Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

Protokół ten zapewnia platformę do hodowli komórkowych, na której właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność, skład białka i morfologia komórki, mogą być precyzyjnie kontrolowane w opłacalny i łatwy sposób. Metoda jest opłacalna i nie wymaga specjalnego szkolenia ani zaplecza. Jest również kompatybilny z wieloma metodami kwantyfikacji komórek, takimi jak barwienie immunofluorescencyjne i western blot.

Technika ta zapewnia mechanistyczne zrozumienie biologii komórki Schwanna. Dzięki dodatkowemu wglądowi w projektowanie biomateriałów do regeneracji układu nerwowego, można go zastosować do dowolnych komórek zależnych od zakotwiczenia. Najtrudniejszą częścią tego protokołu jest druk mikrokontaktowy.

Przed rozpoczęciem protokołu drukowanie mikrokontaktowe na podłożu za pomocą fluorescencyjnego znacznika białka w celu wizualnej weryfikacji końcowego wydruku do wzoru. Rozpocząć od energicznego wymieszania elastomeru bazowego PDMS i utwardzaczy za pomocą końcówki pipety, aż pęcherzyki zostaną jednorodnie rozproszone w mieszaninie. Następnie usuń pęcherzyki za pomocą suszenia próżniowego.

Umieść kroplę wysuszonej mieszaniny PDMS na kwadratowym lub okrągłym szkiełku nakrywkowym i obracaj szkiełko nakrywkowe na powlekarce wirowej z prędkością 2 500 obr./min przez 30 sekund. Inkubować szkiełko nakrywkowe w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin lub w temperaturze pokojowej przez noc. Aby przygotować podłoże z mikrowzorem, umieść wzorzystą płytkę krzemową w okrągłej szalce Petriego o średnicy 150 milimetrów i wysokości 15 milimetrów i wlej odgazowaną PDMS na płytkę.

Zestaliliśmy PDMS w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez noc. Pozwól PDMS ostygnąć do temperatury pokojowej. Następnie za pomocą skalpela chirurgicznego wytnij stemple o wymiarach 30 na 30 milimetrów kwadratowych zawierających odpowiednie wzory, uważając, aby nie uszkodzić płytki silikonowej.

Wysterylizuj stemple PDMS i strojone szkiełka nakrywkowe, zanurzając je w 70% etanolu na 30 minut. Aby potwierdzić skuteczność mikrowzoru, należy osuszyć powierzchnię stempli PDMS za pomocą przefiltrowanego strumienia powietrza i odpipetować 15 mikrogramów na mililitr roztworu BSA, aby pokryć całą wzorzystą stronę stempla. Inkubować stempele z roztworem BSA przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję białek, a następnie wysuszyć stempelki na powietrzu, aby usunąć roztwór BSA.

Użyj przefiltrowanego strumienia powietrza, aby wysuszyć powierzchnię strojonych szkiełek nakrywkowych. Doprowadź wzorzystą stronę stempla do konforemnego kontaktu z regulowanym szkiełkiem nakrywkowym, aby umożliwić adsorpcję BSA na powierzchni szkiełka nakrywkowego, a następnie delikatnie dociśnij stempel do szkiełka nakrywkowego przez pięć minut. Zbadaj mikrowzór za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem FITC.

Aby wydrukować obszary kleju komórkowego, a nie wzory fluorescencyjne, zastąp lamininę białkiem BSA. Usunąć stemple ze szkiełek nakrywkowych i przenieść je do wysterylizowanej płytki sześciodołkowej. Dodaj dwa mililitry 0,2% roztworu Pluronic F-127 do każdej studzienki, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego i inkubować płytkę przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Odessać roztwór F-127 i przemyć szkiełka nakrywkowe pięć razy PBS, raz pożywką do hodowli komórkowych, a następnie wysiać komórki Schwanna o gęstości wysiewu 1000 komórek na centymetr kwadratowy. 45 minut po wysiewie komórek usunąć pożywkę do hodowli komórkowej i dwukrotnie przemyć szkiełka nakrywkowe PBS, aby zapobiec przyleganiu wielu komórek do tego samego wzoru. Utrzymuj komórki w pożądanym środowisku hodowli komórkowej przez 48 godzin przed oznaczaniem ilościowym.

Aby stworzyć substraty do hodowli komórkowych z wzorem liniowym do badania wyrównanych komórek, wykonaj stemple zgodnie ze wskazówkami rękopisu i przytnij je do pożądanych wymiarów. Przygotuj dwie szalki Petriego pokryte dostrojoną powierzchnią PDMS, jak opisano wcześniej, i wykonaj drukowanie mikrokontaktowe, aby wydrukować obszary kleju komórkowego z linim wzorem na jednej z szalek. Po usunięciu stempli napełnij szalkę Petriego czterema mililitrami 0,2% roztworu Pluronic F-127 i inkubuj ją przez godzinę.

Opłucz trzykrotnie każdą stronę stempla PDMS 70% etanolem i osusz powietrzem. Obróć stemple PDMS i wydrukuj niewzorzysty obszar kleju komórkowego na drugiej szalce Petriego, jak opisano wcześniej. Po inkubacji szalek z roztworem F-127 usunąć roztwór i umyć naczynia trzy razy PBS i raz świeżą pożywką do hodowli komórkowych.

Następnie posiewaj komórki na szalkach i utrzymuj je w pożądanych warunkach przez 48 godzin przed przygotowaniem lizatów. Aby przygotować lizaty, przemyj komórki lodowatym PBS przez dwie minuty, a następnie dodaj 80 mikrolitrów roztworu RIPA, przygotowanego zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, na każdy obszar kleju komórek i inkubuj komórki na bloku lodu przez 25 minut. Zeskrob komórki Schwanna za pomocą skrobaka do komórek przez pięć minut i zbierz lizat do oznakowanej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Odwirowywać lizat przez 15 minut w temperaturze 12 tysięcy razy G i czterech stopniach Celsjusza. Zebrać supernatant i przenieść go do czystej probówki do mikrowirówki. Podłoża pokryte lamininą skutkowały wyższym tempem proliferacji w porównaniu z podłożami pokrytymi kolagenem i fibronektyną.

Komórki Schwanna na podłożach z powłoką lamininową i różnymi modułami wykazały, że stosunkowo bardziej miękkie substraty zmniejszały tempo proliferacji komórek. Komórki analizowano również pod kątem ekspresji białek. Ekspresja czynnika transkrypcyjnego c-Jun była regulowana w górę, gdy substraty stawały się bardziej miękkie.

Na najmiększych podłożach został jednak znacznie obniżony. Na sztywnych podłożach podłoża pokryte kolagenem powodowały najwyższą ekspresję c-Jun, ponieważ podłoża stawały się bardziej miękkie, laminina wykazywała najwyższy poziom c-Jun. Komórki zostały następnie wybarwione rodaminą-falloidyną, aby zbadać rolę rozprzestrzeniania się komórek i obszaru w ekspresji c-Jun.

Kiedy linie kleju komórkowego zostały utworzone na substratach hodowli komórkowych, współczynnik proporcji jądrowych komórek wysianych na substracie wzorcowym wzrósł w porównaniu z komórkami na podłożach bez wzoru. Ekspresja zarówno receptora neurotrofiny c-Jun, jak i p75 była regulowana w górę w gęstych komórkach o mniejszym obszarze rozprzestrzeniania się. Komórki o wzorze liniowym powodowały również wyższą ekspresję zarówno c-Jun, jak i p75 NTR w porównaniu z komórkami bez wzorca.

Stworzono mikrokontaktowe geometrie kleju do komórek drukowanych, aby precyzyjnie kontrolować obszar rozprzestrzeniania się i wydłużanie komórek, jednocześnie eliminując interakcje między komórkami. Zwiększenie proporcji komórkowej spowodowało wzrost wydłużenia jądra. Ekspresja c-Jun była regulowana w górę zarówno przez wydłużenie komórek, jak i zahamowanie rozprzestrzeniania się komórek.

Barwienie immunofluorescencyjne zarówno jąder, jak i aktyny potwierdziło, że obszar rozprzestrzeniania się komórek i wydłużenie były precyzyjnie kontrolowane za pomocą tej metody mikromodelowania. Technika ta utorowała drogę do wykorzystania naszych przestrajalnych substratów jako metody mechanistycznej analizy biologii komórek Schwanna i sygnalizacji w kontekście regeneracji i raka.