Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae

Starzenie się charakteryzuje się zależnym od czasu pogorszeniem wielu procesów komórkowych, co ostatecznie zwiększa prawdopodobieństwo śmierci organizmu. W obrębie populacji proces ten jest zmienny i może na niego wpływać szereg czynników genetycznych i środowiskowych. Jedną z najlepiej zbadanych i zrozumianych zmiennych jest rola diety na długość życia.

Ograniczenie dietetyczne to interwencja, która ostatecznie opóźnia początek starzenia się i zmian związanych ze starzeniem się. Zwiększa to długość życia organizmu i długość jego zdrowia, czyli czas, w którym organizm prowadzi normalne, zdrowe życie. Nasza obecna wiedza doprowadziła do zidentyfikowania odrębnego zestawu zmian komórkowych, które zostały nazwane cechami charakterystycznymi starzenia się, takich jak między innymi akumulacja mutacji, rozregulowanie telomerów, utrata homeostazy białek, problemy z oddychaniem i reaktywne formy tlenu.

Wiele z tych informacji pochodzi z badań, w których wykorzystuje się wiele różnych organizmów modelowych. Przeprowadzono wiele badań genetycznych, które zidentyfikowały geny, które zarówno skracają, jak i wydłużają życie. Należą do nich badania nad pączkującymi drożdżami Saccharomyces cerevisiae, na których skupia się ta metodologia, a także badania nad bardziej złożonymi organizmami wielokomórkowymi, takimi jak C. elegans i system mysi.

Spośród nich jednak pączkujące drożdże są szczególnie podatne na badania nad starzeniem się ze względu na ich krótką naturalną żywotność i szereg podejść genetycznych, które mogą rozwikłać złożone relacje genetyczne, co czyni je doskonałym systemem do funkcjonalnej analizy genetyki starzenia. Drożdże można wykorzystać do badania kilku różnych aspektów starzenia. Skupimy się na chronologicznej długości życia, czyli czasie, w którym komórka może przetrwać.

Celem tej pracy jest przedstawienie prostego podejścia genetycznego do wykonania badania przesiewowego supresorowego nadekspresji. Wykorzystamy tło genetyczne, które skutkuje nienormalnie skróconą chronologiczną długością życia. Wykorzystamy ukierunkowane podejście do identyfikacji genów, które mogą uratować lub stłumić fenotyp skróconej długości życia, próbując zidentyfikować geny, które przywracają normalną długość życia.

Pierwszym tłem genetycznym jest szczep drożdży z niedoborem autofagii. Autofagia, co luźno tłumaczy się jako samozjadanie, to wewnątrzkomórkowy system degradacji polegający na dostarczaniu produktów cytozolowych, takich jak białka i organelle, do lizosomu. Pomaga to w utrzymaniu homeostazy komórkowej poprzez eliminację uszkodzonych białek, a także tych, które przeżyły swoje życie.

Będziemy pracować ze zmutowanym szczepem, który ma delecję genu ATG1. ATG1 koduje białko kinazę białkowo-serynowo-treoninowo-białkową, która jest niezbędna do tworzenia pęcherzyków i autofagii w szlaku celowania cytoplazma-wakuola. Mutant zerowy ATG1 ma fenotyp o nienormalnie krótkiej chronologicznej długości życia.

W tym starzejącym się laboratorium zaprojektujemy i przetestujemy czynniki genetyczne, które mogą uratować lub stłumić nienormalnie skróconą długość życia charakterystyczną dla mutanta zerowego ATG1. Można to jednak rozszerzyć również na inne krótkotrwałe tła genetyczne. Pierwszym krokiem w tym procesie jest zidentyfikowanie genu, który jest związany z wydłużeniem życia.

Skupimy się w szczególności na genach, które wydłużają chronologiczną długość życia, gdy są nadmiernie eksprymowane. Aby to zrobić, zamierzamy wykorzystać publicznie dostępne dane, które są dostępne w bazie danych genomu drożdży. Idziemy tutaj.

Szukaj według fenotypu. Mniej więcej w połowie drogi zobaczymy, że możemy wybrać chronologiczną długość życia. Aby znaleźć geny, które wydłużają życie, można zobaczyć bogactwo dostępnych danych, które zawierają geny związane z tym konkretnym fenotypem.

Dzisiaj będziemy badać SIR2, deacetylazę lizyny histonowej, która jest związana z wydłużoną chronologiczną żywotnością, gdy jest nadmiernie eksprymowana. Pierwszą rzeczą, którą zrobimy, to uzyskamy dostęp do sekwencji DNA dla regionu kodującego, a także regionów regulatorowych, które otaczają obie strony tego genu. Weźmiemy 400 par zasad w górę i w dół, aby mieć pewność, że obejmiemy wszystkie regiony regulacyjne.

Wykorzystamy tę sekwencję DNA do zaprojektowania starterów PCR, które pozwolą nam sklonować ten gen do naszego wektora plazmidowego. Użyjemy PCR do amplifikacji naszego genu i sklonowania go do wektora pRS315. W tym celu zaprojektujemy startery, które zawierają miejsca trawienia restrykcyjnego, które zawierają miejsca restrykcyjne HindIII i SacII.

Jak widać, plazmid zawiera oba miejsca restrykcyjne, HindIII i SacII, które ułatwią nam klonowanie. Startery PCR należy zaprojektować tak, aby zawierały około 21 lub 22 nukleotydów o sekwencji komplementarnej do regionu, który chcesz amplifikować. Oprócz sekwencji, dodasz do pięciu głównych z nich odpowiednie miejsce restrykcyjne, albo HindIII na starterze do przodu, albo SacII na starterze odwrotnym, pokazane tutaj odpowiednio na czerwono i fioletowo, a dalej przed tym, dodaj kilka nukleotydów, które pozwolą enzymowi restrykcyjnemu związać się i stworzyć miejsce trawienia restrykcyjnego z wyższą wydajnością.

Wyhoduj pięciomililitrową kulturę drożdży typu dzikiego przez noc do fazy po logarytmie w wzbogaconych podłożach, takich jak YPAD. Zbierz genomowe DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu, który jest specyficzny dla izolacji genomu grzybów. Ważne jest, aby zestaw był specyficzny dla drożdży, ponieważ mają one bardzo sztywną i twardą ścianę komórkową do penetracji.

Leczenie zymoliazą jest skuteczne w trawieniu ściany komórkowej i znacznie zwiększa wydajność genomu. Użyj spektrofotometru, aby określić ilość i jakość DNA. Aby wyprodukować amplikon nadający się do klonowania, konieczne jest użycie polimerazy PCR o wysokiej wierności, aby uniknąć mutacji podczas procesu amplifikacji.

Istnieje wiele różnych zestawów do PCR o wysokiej wierności, które są dostępne na rynku. Aby ułatwić optymalizację reakcji, zalecamy wybór zestawu, który zapewnia wiele systemów buforowania, jeden, który jest standardowym buforem o wysokiej wierności, a drugi zoptymalizowany pod kątem wysokiej zawartości GC w złożonych amplikonach. Dodamy 200 nanogramów naszego genomowego DNA.

Dodamy pięć mikrolitrów naszego buforu. Dodamy 2 1/2 mikrolitra naszych starterów do przodu i do tyłu. Dodamy jeden mikrolitr naszej polimerazy, dwa mikrolitry D NTP.

I na koniec, zamierzamy sprawdzić jakość całej reakcji na 50 mikrolitrów sterylną wodą destylowaną. Przeprowadzimy reakcję zgodnie z protokołem specyficznym dla enzymu, którego używamy, a także dla starterów, które zaprojektowaliśmy w tym eksperymencie. Oczyść i zagęścić reakcję PCR.

Hoduj pięciomililitrową kulturę E. coli przez noc w selektywnych pożywkach. Osadzać kulturę przez odwirowanie i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić i poddać lizie komórki w dostarczonym buforze chaotropowym przez pięć minut.

Zneutralizuj reakcję i wymieszaj oba przez odwrócenie pięć lub sześć razy. Odwiruj próbkę przez 10 minut z maksymalną prędkością. Przenieść supernatant do kolumny krzemionkowej i przepłukać dostarczonym buforem.

Odrzuć przepływ i powtórz płukanie z innymi odpowiednimi, z 30-sekundowymi wirowaniami pomiędzy nimi, odrzucając przepływ po każdym. Na koniec odwiruj jeszcze przez dwie minuty, aby usunąć resztki etanolu i eluować plazmid do buforu elucyjnego o pojemności 20 mikrolitrów i określić ilość i jakość za pomocą spektrofotometru. Teraz nadszedł czas, aby skonfigurować trawienie restrykcyjne wektora i insertu.

Dodaj 625 nanogramów DNA, wektor lub wkładkę, pięć mikrolitrów buforu CutSmart, jeden mikrolitr SacII, jeden mikrolitr HindIII i QS reakcję z wodą, aby doprowadzić końcową objętość reakcji do 50 mikrolitrów. Inkubować restrykcyjny proces trawienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, a następnie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby podgrzać i aktywować enzymy. W tym momencie trawione mogą być przechowywane w temperaturze czterech stopni przed przejściem do następnego kroku.

Następnie zamierzamy skonfigurować ligację o pojemności 15 mikrolitrów, używając naszego strawionego fragmentu genomu, a także wektora, który właśnie ukończyliśmy. Zaczniemy od dodania sześciu mikrolitrów wody. Dodamy dwa mikrolitry naszego strawionego wektora.

To jest nasz plazmid pRS315. Dodamy cztery mikrolitry naszej wstawki, genu SIR2. Dodamy dwa mikrolitry naszego bufora ligazy, w przypadku bufora 10X.

Na koniec dodamy jeden mikrolitr ligazy. Zamierzamy inkubować to w temperaturze 16 stopni przez noc, a następnie zabić enzym w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 20 minut. Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem naszego pomyślnie utworzonego plazmidu, zamierzamy przekształcić go w E. coli.

Użyjemy 50 mikrolitrów chemicznie kompetentnych ogniw. Rozmrozimy je na lodzie, a jak tylko się rozmrożą, dodamy naszą reakcję podwiązania, dodamy całą jej zawartość. Więc dodamy 15 mikrolitrów ligacji z wkładką, a także dodamy 15 mikrolitrów naszej kontroli bez wkładki do oddzielnej reakcji.

Po dodaniu przesuń rurkę kilka razy, aby ją wymieszać. Zamierzamy inkubować to na lodzie. Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji na lodzie, dodamy nasze próbki do bloku grzewczego o temperaturze 42 stopni, gdzie będziemy inkubować i szokować cieplnie przez 20 sekund, po czym wyjmiemy je i dodamy pożywkę regeneracyjną.

Po szoku cieplnym pozwolimy na okres rekonwalescencji. Pobierzemy nasze próbki i dodamy 450 mikrolitrów pożywki SOC. Będziemy je inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić wychwycenie plazmidów i rozpoczęcie ekspresji genu oporności na ampicylinę.

Pozwolimy tym próbkom odzyskać sprawność w temperaturze 37 stopni przez 45 minut. Po tej inkubacji ustawiamy serię rozcieńczeń, jeden do 10 i jeden do 100, a następnie zamierzamy umieścić je na pożywce LB / Amp i pozwolić komórkom rosnąć przez noc. Będziemy je platerować techniką sterylną.

Weźmiemy odpowiednią tabliczkę, którą odpowiednio oznaczyliśmy i która zawiera nasz marker do wyboru. Weźmiemy 150 mikrolitrów naszej przekształconej E.coli. Za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania delikatnie rozprowadzimy komórki na całej płytce, aby uzyskać ładne, równomierne rozprowadzenie.

Gdy skończymy posiewać wszystkie nasze rozcieńczenia, będziemy inkubować te płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zobaczyć, co rośnie. Po około dniu powinniśmy zobaczyć rosnące kolonie, które, miejmy nadzieję, zawierają plazmid, który próbowaliśmy stworzyć. Powinny wyglądać mniej więcej tak.

Korzystając z techniki sterylnej, zaszczepij potencjalne transformanty, które wyrosły w wyniku transformacji, w pięć mililitrów LB plus ampicylinę, postępując zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Wyizoluj plazmidy od każdego potencjalnego transformantu i uruchom trawienie restrykcyjne, jak opisano wcześniej. Uruchom produkty reakcji na żelu agarozowym, porównując potencjalne transformanty z pustym wektorem.

Zachowaj wszelkie transformanty, które powodują wycięcie wkładki o odpowiednim rozmiarze, do dalszych badań. Po pomyślnym stworzeniu naszego plazmidu zamierzamy przekształcić go w tło drożdży zerowych ATG1. Weźmiemy 15 mililitrów komórek i zaplanujemy je na granulki, co już zrobiłem tutaj.

Po granulowaniu usuń pożywkę YPAD, w której rosły, i umyj komórki wodą destylowaną. Następnie weźmiemy ogniwa i ponownie zawiesimy je w 100-milimolowym octanie litu. Zamierzamy je ponownie zawiesić w 200 mikrolitrach tego.

Zawiesić osad komórkowy, delikatnie pipetując w górę i w dół. Podziel komórki na osobne probówki do mikrofuge dla każdej z przemian, które wykonasz, używając 50 mikrolitrów tej mieszanki na transformację. Do każdej z przemian będziesz musiał dodać 240 mikrolitrów 50% PEG.

PEG jest bardzo lepki, odpipetuj i zmierz bardzo ostrożnie. Mieszać pipetując po dodaniu PEG i po każdym z dodatkowych składników. Następnie dodaj 36 mikrolitrów jednego molowego octanu litu, pięć mikrolitrów DNA plemników łososia lub innego nośnika DNA, które gotowano przez pięć minut i umieszczano na lodzie, a na koniec pięć mikrolitrów plazmidu na każdą przemianę, którą będziesz wykonywać.

Dokładnie wymieszaj każdą rurkę, aby wymieszać. Inkubuj próbki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 45 minut. Poddaj je szokowi termicznemu w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie umyj komórki w sterylnej wodzie, a na koniec ponownie je zawiesij w 200 mikrolitrach sterylnej wody.

Ustawić od jednego do 10 i jednego do 100 rozcieńczeń każdego z przekształconych szczepów drożdży i rozlać 150 mikrolitrów na płytki SC minus leu, aby wybrać plazmidy. Rozłóż komórki równomiernie i równomiernie i pozwól płytkom wyschnąć przed odwróceniem i inkubacją w temperaturze 30 stopni Celsjusza, pozwalając im rosnąć przez 48 do 72 godzin. Gdy uda nam się sklonować nasz gen do testów, przetestujemy wpływ na chronologiczną długość życia organizmu.

Będziemy hodować drożdże, monitorując liczbę żywotnych jednostek tworzących kolonie, które pozostają w funkcji czasu. Najpierw hoduj drożdże przez 72 godziny w płynnym podłożu SC minus leucyna, wstrząsając w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Za pomocą hemocytometru określ rozcieńczenie niezbędne do pokrycia 500 komórek.

Używając sterylnej techniki, umieść komórki na płytce SC minus leu, pozwalając jej wyschnąć i inkubować odwróconą przez trzy dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza, w którym to momencie dorosną i możesz ocenić wzrost kolonii i zapisać ten punkt czasowy. Po przygotowaniu talerza kontynuuj inkubację drożdży w temperaturze 30 stopni Celsjusza bez wstrząsania. Początkowo powtarzamy posiewy w odstępach tygodniowych, przyjmując częstsze punkty czasowe, jeśli nasze wstępne dane sugerują zahamowanie fenotypu starzenia.

Aby określić procentową rentowność, normalizujemy do jednego dnia jeden punkt czasowy do analizy. Należy pamiętać, aby w każdym odstępie czasu stosować ten sam rozcieńczenie. Kontynuuj ten proces, aż przestaniesz widzieć rosnące kolonie.

Pomocne jest wprowadzenie informacji do arkusza kalkulacyjnego programu Excel. Pozwoli to szybko określić żywotność każdego szczepu po zakończeniu eksperymentu.