Name: Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj metodę ekranu supresorowego do identyfikacji interakcji genetycznych wpływających na długość życia u Saccharomyces cerevisiae. Protokół umożliwia klonowanie i testowanie supresorów w mutantach z krótkim życiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

James T. Arnone chciałby podziękować za wsparcie studentom kursu Technologie Rekombinowanego DNA w 2017 i 2018 roku na Uniwersytecie Williama Patersona, którzy byli zaangażowani w ten projekt od samego początku, ale których wysiłki nie przekroczyły progu autorstwa: Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie, Irvin Gamarra, Preciousgift Isibor, Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza'e, Gabriella Rector, Aida Shono i Matthew So. Jesteście wielkimi naukowcami i tęsknię za wami wszystkimi!
Autorzy pragną podziękować za nieocenione wsparcie ze strony Instruction and Research Technology na Uniwersytecie Williama Patersona za ich pomoc: Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella i Henry Heinitsh. Autorzy pragną również podziękować Biuru Rektora za wsparcie ART, Biuru Dziekana i Centrum Badań w Kolegium Nauki i Zdrowia za wsparcie tych prac, a także Wydziałowi Biologii za wsparcie tego projektu.

<ol><li>López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallmarks+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).</li>
<li>Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genetics of ageing.</a> Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).</li>
<li>Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+longevity+in+the+simplest+animals+and+the+quest+for+immortality%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality.</a> Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).</li>
<li>Longo, V. D., Fabrizio, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLongo%2C+VD+%22Aging+Research+in+Yeast%22">Aging Research in Yeast</a>. , Springer. 101-121 (2011).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+irreversible+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Reversibility of irreversible aging.</a> Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).</li>
<li>Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+physiological+manifestations+and+measurement+of+aging+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans.</a> Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).</li>
<li>Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+networks+determining+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Signaling networks determining life span.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).</li>
<li>Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+chronological+life+span+in+yeast+by+decreased+TOR+pathway+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling.</a> Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).</li>
<li>Lapierre, L. R., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+C.+elegans%3A+signaling+pathways+for+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).</li>
<li>Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+healthy+life+span-from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extending healthy life span-from yeast to humans.</a> Science. 328 (5976), 321-326 (2010).</li>
<li>Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuins+as+regulators+of+metabolism+and+healthspan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).</li>
<li>Bitto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+rapamycin+treatment+can+increase+lifespan+and+healthspan+in+middle-aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice.</a> elife. 5, 16351(2016).</li>
<li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAD%2B+replenishment+improves+lifespan+and+healthspan+in+ataxia+telangiectasia+models+via+mitophagy+and+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair.</a> Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).</li>
<li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screen+in+Saccharomyces+cerevisiae+identifies+vacuolar+protein+sorting%2C+autophagy%2C+biosynthetic%2C+and+tRNA+methylation+genes+involved+in+life+span+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation.</a> PLoS Genetics. 6 (7), (2010).</li>
<li>Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+and+chronological+aging+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).</li>
<li>He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+replicative+aging+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The yeast replicative aging model.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).</li>
<li>Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).</li>
<li>Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction+extends+the+chronological+lifespan+of+Saccharomyces+cerevisiae+independently+of+the+Sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins.</a> Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).</li>
<li>Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+longevity-related+genes+as+a+tool+to+regulate+yeast+life+span+and+metabolite+production+during+winemaking%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1(2013).</li>
<li>Tissenbaum, H. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+dosage+of+a+sir-2+gene+extends+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).</li>
<li>Huang, W. P., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+yeast%3A+a+review+of+the+molecular+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery.</a> Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).</li>
<li>Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+aging%3A+an+autophagic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of aging: an autophagic perspective.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 790(2019).</li>
<li>Aris, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+leucine+promote+chronological+longevity+and+respiration+proficiency+during+calorie+restriction+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast.</a> Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).</li>
<li>Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Atg1+kinase+complex+is+involved+in+the+regulation+of+protein+recruitment+to+initiate+sequestering+vesicle+formation+for+nonspecific+autophagy+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).</li>
<li>Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apg1p%2C+a+novel+protein+kinase+required+for+the+autophagic+process+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 192 (2), 245-250 (1997).</li>
<li>Cherry, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+Genome+Database%3A+the+genomics+resource+of+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast.</a> Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).</li>
<li>Engel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reference+genome+sequence+of+Saccharomyces+cerevisiae%3A+then+and+now%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).</li>
<li>Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+silencing+and+longevity+protein+Sir2+is+an+NAD-dependent+histone+deacetylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase.</a> Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).</li>
<li>Sampaio-Marques, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNCA+%28%CE%B1-synuclein%29-induced+toxicity+in+yeast+cells+is+dependent+on+Sir2-mediated+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy.</a> Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).</li>
<li>Nagalakshmi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+yeast+genome+defined+by+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing.</a> Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).</li>
<li>De Boer, C. G., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YeTFaSCo%3A+a+database+of+evaluated+yeast+transcription+factor+sequence+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities.</a> Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3064(2012).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGietz%2C+RD+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 350, Elsevier. 87-96 (2002).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+plasma+copy+number+detection+using+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Serum and plasma copy number detection using real-time PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56502(2017).</li>
<li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+analysis+of+mRNA+molecules+using+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Visualized Experiments. (76), e50382(2013).</li>
<li>Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+study+yeast+cell+aging+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Approaches to study yeast cell aging and death.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).</li>
<li>Lin, S. J., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+adenine+dinucleotide%2C+a+metabolic+regulator+of+transcription%2C+longevity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease.</a> Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).</li>
<li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li>
<li>Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+gene+expression+in+yeast%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Foreign gene expression in yeast: a review.</a> Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).</li>
<li>Storici, F., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).</li>
<li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Arnone, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Considerations+for+the+Modification+of+Saccharomyces+cerevisiae+for+Biofuel+and+Metabolite+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis.</a> Microorganisms. 8 (3), (2020).</li>
<li>Murakami, C., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+yeast+chronological+life+span+by+outgrowth+of+aged+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1156(2009).</li>
<li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> Journal of Visualized Experiments. (28), e1209(2009).</li>
<li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50143(2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Rozwikłanie zagadki genetyki starzenia się jest trudnym wyzwaniem, z wieloma możliwościami dalszych badań, które mogą potencjalnie przynieść znaczący wgląd w istniejące złożone interakcje. Istnieje wiele metod, które pozwalają na szybkie generowanie mutantów utraconych funkcji do badania szczepów zerowych drożdży45,46. Metoda ta przedstawia proste podejście do identyfikacji i klonowania genów na wektor pRS315 w celu badań supresorów nadekspresji. Jedną z zalet te...

Starzenie się to zależna od czasu utrata integralności w niezliczonych procesach biologicznych, która ostatecznie zwiększa prawdopodobieństwo śmierci organizmu. Starzenie się jest prawie nieuniknione dla wszystkich gatunków. Na poziomie komórkowym istnieje kilka dobrze scharakteryzowanych cech charakterystycznych, które są związane ze starzeniem się, w tym: niestabilność genomu, zmiany epigenetyczne, utrata proteostazy, dysfunkcja mitochondriów, rozregulowane wykrywanie składników odżywczych, starzenie się komórek i zanik telomerów1,2. W organizmach jednokomórkowych, takich jak drożdże, prowadzi to do zmniejszenia potencjału replikacyjnego i chronologicznej długości życia3,4. Te zmiany komórkowe objawiają się w bardziej złożonych organizmach, takich jak ludzie, jako patologie, które obejmują nowotwory, niewydolność serca, neurodegenerację, cukrzycę i osteoporozę5,6,7. Pomimo wielu złożoności, które charakteryzują proces starzenia, te molekularne cechy charakterystyczne leżące u podstaw tego procesu są zachowane w bardzo rozbieżnych organizmach8,9,10. Identyfikacja zmian w tych szlakach podczas starzenia się doprowadziła do uświadomienia sobie, że można nimi manipulować poprzez zmiany stylu życia - wykazano, że ograniczenia dietetyczne znacznie wydłużają życie wielu organizmów11. Szlaki te zbiegają się i przecinają ze sobą i z wieloma innymi ścieżkami w złożony sposób. Wyjaśnienie i scharakteryzowanie tych interakcji stwarza potencjał dla interwencji terapeutycznych w celu przedłużenia życia i zdrowia12,13,14.
Zachowanie molekularnych podstaw starzenia pozwala na funkcjonalne rozbiór interakcji genetycznych leżących u podstaw tego procesu poprzez użycie prostszych organizmów modelowych - w tym u pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae15,16. Istnieją dwa znane typy starzenia modelowane przez pączkujące drożdże: starzenie chronologiczne (chronologiczna długość życia, CLS) i starzenie replikacyjne (replikacyjna długość życia, RLS)17. Starzenie chronologiczne mierzy czas, w którym komórka może przetrwać w stanie niedzielącym się. Jest to analogiczne do starzenia się obserwowanego w komórkach, które spędzają większość swojego życia w G0, takich jak neurons4. Alternatywnie, replikacyjna długość życia to liczba przypadków, w których komórka może się podzielić przed wyczerpaniem i jest modelem dla mitotycznie aktywnych typów komórek (np. liczba komórek potomnych, które może mieć komórka)18.
Ogólnym celem tej metody jest przedstawienie protokołu, który pozwala na funkcjonalne rozbiór genetyki starzenia się za pomocą S. cerevisiae. Chociaż przeprowadzono wiele doskonałych badań przez wielu badaczy, które doprowadziły do naszego obecnego zrozumienia, dla początkujących naukowców nadal dostępnych jest wiele możliwości, aby przyczynić się do rozwoju dziedziny starzenia się od wczesnych lat ich kariery akademickiej. Przedstawiamy przejrzystą metodologię, która pozwoli naukowcom na dalszy rozwój w dziedzinie starzenia się. Protokół ten został zaprojektowany tak, aby był dostępny dla wszystkich badaczy, niezależnie od etapu ich kariery akademickiej, zapewniając narzędzia niezbędne do formułowania i testowania własnych nowatorskich hipotez. Zaletą naszego podejścia jest to, że jest to opłacalna metoda, łatwo dostępna dla wszystkich badaczy, niezależnie od instytucji – i nie wymaga drogiego, specjalistycznego sprzętu niezbędnego dla niektórych protokołów19. Istnieje kilka różnych sposobów projektowania tego typu badań przesiewowych, podejście przedstawione w tej pracy jest szczególnie podatne na badania przesiewowe mutantów zerowych nieistotnych genów, które wykazują poważne skrócenie chronologicznej długości życia w porównaniu z izogenicznym szczepem drożdży typu dzikiego.
Jako dowód zasady, klonujemy SIR2, deacetylazę lizyny, o której stwierdzono, że wykazuje zarówno wydłużony, jak i skrócony CLS w przypadku nadekspresji. Niedawno stwierdzono, że nadekspresja SIR2 zwiększa CLS w drożdżach winiarskich; jednak kilka grup zgłosiło brak związku między rozszerzeniem SIR2 a CLS, pozostawiając jego rolę w characterized20,21,22. Ze względu na te sprzeczne doniesienia w literaturze, wybraliśmy ten gen, aby dodać niezależne badania, które pomogą wyjaśnić rolę SIR2 w chronologicznym starzeniu się, jeśli w ogóle. Dodatkowo, zwiększenie liczby kopii homologu SIR2 wydłuża żywotność systemu modeli nicieni23.
Autofagia to wewnątrzkomórkowy system degradacji, który dostarcza produkty cytozolowe, takie jak białka i organelle, do lizosomu24. Autofagia jest ściśle związana z długowiecznością poprzez swoją rolę w degradacji uszkodzonych białek i organelli w celu utrzymania homeostazy komórkowej25. Indukcja autofagii zależy od orkiestracji ekspresji wielu genów, a delecja genu ATG1 powoduje nienormalnie krótki CLS u pączkujących drożdży26. ATG1 koduje białko kinazę serynowo-treoninową wymaganą do tworzenia pęcherzyków w autofagii i szlaku cytoplazma-wakuola (grzybowy odpowiednik lizosomów)27,28. W tym miejscu przedstawiamy naszą metodę na ekranie zwiększonej liczby kopii, testując wpływ zwiększonej kopii SIR2 na CLS w typie dzikim i tle atg1-null. Metoda ta jest szczególnie przydatna dla młodszych badaczy i grup badawczych głównie w instytucjach licencjackich, z których wiele służy społecznościom niedostatecznie reprezentowanym w naukach ścisłych i ma ograniczone zasoby.

<table><tbody><tr><td>Zestaw DNA grzybów/bakterii</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>Enzym HindIIIHF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymeraza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td> Zestaw miniprep plazmidu <td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>12123</td><td></td></tr><tr><td>Enzym SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>Łosoś plemniki DNA</td><td>Thermofisher</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr></tbody></table>

ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u saccharomyces cerevisiae

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Starzenie się to zależne od czasu pogorszenie normalnych procesów biologicznych organizmu, które zwiększa prawdopodobieństwo śmierci. Wiele czynników genetycznych przyczynia się do zmian w normalnym procesie starzenia. Czynniki te przecinają się w złożony sposób, o czym świadczy bogactwo udokumentowanych powiązań zidentyfikowanych i zachowanych w wielu organizmach. Większość z tych badań koncentruje się na utraconych funkcjach, mutantach zerowych, które pozwalają na szybkie badanie przesiewowe wielu genów jednocześnie. Jest znacznie mniej prac, które koncentrują się na scharakteryzowaniu roli, jaką w tym procesie odgrywa nadekspresja genu. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą metodologię identyfikacji i klonowania genów w pączkujących drożdżach, Saccharomyces cerevisiae, do badań nad supresją krótkotrwałego fenotypu chronologicznego życia obserwowanego w wielu tłach genetycznych. Protokół ten został opracowany tak, aby był dostępny dla badaczy z wielu różnych środowisk i na różnych etapach akademickich. Gen SIR2, który koduje deacetylazę histonową, został wybrany do klonowania w wektorze pRS315, ponieważ pojawiły się sprzeczne doniesienia na temat jego wpływu na chronologiczną długość życia. SIR2 odgrywa również rolę w autofagii, która powstaje, gdy zostaje zakłócona przez delecję kilku genów, w tym czynnika transkrypcyjnego ATG1. Jako dowód zasady, klonujemy gen SIR2, aby przeprowadzić badanie supresorowe na fenotypie skróconej długości życia charakterystycznym dla mutanta atg1Δ z niedoborem autofagii i porównujemy go z inaczej izogenicznym, dzikim tłem genetycznym.

Z uwagi na sprzeczne doniesienia dotyczące roli SIR2 w procesie starzenia, wybrano ten gen do badań jako potencjalny supresor fenotypu skróconego CLS u mutantów atg1Δ26. Rola SIR2 jest nieco kontrowersyjna, a raporty na temat jego wpływu na wydłużenie CLS są sprzeczne, jednak wyraźnie powiązano go ze zwiększeniem CLS w co najmniej jednym szczepie drożdży, wykazując jego rolę zarówno w autofagii, jak i mitofagii2,31</su...

Oto protokół do identyfikacji interakcji genetycznych za pomocą zwiększonej liczby kopii u Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta pozwala naukowcom identyfikować, klonować i testować supresory w krótko żyjących mutantach drożdży. Testujemy wpływ wzrostu liczby kopii SIR2 na długość życia w autofagii mutanta zerowego.

Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors ...

Starzenie się charakteryzuje się zależnym od czasu pogorszeniem wielu procesów komórkowych, co ostatecznie zwiększa prawdopodobieństwo śmierci organizmu. W obrębie populacji proces ten jest zmienny i może na niego wpływać szereg czynników genetycznych i środowiskowych. Jedną z najlepiej zbadanych i zrozumianych zmiennych jest rola diety na długość życia.Ograniczenie dietetyczne to interwencja, która ostatecznie opóźnia początek starzenia się i zmian związanych ze starzeniem się. Zwiększa to długość życia organizmu i długość jego zdrowia, czyli czas, w którym organizm prowadzi normalne, zdrowe życie. Nasza obecna wiedza doprowadziła do zidentyfikowania odrębnego zestawu zmian komórkowych, które zostały nazwane cechami charakterystycznymi starzenia się, takich jak między innymi akumulacja mutacji, rozregulowanie telomerów, utrata homeostazy białek, problemy z oddychaniem i reaktywne formy tlenu.Wiele z tych informacji pochodzi z badań, w których wykorzystuje się wiele różnych organizmów modelowych. Przeprowadzono wiele badań genetycznych, które zidentyfikowały geny, które zarówno skracają, jak i wydłużają życie. Należą do nich badania nad pączkującymi drożdżami Saccharomyces cerevisiae, na których skupia się ta metodologia, a także badania nad bardziej złożonymi organizmami wielokomórkowymi, takimi jak C. elegans i system mysi.Spośród nich jednak pączkujące drożdże są szczególnie podatne na badania nad starzeniem się ze względu na ich krótką naturalną żywotność i szereg podejść genetycznych, które mogą rozwikłać złożone relacje genetyczne, co czyni je doskonałym systemem do funkcjonalnej analizy genetyki starzenia. Drożdże można wykorzystać do badania kilku różnych aspektów starzenia. Skupimy się na chronologicznej długości życia, czyli czasie, w którym komórka może przetrwać.Celem tej pracy jest przedstawienie prostego podejścia genetycznego do wykonania badania przesiewowego supresorowego nadekspresji. Wykorzystamy tło genetyczne, które skutkuje nienormalnie skróconą chronologiczną długością życia. Wykorzystamy ukierunkowane podejście do identyfikacji genów, które mogą uratować lub stłumić fenotyp skróconej długości życia, próbując zidentyfikować geny, które przywracają normalną długość życia.Pierwszym tłem genetycznym jest szczep drożdży z niedoborem autofagii. Autofagia, co luźno tłumaczy się jako samozjadanie, to wewnątrzkomórkowy system degradacji polegający na dostarczaniu produktów cytozolowych, takich jak białka i organelle, do lizosomu. Pomaga to w utrzymaniu homeostazy komórkowej poprzez eliminację uszkodzonych białek, a także tych, które przeżyły swoje życie.Będziemy pracować ze zmutowanym szczepem, który ma delecję genu ATG1. ATG1 koduje białko kinazę białkowo-serynowo-treoninowo-białkową, która jest niezbędna do tworzenia pęcherzyków i autofagii w szlaku celowania cytoplazma-wakuola. Mutant zerowy ATG1 ma fenotyp o nienormalnie krótkiej chronologicznej długości życia.W tym starzejącym się laboratorium zaprojektujemy i przetestujemy czynniki genetyczne, które mogą uratować lub stłumić nienormalnie skróconą długość życia charakterystyczną dla mutanta zerowego ATG1. Można to jednak rozszerzyć również na inne krótkotrwałe tła genetyczne. Pierwszym krokiem w tym procesie jest zidentyfikowanie genu, który jest związany z wydłużeniem życia.Skupimy się w szczególności na genach, które wydłużają chronologiczną długość życia, gdy są nadmiernie eksprymowane. Aby to zrobić, zamierzamy wykorzystać publicznie dostępne dane, które są dostępne w bazie danych genomu drożdży. Idziemy tutaj.Szukaj według fenotypu. Mniej więcej w połowie drogi zobaczymy, że możemy wybrać chronologiczną długość życia. Aby znaleźć geny, które wydłużają życie, można zobaczyć bogactwo dostępnych danych, które zawierają geny związane z tym konkretnym fenotypem.Dzisiaj będziemy badać SIR2, deacetylazę lizyny histonowej, która jest związana z wydłużoną chronologiczną żywotnością, gdy jest nadmiernie eksprymowana. Pierwszą rzeczą, którą zrobimy, to uzyskamy dostęp do sekwencji DNA dla regionu kodującego, a także regionów regulatorowych, które otaczają obie strony tego genu. Weźmiemy 400 par zasad w górę i w dół, aby mieć pewność, że obejmiemy wszystkie regiony regulacyjne.Wykorzystamy tę sekwencję DNA do zaprojektowania starterów PCR, które pozwolą nam sklonować ten gen do naszego wektora plazmidowego. Użyjemy PCR do amplifikacji naszego genu i sklonowania go do wektora pRS315. W tym celu zaprojektujemy startery, które zawierają miejsca trawienia restrykcyjnego, które zawierają miejsca restrykcyjne HindIII i SacII.Jak widać, plazmid zawiera oba miejsca restrykcyjne, HindIII i SacII, które ułatwią nam klonowanie. Startery PCR należy zaprojektować tak, aby zawierały około 21 lub 22 nukleotydów o sekwencji komplementarnej do regionu, który chcesz amplifikować. Oprócz sekwencji, dodasz do pięciu głównych z nich odpowiednie miejsce restrykcyjne, albo HindIII na starterze do przodu, albo SacII na starterze odwrotnym, pokazane tutaj odpowiednio na czerwono i fioletowo, a dalej przed tym, dodaj kilka nukleotydów, które pozwolą enzymowi restrykcyjnemu związać się i stworzyć miejsce trawienia restrykcyjnego z wyższą wydajnością.Wyhoduj pięciomililitrową kulturę drożdży typu dzikiego przez noc do fazy po logarytmie w wzbogaconych podłożach, takich jak YPAD. Zbierz genomowe DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu, który jest specyficzny dla izolacji genomu grzybów. Ważne jest, aby zestaw był specyficzny dla drożdży, ponieważ mają one bardzo sztywną i twardą ścianę komórkową do penetracji.Leczenie zymoliazą jest skuteczne w trawieniu ściany komórkowej i znacznie zwiększa wydajność genomu. Użyj spektrofotometru, aby określić ilość i jakość DNA. Aby wyprodukować amplikon nadający się do klonowania, konieczne jest użycie polimerazy PCR o wysokiej wierności, aby uniknąć mutacji podczas procesu amplifikacji.Istnieje wiele różnych zestawów do PCR o wysokiej wierności, które są dostępne na rynku. Aby ułatwić optymalizację reakcji, zalecamy wybór zestawu, który zapewnia wiele systemów buforowania, jeden, który jest standardowym buforem o wysokiej wierności, a drugi zoptymalizowany pod kątem wysokiej zawartości GC w złożonych amplikonach. Dodamy 200 nanogramów naszego genomowego DNA.Dodamy pięć mikrolitrów naszego buforu. Dodamy 2 1/2 mikrolitra naszych starterów do przodu i do tyłu. Dodamy jeden mikrolitr naszej polimerazy, dwa mikrolitry D NTP.I na koniec, zamierzamy sprawdzić jakość całej reakcji na 50 mikrolitrów sterylną wodą destylowaną. Przeprowadzimy reakcję zgodnie z protokołem specyficznym dla enzymu, którego używamy, a także dla starterów, które zaprojektowaliśmy w tym eksperymencie. Oczyść i zagęścić reakcję PCR.Hoduj pięciomililitrową kulturę E. coli przez noc w selektywnych pożywkach. Osadzać kulturę przez odwirowanie i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić i poddać lizie komórki w dostarczonym buforze chaotropowym przez pięć minut.Zneutralizuj reakcję i wymieszaj oba przez odwrócenie pięć lub sześć razy. Odwiruj próbkę przez 10 minut z maksymalną prędkością. Przenieść supernatant do kolumny krzemionkowej i przepłukać dostarczonym buforem.Odrzuć przepływ i powtórz płukanie z innymi odpowiednimi, z 30-sekundowymi wirowaniami pomiędzy nimi, odrzucając przepływ po każdym. Na koniec odwiruj jeszcze przez dwie minuty, aby usunąć resztki etanolu i eluować plazmid do buforu elucyjnego o pojemności 20 mikrolitrów i określić ilość i jakość za pomocą spektrofotometru. Teraz nadszedł czas, aby skonfigurować trawienie restrykcyjne wektora i insertu.Dodaj 625 nanogramów DNA, wektor lub wkładkę, pięć mikrolitrów buforu CutSmart, jeden mikrolitr SacII, jeden mikrolitr HindIII i QS reakcję z wodą, aby doprowadzić końcową objętość reakcji do 50 mikrolitrów. Inkubować restrykcyjny proces trawienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, a następnie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby podgrzać i aktywować enzymy. W tym momencie trawione mogą być przechowywane w temperaturze czterech stopni przed przejściem do następnego kroku.Następnie zamierzamy skonfigurować ligację o pojemności 15 mikrolitrów, używając naszego strawionego fragmentu genomu, a także wektora, który właśnie ukończyliśmy. Zaczniemy od dodania sześciu mikrolitrów wody. Dodamy dwa mikrolitry naszego strawionego wektora.To jest nasz plazmid pRS315. Dodamy cztery mikrolitry naszej wstawki, genu SIR2. Dodamy dwa mikrolitry naszego bufora ligazy, w przypadku bufora 10X.Na koniec dodamy jeden mikrolitr ligazy. Zamierzamy inkubować to w temperaturze 16 stopni przez noc, a następnie zabić enzym w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 20 minut. Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem naszego pomyślnie utworzonego plazmidu, zamierzamy przekształcić go w E. coli.Użyjemy 50 mikrolitrów chemicznie kompetentnych ogniw. Rozmrozimy je na lodzie, a jak tylko się rozmrożą, dodamy naszą reakcję podwiązania, dodamy całą jej zawartość. Więc dodamy 15 mikrolitrów ligacji z wkładką, a także dodamy 15 mikrolitrów naszej kontroli bez wkładki do oddzielnej reakcji.Po dodaniu przesuń rurkę kilka razy, aby ją wymieszać. Zamierzamy inkubować to na lodzie. Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji na lodzie, dodamy nasze próbki do bloku grzewczego o temperaturze 42 stopni, gdzie będziemy inkubować i szokować cieplnie przez 20 sekund, po czym wyjmiemy je i dodamy pożywkę regeneracyjną.Po szoku cieplnym pozwolimy na okres rekonwalescencji. Pobierzemy nasze próbki i dodamy 450 mikrolitrów pożywki SOC. Będziemy je inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić wychwycenie plazmidów i rozpoczęcie ekspresji genu oporności na ampicylinę.Pozwolimy tym próbkom odzyskać sprawność w temperaturze 37 stopni przez 45 minut. Po tej inkubacji ustawiamy serię rozcieńczeń, jeden do 10 i jeden do 100, a następnie zamierzamy umieścić je na pożywce LB / Amp i pozwolić komórkom rosnąć przez noc. Będziemy je platerować techniką sterylną.Weźmiemy odpowiednią tabliczkę, którą odpowiednio oznaczyliśmy i która zawiera nasz marker do wyboru. Weźmiemy 150 mikrolitrów naszej przekształconej E.coli. Za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania delikatnie rozprowadzimy komórki na całej płytce, aby uzyskać ładne, równomierne rozprowadzenie.Gdy skończymy posiewać wszystkie nasze rozcieńczenia, będziemy inkubować te płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zobaczyć, co rośnie. Po około dniu powinniśmy zobaczyć rosnące kolonie, które, miejmy nadzieję, zawierają plazmid, który próbowaliśmy stworzyć. Powinny wyglądać mniej więcej tak.Korzystając z techniki sterylnej, zaszczepij potencjalne transformanty, które wyrosły w wyniku transformacji, w pięć mililitrów LB plus ampicylinę, postępując zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Wyizoluj plazmidy od każdego potencjalnego transformantu i uruchom trawienie restrykcyjne, jak opisano wcześniej. Uruchom produkty reakcji na żelu agarozowym, porównując potencjalne transformanty z pustym wektorem.Zachowaj wszelkie transformanty, które powodują wycięcie wkładki o odpowiednim rozmiarze, do dalszych badań. Po pomyślnym stworzeniu naszego plazmidu zamierzamy przekształcić go w tło drożdży zerowych ATG1. Weźmiemy 15 mililitrów komórek i zaplanujemy je na granulki, co już zrobiłem tutaj.Po granulowaniu usuń pożywkę YPAD, w której rosły, i umyj komórki wodą destylowaną. Następnie weźmiemy ogniwa i ponownie zawiesimy je w 100-milimolowym octanie litu. Zamierzamy je ponownie zawiesić w 200 mikrolitrach tego.Zawiesić osad komórkowy, delikatnie pipetując w górę i w dół. Podziel komórki na osobne probówki do mikrofuge dla każdej z przemian, które wykonasz, używając 50 mikrolitrów tej mieszanki na transformację. Do każdej z przemian będziesz musiał dodać 240 mikrolitrów 50% PEG.PEG jest bardzo lepki, odpipetuj i zmierz bardzo ostrożnie. Mieszać pipetując po dodaniu PEG i po każdym z dodatkowych składników. Następnie dodaj 36 mikrolitrów jednego molowego octanu litu, pięć mikrolitrów DNA plemników łososia lub innego nośnika DNA, które gotowano przez pięć minut i umieszczano na lodzie, a na koniec pięć mikrolitrów plazmidu na każdą przemianę, którą będziesz wykonywać.Dokładnie wymieszaj każdą rurkę, aby wymieszać. Inkubuj próbki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 45 minut. Poddaj je szokowi termicznemu w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie umyj komórki w sterylnej wodzie, a na koniec ponownie je zawiesij w 200 mikrolitrach sterylnej wody.Ustawić od jednego do 10 i jednego do 100 rozcieńczeń każdego z przekształconych szczepów drożdży i rozlać 150 mikrolitrów na płytki SC minus leu, aby wybrać plazmidy. Rozłóż komórki równomiernie i równomiernie i pozwól płytkom wyschnąć przed odwróceniem i inkubacją w temperaturze 30 stopni Celsjusza, pozwalając im rosnąć przez 48 do 72 godzin. Gdy uda nam się sklonować nasz gen do testów, przetestujemy wpływ na chronologiczną długość życia organizmu.Będziemy hodować drożdże, monitorując liczbę żywotnych jednostek tworzących kolonie, które pozostają w funkcji czasu. Najpierw hoduj drożdże przez 72 godziny w płynnym podłożu SC minus leucyna, wstrząsając w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Za pomocą hemocytometru określ rozcieńczenie niezbędne do pokrycia 500 komórek.Używając sterylnej techniki, umieść komórki na płytce SC minus leu, pozwalając jej wyschnąć i inkubować odwróconą przez trzy dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza, w którym to momencie dorosną i możesz ocenić wzrost kolonii i zapisać ten punkt czasowy. Po przygotowaniu talerza kontynuuj inkubację drożdży w temperaturze 30 stopni Celsjusza bez wstrząsania. Początkowo powtarzamy posiewy w odstępach tygodniowych, przyjmując częstsze punkty czasowe, jeśli nasze wstępne dane sugerują zahamowanie fenotypu starzenia.Aby określić procentową rentowność, normalizujemy do jednego dnia jeden punkt czasowy do analizy. Należy pamiętać, aby w każdym odstępie czasu stosować ten sam rozcieńczenie. Kontynuuj ten proces, aż przestaniesz widzieć rosnące kolonie.Pomocne jest wprowadzenie informacji do arkusza kalkulacyjnego programu Excel. Pozwoli to szybko określić żywotność każdego szczepu po zakończeniu eksperymentu.

a-suppressor-screen-for-characterization-genetic-links-regulating

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Starzenie chronologiczne u drożdży odnosi się do utraty żywotności komórek związanej z czasem przebywania w fazie stacjonarnej. W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowego określania chronologicznej długości życia drożdży.

Kwantyfikacja chronologicznej długości życia drożdży poprzez odrastanie starzejących się komórek

W niniejszym opracowaniu opisujemy zestaw testów mutacji DNA, które można połączyć z modelem chronologicznej długości życia drożdży w celu zbadania genów i szlaków regulujących lub przyczyniających się do niestabilności genomowego DNA podczas starzenia.

Badanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej z wykorzystaniem modelu chronologicznej długości życia S. cerevisiae

Szybkość mutacji w młodych komórkach Saccharomyces cerevisiae mierzona za pomocą testów fluktuacyjnych służy do przewidywania częstości mutacji dla komórek macierzystych w różnym wieku replikacji. Sortowanie magnetyczne i cytometria przepływowa są następnie wykorzystywane do pomiaru rzeczywistej częstości mutacji i wieku komórek macierzystych w celu zidentyfikowania wszelkich odchyleń od przewidywanych częstości mutacji.

Połączenie sortowania magnetycznego komórek macierzystych i testów fluktuacji w celu analizy niestabilności genomu podczas starzenia się komórek mitotycznych u Saccharomyces cerevisiae

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Patogeny bakteryjne wydzielają do gospodarza białka, które kierują się na kluczowe procesy biologiczne. Identyfikacja szlaków gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu patogenezy molekularnej. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą zmodyfikowany supresor drożdży i badanie przesiewowe toksyczności w celu wyjaśnienia szlaków gospodarza, do których skierowane są toksyczne bakteryjne białka efektorowe.

Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Opisujemy solidną strategię wymiany genów w celu genetycznego manipulowania grzybem Ustilago maydis. Ten protokół wyjaśnia, jak generować mutanty delecji w celu zbadania fenotypów infekcji. Można go rozszerzyć o modyfikację genów w dowolny sposób, np. poprzez dodanie sekwencji kodującej znacznik białka fluorescencyjnego.

Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący sekwencję RNA do monitorowania poziomów mRNA w czasie podczas niedotlenienia komórek S. cerevisiae. Metodę tę można dostosować do analizy ekspresji genów podczas dowolnej odpowiedzi komórkowej.

Pomiar poziomu mRNA w czasie podczas odpowiedzi niedotlenienia drożdży S. cerevisiae

Informujemy o małym RNA spinki do włosów (shRNA) i protokole sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji regulatorów inaktywacji chromosomu X w linii komórkowej myszy z genami oporności na lucyferazy świetlika i higromycynę połączonymi z genem białka wiążącego metylo CpG 2 (MeCP2) na nieaktywnym chromosomie X.

Zbiorcze badanie przesiewowe shRNA w celu reaktywacji MeCP2 na nieaktywnym chromosomie X

Poznaj metodę ekranu supresorowego do identyfikacji interakcji genetycznych wpływających na długość życia u Saccharomyces cerevisiae. Protokół umożliwia klonowanie i testowanie supresorów w mutantach z krótkim życiem.

Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów