po wysiewie komórek usunąć pożywkę do hodowli komórkowej i dwukrotnie przemyć szkiełka nakrywkowe PBS, aby zapobiec przyleganiu wielu komórek do tego samego wzoru. Utrzymuj komórki w pożądanym środowisku hodowli komórkowej przez 48 godzin przed oznaczaniem ilościowym.Aby stworzyć substraty do hodowli komórkowych z wzorem liniowym do badania wyrównanych komórek, wykonaj stemple zgodnie ze wskazówkami rękopisu i przytnij je do pożądanych wymiarów. Przygotuj dwie szalki Petriego pokryte dostrojoną powierzchnią PDMS, jak opisano wcześniej, i wykonaj drukowanie mikrokontaktowe, aby wydrukować obszary kleju komórkowego z linim wzorem na jednej z szalek. Po usunięciu stempli napełnij szalkę Petriego czterema mililitrami 0,2% roztworu Pluronic F-127 i inkubuj ją przez godzinę.Opłucz trzykrotnie każdą stronę stempla PDMS 70% etanolem i osusz powietrzem. Obróć stemple PDMS i wydrukuj niewzorzysty obszar kleju komórkowego na drugiej szalce Petriego, jak opisano wcześniej. Po inkubacji szalek z roztworem F-127 usunąć roztwór i umyć naczynia trzy razy PBS i raz świeżą pożywką do hodowli komórkowych.Następnie posiewaj komórki na szalkach i utrzymuj je w pożądanych warunkach przez 48 godzin przed przygotowaniem lizatów. Aby przygotować lizaty, przemyj komórki lodowatym PBS przez dwie minuty, a następnie dodaj 80 mikrolitrów roztworu RIPA, przygotowanego zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, na każdy obszar kleju komórek i inkubuj komórki na bloku lodu przez 25 minut. Zeskrob komórki Schwanna za pomocą skrobaka do komórek przez pięć minut i zbierz lizat do oznakowanej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.Odwirowywać lizat przez 15 minut w temperaturze 12 tysięcy razy G i czterech stopniach Celsjusza. Zebrać supernatant i przenieść go do czystej probówki do mikrowirówki. Podłoża pokryte lamininą skutkowały wyższym tempem proliferacji w porównaniu z podłożami pokrytymi kolagenem i fibronektyną.Komórki Schwanna na podłożach z powłoką lamininową i różnymi modułami wykazały, że stosunkowo bardziej miękkie substraty zmniejszały tempo proliferacji komórek. Komórki analizowano również pod kątem ekspresji białek. Ekspresja czynnika transkrypcyjnego c-Jun była regulowana w górę, gdy substraty stawały się bardziej miękkie.Na najmiększych podłożach został jednak znacznie obniżony. Na sztywnych podłożach podłoża pokryte kolagenem powodowały najwyższą ekspresję c-Jun, ponieważ podłoża stawały się bardziej miękkie, laminina wykazywała najwyższy poziom c-Jun. Komórki zostały następnie wybarwione rodaminą-falloidyną, aby zbadać rolę rozprzestrzeniania się komórek i obszaru w ekspresji c-Jun.Kiedy linie kleju komórkowego zostały utworzone na substratach hodowli komórkowych, współczynnik proporcji jądrowych komórek wysianych na substracie wzorcowym wzrósł w porównaniu z komórkami na podłożach bez wzoru. Ekspresja zarówno receptora neurotrofiny c-Jun, jak i p75 była regulowana w górę w gęstych komórkach o mniejszym obszarze rozprzestrzeniania się. Komórki o wzorze liniowym powodowały również wyższą ekspresję zarówno c-Jun, jak i p75 NTR w porównaniu z komórkami bez wzorca.Stworzono mikrokontaktowe geometrie kleju do komórek drukowanych, aby precyzyjnie kontrolować obszar rozprzestrzeniania się i wydłużanie komórek, jednocześnie eliminując interakcje między komórkami. Zwiększenie proporcji komórkowej spowodowało wzrost wydłużenia jądra. Ekspresja c-Jun była regulowana w górę zarówno przez wydłużenie komórek, jak i zahamowanie rozprzestrzeniania się komórek.Barwienie immunofluorescencyjne zarówno jąder, jak i aktyny potwierdziło, że obszar rozprzestrzeniania się komórek i wydłużenie były precyzyjnie kontrolowane za pomocą tej metody mikromodelowania. Technika ta utorowała drogę do wykorzystania naszych przestrajalnych substratów jako metody mechanistycznej analizy biologii komórek Schwanna i sygnalizacji w kontekście regeneracji i raka.

preparation-tunable-extracellular-matrix-microenvironments-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Demonstrujemy sposób wycinania i hodowli eksplantów zwoju statoakustycznego w dniu E4 oraz rdzenia kręgowego w dniu E6 zarodka kurczaka. Eksplanty są hodowane w warunkach bezsurowiczych w trójwymiarowych żelach kolagenowych przez 24 godziny. Reaktywność neurytów jest badana przy użyciu pożywki uzupełnionej o czynniki wzrostu oraz koralików pokrytych białkiem.

Disekcja i hodowla eksplantów zrazustatoakustycznego i rdzenia kręgowego kurczaka w żelach kolagenowych do testów wzrostu neurytów

Opisano kombinatoryczną metodę przesiewania funkcjonalnego służącą do pogłębienia wiedzy na temat wpływu składu molekularnego mikrośrodowisk na funkcje komórkowe. Metoda ta wykorzystuje istniejące technologie oparte na mikromacierzych do generowania macierzy zdefiniowanych kombinatorycznych mikrośrodowisk, które umożliwiają adhezję komórek oraz analizę funkcjonalną.

Wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (MEArrays)

Ten film demonstruje metodę uzyskiwania komórek podobnych do komórek Schwanna z multipotencjalnych komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC). Początkowo BMSC poddawane są leczeniu hipoksji, a następnie ukierunkowanemu różnicowaniu do neuronalnych komórek progenitorowych. Następnie stosuje się określone pożywki i warunki hodowli, aby indukować transformację tych komórek progenitorowych w komórki podobne do komórek Schwanna.

Generowanie komórek podobnych do komórek Schwanna z komórek zrębu szpiku kostnego

Wideo pokazuje współtworzenie neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z komórkami Schwanna. Neurony DRG są najpierw hodowane na wstępnie rozciągniętej błonie w celu wyrównania wzrostu aksonów. Następnie wprowadzane są komórki Schwanna, które przyczepiają się do aksonów, izolując je i promując przeżycie i funkcję komórek nerwowych.

Wspólna hodowla komórek Schwanna z neuronami DRG na wstępnie rozciągniętej błonie

Film opisuje przygotowanie mikrowzoru podłoża do badania specyfikacji fenotypu komórki. Powlekany białkiem stempel PDMS z mikrowzorem służy do przenoszenia mikrowzoru na szkiełku nakrywkowym pokrytym PDMS. Szkiełko nakrywkowe jest następnie traktowane środkiem powierzchniowo czynnym, aby utrudnić przyleganie komórek do niepożądanych powierzchni. Komórki są następnie dodawane, aby osiąść we wzorze i inkubowane w celu dalszej analizy.

Przygotowanie mikrowzoru podłoża do badania fenotypów komórek Schwanna

Tutaj opisujemy test migracji komórek Schwanna (SC), w którym SC są w stanie rozwijać się wzdłuż rozszerzających się aksonów.

Analiza rozwoju mysich komórek Schwanna wzdłuż rosnących aksonów

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Ten protokół opisuje izolację neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) izolowanych od szczurów oraz hodowlę neuronów DRG na statycznym, wstępnie rozciągniętym systemie hodowli komórek w celu poprawy wyrównania aksonów, z późniejszą kokulturą komórek Schwanna (SC) w celu promowania mielinizacji.

Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego

Komórki zrębu szpiku (MSC) o potencjale neuronalnym istnieją w szpiku kostnym. Nasz protokół wzbogaca tę populację komórek poprzez wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, a następnie kieruje je do dojrzałych komórek Schwanna.

Wstępne kondycjonowanie hipoksyjne komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku jako źródło do wytwarzania dojrzałych komórek Schwanna

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Tutaj udostępniamy metodę analizy zachowania rosnących aksonów w matrycach 3D, naśladując ich naturalny rozwój.

Generowanie hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu i zachowania aksonów podczas rozwoju układu nerwowego

Poznaj metodę przygotowania przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej do oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę sztywności podłoża i składu białkowego w sposób ekonomiczny.

Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

Przeglądaj więcej filmów