Name: Uzyskiwanie pierwotnych osteocytów poprzez mysie frakcjonowanie kalwaryjne osteocytów eksprymujących GFP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych osteocytów eksprymujących GFP z myszy dmp1-topaz przy użyciu FACS. Protokół zmniejsza czas manipulacji i zwiększa wydajność uzyskiwania komórek z minimalnym zanieczyszczeniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez grant JSPS KAKENHI od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (nr 19K10397 dla H.K. i nr 18K09862 dla I.M.).

Wszystkie procedury i opieka nad zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami i przepisami Uniwersytetu Tohoku.
1. Sekcja nowonarodzonej kalwarii myszy dmp1-topaz
<ol>
	<li>Do tego protokołu użyj 6\u20127-dniowych szczeniąt myszy C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Poddaj myszy eutanazji za pomocą 5% inhalacji izofluranu, a następnie przenieś młode do 70% etanolu.</li>
	<li>Przenieś uśpione szczenię do niepoddanego działaniu substancji miski hodowlanej.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek i pęsety chwyć skórę u podstawy czaszki i wykonaj nacięcie.</li>
	<li>Używając pierwszego nacięcia jako punktu wyjścia, naciąć po obu bocznych stronach czaszki przed uszami, usunąć skórę i odsłonić kalwarię.</li>
	<li>Przytrzymaj głowę od grzbietu nosa i przetnij kalwarię wzdłuż szwu lambdoidalnego. Wytnij wzdłuż bocznych krawędzi kości ciemieniowych i przedłuż go, aby objął część czołową.</li>
	<li>Oddziel kalwarię od leżącej pod nią tkanki mózgowej. 
	UWAGA: Aby zapewnić czystą kalwarię kostną z minimalnym przyczepem tkanek miękkich, nie należy wcinać się głęboko w kość; Dla porównania, powinno być w stanie zobaczyć cień nożyczek pod kością.</li>
	<li>Przenieś kalwarię do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4 w całym protokole). Upewnij się, że wklęsła część jest skierowana do góry.</li>
</ol>
2. Frakcjonowanie nowonarodzonej kalwarii myszy
<ol>
	<li>Przenieść do 5 kalwarii do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml roztworu kolagenazy o stężeniu 2 mg/ml. Użyj świeżego roztworu kolagenazy przygotowanego tuż przed użyciem.
	<ol>
		<li>Aby przygotować świeży roztwór kolagenazy, dodaj proszek kolagenazy do buforu izolacyjnego (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO3, 60 mM sorbitolu, 3 mM K2HPO4, 1 mM CaCl2, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 5 mg/ml glukozy i 25 mM HEPES) w stężeniu 2 mg/ml. Rozpuść proszek kolagenazy na mieszadle magnetycznym.</li>
		<li>Przepuść roztwór kolagenazy przez sterylny filtr 0,22 μm do probówki o pojemności 50 ml i utrzymuj go na lodzie przez cały czas trwania protokołu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować kalwarię w temperaturze 37 °C przez 20 minut na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min, aby uzyskać frakcję 1.</li>
	<li>Odrzucić wytrawienie frakcji 1, przemyć kalwarię 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i wyrzucić płukanie.</li>
	<li>Inkubować kalwarię w 5 ml 5 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) zawierającego 1 mg/ml BSA w PBS, pH 7,4 w temperaturze 37 °C przez 15 minut na wytrząsarce przy 300 obr./min.</li>
	<li>Zebrać trawienie w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umyj kalwarię 5 ml PBS i dodaj roztwór do płukania do roztworu do trawienia. 
	UWAGA: Na każdym etapie zbierania trawienia i płukania należy pipetować kości w roztworze, aby oddzielić komórki od kości i zapobiec powstawaniu dubletów i agregacji komórek.</li>
	<li>Aby uzyskać frakcję 2, odwirować trawienie przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 8 ml α-Minimum Essential Medium (MEM) zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 j.m./ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny. Nasiona na 10 cm naczyniu hodowlanym. Inkubować frakcję 2 w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .</li>
	<li>Inkubować kalwarię w 5 ml roztworu kolagenazy w temperaturze 37 °C przez 20 minut na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min.</li>
	<li>Aby zebrać ułamek 3, powtórz kroki 2.5\u20122.6. Inkubować frakcję 3 w temperaturze 37 °C w temperaturze poniżej 5% CO2, 
	UWAGA: W tym momencie kości staną się mniejsze i zostaną zredukowane do fragmentów. Aby upewnić się, że żadne kości nie zostaną przypadkowo zassane do trawien, co prowadzi do utraty komórek w tym procesie, użyj pipety z małą końcówką do zbierania trawionych składników (końcówki do pipet 1000\2012200 μl).</li>
	<li>Inkubować kalwarię w 5 ml roztworu kolagenazy w temperaturze 37 °C przez 20 minut na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min.</li>
	<li>Aby zebrać ułamek 4, powtórz kroki 2.5\u20122.6. Inkubować frakcję 4 w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .</li>
	<li>Inkubować kalwarię w 5 ml 5 mM EDTA zawierającego 1 mg/ml BSA w PBS (pH 7,4) w temperaturze 37 °C przez 15 minut na wytrząsarce przy 300 obr./min.</li>
	<li>Aby zebrać ułamek 5, powtórz kroki 2.5\u20122.6. Inkubować frakcję 5 w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 . Osteocyty można przygotować do sortowania tego samego dnia lub hodować do 24 godzin przed sortowaniem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie osteocytów do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją
<ol>
	<li>Odessać pożywkę z każdej frakcji komórkowej i delikatnie przemyć dwukrotnie 10 ml PBS.</li>
	<li>Dodać 5 ml 0,5% trypsyny-EDTA do PBS i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml 10% FBS α-MEM i delikatnie odpipetować, aby delikatnie odłączyć komórki. Połącz komórki w każdej frakcji, przesiewając przez sitko o wielkości 40 μm do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umyj komórki 10 ml PBS i zbierz, przesiewając przez sitko o wielkości 40 μm do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Odwirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i dodać 10% FBS α-MEM do osadu. Dostosuj stężenie komórek do około 1 x 107 komórek/ml.</li>
	<li>Przefiltruj komórki w tubie z nylonową siatką o grubości 35 μm. Ogniwa są teraz gotowe do FACS.</li>
	<li>W przypadku tego protokołu użyj dyszy o rozmiarze 100 μm. Płyn zbierający powinien składać się w 10% z FBS α-MEM. Sortowaną próbkę należy utrzymywać po wymieszaniu i w temperaturze 4 °C przez cały czas sortowania, jeśli to możliwe.</li>
	<li>Przed sortowaniem zoptymalizuj bramkowanie w celu usunięcia artefaktów i komórek, dostosowując obszar rozproszenia bocznego (SSC) i obszar rozproszenia do przodu (FSC). Wyeliminuj dublety, dostosowując szerokość SSC do wysokości SSC i obszar FSC do szerokości FSC. Osteocyty GFP-ujemne powinny być używane jako kontrola w celu dostosowania parametrów przyrządu sortującego.</li>
	<li>Po zakończeniu pobierania komórek odwirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Umyć komórki PBS. Odwirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki i dostosuj ich liczbę zgodnie z potrzebami, używając 10% FBS α-MEM.</li>
</ol>

<ol><li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+and+death+of+bone+cells%3A+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+osteovision%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Osteocyte%3A+An+Endocrine+Cell+...+and+More%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li>
<li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li>
<li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li>
<li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li>
<li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line%2C+MLO-Y4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li>
<li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li>
<li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li>
<li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+%28TSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation%2C+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li>
<li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li>
<li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li>
<li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li>
<li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalleux%2C+C+%22Bone+Research+Protocols%22">Bone Research Protocols</a>. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).</li>
<li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedizinische+Technik+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pierwszy wyizolowany osteocyt pochodził z kalwariikurczaka 7 wyizolowanej przy użyciu (OB7.3) lub wariantu ptasiego PHEX; Jednak metoda ta jest ograniczona dostępnością zdolnych do działania przeciwciał, ponieważ konieczne jest wyprodukowanie przeciwciał specyficznych dla osteocytów, które są również specyficzne dla danego gatunku. Naukowcy zastosowali inną modyfikację sekwencyjnego procesu enzymatycznego w celu uzyskania osteocytów z kości długich myszy i szczurów; Deklarowaną czystość tych kultu...

Osteocyty to ostatecznie zróżnicowane komórki z komórek progenitorowych osteoblastów, które zostały osadzone w ich wydzielanej macierzy1. Są to najliczniejsze i najdłużej żyjące komórki wśród populacji komórek kostnych. Znajdują się w lukach i mają charakterystyczną morfologię gwiaździstą z dendrytami, które rozciągają się przez kanały zwane kanalikami, tworząc rozległą sieć komunikacji i wymiany metabolicznej z otaczającym je środowiskiem i powierzchnią kości2. Osteocyty odgrywają zarówno rolę osteoblastów, jak i osteoklastów w przebudowie kości, są podstawowymi komórkami mechanosensorycznymi nadającymi adaptację do obciążenia mechanicznego3, biorą udział w homeostazie fosforanów4 i mineralizacji macierzy kostnej5, a wraz z układem lacunokanicznym działają jako narząd dokrewny sygnalizujący odległe tkanki6.
Osteocyty znajdują się w zmineralizowanej matrycy, co ogranicza dostępność i utrudnia ich izolację, utrudniając tym samym badania in vitro. Jedna z pierwszych metod izolacji opisywała izolowane osteocyty z kalwarii kurczaka przy użyciu przeciwciała monoklonalnego specyficznego dla osteocytów (OB7.3)7, które później okazało się być ptasim wariantem PHEX (gen regulujący PHosphate, z homologią do endopeptydaz na chromosomie X)8. Inni badacze zastosowali sekwencyjne trawienie szczurów9 lub mouse10 długich kości, aby uzyskać frakcje bogate w osteocyty, w których czystość osteocytów wynosiła około 70%9. Ograniczenia tej procedury obejmują nieoptymalną czystość kultur zanieczyszczonych innymi typami komórek poza osteocytami oraz to, że osteocyty mogą być potencjalnie przerastane przez inne komórki w hodowli, ponieważ osteocyty utraciły zdolność do podziału. Wyzwania te ograniczają użyteczność kultur długoterminowych.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stworzono różne linie komórkowe osteocytów. MLO-Y4 cell line11 i MLO-A5 cell line12 są w szczególności najczęściej badanymi liniami komórkowymi, które są przydatne do badania osteocytów we wczesnym stadium; jednak są one mniej przydatne do badania sygnalizacji dojrzałych osteocytów, ponieważ wyrażają niskie poziomy sklerostyny i FGF2313, z których oba są dojrzałymi markerami osteocytów. Inne linie komórkowe, w tym IDG-SW314 i Ocy45415, wyrażają wysoki poziom sklerostyny i FGF23 i są przydatne w badaniu późnego stadium osteocytów. Linie komórkowe okazują się użytecznymi narzędziami badawczymi; Niemniej jednak nie są one pozbawione ograniczeń, ponieważ nie reprezentują w pełni biologii komórki pierwotnej. Różne linie komórkowe reprezentują różne etapy rozwoju spektrum dojrzałości osteocytów, a linie komórkowe nie reprezentują heterogeniczności pierwotnych osteocytów16,17.
Aby uzyskać czyste kultury pierwotnych osteocytów, badacze wykorzystali mysi model cre, w którym 8-kb promotor dmp1 jest używany do napędzania ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) w osteocytach18,19. Podwójne myszy transgeniczne (pOB-Col 2.3-GFP-cyjan i DMP1-GFP-topaz) autorstwa Paic et al.19 i transgeniczne myszy dmp1-topaz autorstwa Nakashima et al.20 zostały wykorzystane do uzyskania populacji osteocytów. W którym zastosowali sekwencyjne trawienie i FACS osteocytów eksprymujących GFP, aby uzyskać kultury pierwotnych osteocytów19,20. Wykazano, że kierunek cre w 10-kb myszy reporterowej dmp1 Ai9, która aktywuje białko tdTomato, jest obecny w osteocytach, osteoblastach, mięśniach i komórkach szpiku kostnego. Promotor dmp1 8 kb miał ten sam wzorzec ekspresji, ale tylko część osteoblastów i komórek szpiku kostnego wyrażała białko, co wskazuje, że promotor dmp1 8 kb jest bardziej specyficzny21. Mimo to wyniki uzyskane przy użyciu promotora dmp1 8 kb powinny być interpretowane z ostrożnością, a profile ekspresji genów powinny być rutynowo przeprowadzane przy użyciu markerów specyficznych dla osteocytów i osteoblastów, aby zapewnić, że uzyskana populacja ma wystarczająco wysoką czystość.
Markery osteoklastów OSCAR i Dcstamp zostały znalezione w populacjach hematopoetycznych osteocytów niezubożonych i zubożonych, to odkrycie doprowadziło autorów do wniosku, że trawy uzyskane z frakcjonowania kalwarii noworodkowej 8-kb DMP1-Topaz i sortowania GFP są zanieczyszczone komórkami hematopoetycznymi. Zanieczyszczenie komórkami hematopoetycznymi można było złagodzić, zacieśniając bramkę sortowania GFP, ponieważ komórki krwiotwórcze GFP-dodatnie miały znacznie niższą intensywność GFP niż komórki mezenchymalne (osteocyty) GFP-dodatnie22.
Metody badania osteocytów in vitro przyczyniły się do powstania ostatnio bogatej informacji na temat biologii osteocytów. Jednak izolacja osteocytów pozostaje pracochłonną i długotrwałą procedurą o niskiej wydajności komórek. Opisana metoda trawienia kości z użyciem kolagenazy i EDTA, często do frakcji 823, zajmuje kilka godzin, w których żywotność osteocytów jest obciążona. Naukowcy poinformowali o użyciu frakcji (2\u20125) do sortowania komórek20 i wykazali, że profil ekspresji genów związanych z osteocytami w porównaniu z profilami osteoblastów potwierdza sukces izolacji populacji czystych osteocytów20. W artykule opisano proces otrzymywania frakcji (2\u20125) oraz porównano wydajność osteocytów z każdej frakcji począwszy od frakcji 1 do 8, aby określić zwrot osteocytów w każdej frakcji. Opisano również preparację nowonarodzonej kalwarii myszy dmp1-topaz i trawienie kalwaryczne za pomocą kolagenazy i kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), a także przygotowanie komórek do FACS.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie BD FACSDiva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Akwizycja i analiza danych</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>12 x 75 mm Probówka z nasadką sitka komórkowego, 35 &mu; m nylonowa siatka.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Wako, Osaka, Japonia</td><td>034-22363</td><td>0,2% (w/v), surowa mieszanka kolagenazy pozyskiwana z C. histolyticum.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japonia</td><td></td><td>5mM EDTA przygotowany z 0,1% BSA</td></tr><tr><td>FACSAriaTM II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, Francja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> izolacyjny <td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0,1% (w/v) BSA, 0,5% (w/v) glukozy i 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Millex Sterylny filtr</td><td>Merck Millipore, Irlandia</td><td>SLGV033RS</td><td>0,22 mln euro; m</td></tr><tr><td>Nylonowy sitko komórkowe</td><td>FALCON, NY, USA</td><td></td><td>40&mu; m</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies, NY, USA</td><td></td><td>0,5% x10. rozcieńczony do x1 w PBS</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Wako, Osaka, Japonia</td><td></td><td>Zawierający 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 j.m./ml penicyliny G i 100 &mu; g/ml streptomycyny</td></tr></tbody></table>

uzyskiwanie pierwotnych osteocytów poprzez mysie frakcjonowanie kalwaryjne osteocytów eksprymujących gfp

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Osteocyt, kiedyś uważany za pasywnego mieszkańca kości, ze względu na funkcję wykrywania obciążenia mechanicznego za kulisami, teraz znalazł się w centrum uwagi i wykazano, że pełni wiele głównych funkcji, takich jak aktywne modyfikowanie macierzy zewnątrzkomórkowej i tworzenie narządu endokrynnego z systemem lacunocanalicular system, który go otacza, wysyłając wiadomości do odległych miejsc. Dzięki metodom, które umożliwiły badanie osteocytów in vitro od wyizolowania pierwotnych osteocytów do linii komórkowych podobnych do osteocytów, osteocyty cieszą się obecnie ogromnym zainteresowaniem i gwałtownym wzrostem wiedzy na temat budowy i funkcji. Wiele aspektów biologii osteocytów i interakcji z innymi składnikami molekularnymi nie zostało jeszcze odkrytych. W tym protokole szczegółowo opisujemy skuteczną izolację pierwotnych osteocytów z kalwarii noworodków myszy dmp1-topaz, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne w osteocytach, poprzez frakcjonowanie komórek, a następnie pozyskiwanie kultur pierwotnych osteocytów przez FACS.

Celem niniejszego protokołu jest zaprezentowanie procesu pozyskiwania kultur pierwotnych osteocytów z czaszki noworodka myszy dmp1-topaz poprzez proces frakcjonowania z wykorzystaniem kolagenazy do degradacji macierzy kolagenowej oraz EDTA do chelatacji wapnia, po czym komórki są przygotowywane do analizy FACS w celu odseparowania osteocytów od innych populacji komórkowych.
Metody pozyskiwania pierwotnych osteocytów z czaszek noworodków myszy często opisują zastosowanie frakcji (1‒8) do sortow...

Ten protokół opisuje rozbiór kalwarii myszy dmp1-topaz u noworodków i izolację osteocytów wyrażających białko zielonej fluorescencji poprzez trawienie i frakcjonowanie komórek, a także przygotowanie osteocytów do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).

Uzyskiwanie pierwotnych osteocytów poprzez mysie frakcjonowanie kalwaryjne osteocytów eksprymujących GFP

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

Pierwotna izolacja osteocytów jest długotrwałą procedurą, która często pomija się w obszarach o niskiej liczbie komórek. Protokół ten zapewnia skuteczne metody izolowania dużej liczby pierwotnych osteocytów wykazujących ekspresję GFP. Protokół ten skraca czas obsługi i pozwala na uzyskanie większej liczby osteocytów w jednej procedurze przy minimalnym zanieczyszczeniu komórkami krwiotwórczymi lub mezenchymalnymi.W celu wyizolowania osteocytów wykazujących ekspresję GFP, należy umieścić poddane eutanazji transgeniczne młode myszy w szóstym do siódmym dniu po urodzeniu w niepoddanym działaniu metody hodowli naczyniu hodowlanym i za pomocą nożyczek i pęsety chwycić skórę u podstawy czaszki. Użyj nożyczek, aby wykonać wstępne nacięcie w uniesionej skórze, a następnie nacięcia po obu stronach czaszki przed uszami. Usuń skórę, aby odsłonić kalwarię i trzymając głowę od grzbietu nosa, przeciąć kalwarię wzdłuż szwu lamboidalnego i wzdłuż krawędzi kości ciemieniowych do przedniej części tkanki.Oddziel kalwarię od leżącej pod nią tkanki mózgowej i umieść kości wklęsłą stroną do góry w PBS. Aby uzyskać frakcję pierwszą, zbierz do pięciu kalwarii na 50-mililitrową probówkę w pięciu mililitrach świeżo przygotowanej kolagenazy o proporcji dwóch miligramów na mililitr i inkubuj tkanki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 300 obrotów na minutę przez 20 minut. Pod koniec inkubacji wyrzucić trawizm z frakcji pierwszej i przemyć kalwarię pięcioma mililitrami PBS.Zastąp płukanie pięciomililitrowym pięciomilimolowym EDTA uzupełnionym jednym miligramem na mililitr albuminy surowicy bydlęcej w PBS przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem. Pod koniec inkubacji przenieś trawienie do 50-mililitrowej stożkowej probówki i umyj cielęcie pięcioma mililitrami PBS. Następnie przenieś roztwór myjący do roztworu do roztworu mineralnego.Aby uzyskać frakcję drugą, należy umieścić trawik do odwirowania i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad w ośmiu mililitrach minimum alfa niezbędnej pożywki zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS i antybiotyki, a następnie wysiać komórki na 10-centymetrową szalkę hodowlaną. Następnie umieść frakcję dwóch komórek w inkubatorze do hodowli komórkowych.Po zebraniu i wyhodowaniu frakcji trzeciej i czterech, jak właśnie pokazano. Inkubować cielę w pięciu mililitrach pięciomilimolowego EDTA uzupełnionego jednym miligramem na mililitr albuminy surowicy bydlęcej w PBS przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem. Pod koniec inkubacji zbierz i pohoduj frakcję piątą, jak pokazano dla frakcji drugiej, trzeciej i czterech.Natychmiast po frakcjonowaniu zbierz komórki do sortowania. Alternatywnie, zbierz komórki po 24 godzinach hodowli, odsysając pożywkę i delikatnie umyj komórki dwa razy 10 mililitrami PBS na naczynie na pranie. Po drugim praniu potraktuj komórki pięcioma mililitrami 0,5% trypiny EDTA w PBS na płytkę.Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodać pięć mililitrów kompletnej pożywki dla minimum alfa do każdej płytki i delikatnie odłączyć komórki, pipetując. Aby połączyć komórki w każdej frakcji, przefiltruj zawiesiny komórek przez sitko do komórek o średnicy 40 mikronów do pojedynczej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Po umyciu komórek 10 mililitrami PBS dodaj je do probówki.Przefiltruj komórki przez sitko i zbierz komórki przez odwirowanie. Po granulowaniu komórek ponownie zawiesić osad w kompletnym minimalnym niezbędnym podłożu do jednego razy od 10 do siódmych komórek na mililitr stężenia pożywki i przefiltrować komórki przez rurkę z nylonową siatką o grubości 35 mikronów. Aby przetestować skuteczność tej metody, frakcje sortowano oddzielnie i hodowano przez 24 godziny, aby określić procent i wydajność osteocytów z każdej frakcji.Gęstość osteocytów we frakcjach od drugiej do piątej była wyższa niż obserwowana dla frakcji pierwszej i znacznie zmniejszyła się we frakcjach szóstej, siódmej i ósmej. Chociaż odsetek osteocytów uzyskany między wszystkimi frakcjami nie jest statystycznie istotny, gęstość osteocytów różni się dramatycznie między frakcjami. W tym miejscu przedstawiono strategię bramkowania polegającą na izolowaniu osteocytów GFP-dodatnich od ich odpowiedników GFP-ujemnych poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją.Po posortowaniu osteocyty można przeanalizować pod kątem ekspresji interesujących markerów osteocytów. W tej analizie geny markerów osteocytów ulegały ekspresji na wyższych poziomach w izolowanych osteocytach GFP-dodatnich w porównaniu z frakcją wstępną drugą, która jest znana jako frakcja o wysokiej zawartości osteoblastów. Tutaj można zaobserwować morfologię osteocytu GFP-dodatniego zachowującego gwiaździsty kształt z dendrytami wystającymi z ciała komórki po 24 godzinach hodowli na plastikowej szalce hodowlanej, po sortowaniu.Zwróć uwagę podczas zasysania trawien, ponieważ calveria zostanie zredukowana do drobnych granulek. Pamiętaj, aby użyć aspiratora z małą końcówką, aby uniknąć utraty komórek. Osteocyty są enigmatyczne, ponieważ są zakopane w kościach.Technika ta utorowała drogę do badania interakcji molekularnych osteocytów i ich kontroli nad osteoklastami i osteoblastami.

obtaining-primary-osteocytes-through-murine-calvarial-fractionation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilościowy pomiar funkcji progenitora kości w gojeniu złamań wymaga technologii obrazowania seryjnego o wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu przedstawiono protokoły wykorzystujące mikroskopię przyżyciową i śledzenie linii kostnych w celu sekwencyjnego obrazowania i ilościowego określenia migracji, proliferacji i różnicowania endogennych osteogennych komórek macierzystych / progenitorowych w procesie naprawy złamań kości.

Sekwencyjne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań

Leczenie pierwotnych osteoblastów myszy kwasem retinowym wytwarza jednorodną populację rozgałęzionych komórek posiadających morfologiczne i molekularne cechy osteocytów. Metoda ta pozwala przezwyciężyć trudności związane z uzyskaniem i utrzymaniem pierwotnych osteocytów w hodowli i może być korzystna w badaniu komórek pochodzących z modeli transgenicznych.

Zastosowanie kwasu retinowego do uzyskiwania kultur osteocytów z pierwotnych osteoblastów myszy

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

W tym artykule prezentujemy metody izolowania i różnicowania komórek zrębu szpiku kostnego i hematopoetycznych komórek macierzystych od kości długich myszy. Przedstawiono dwa różne protokoły dające różne populacje komórek odpowiednie do ekspansji i różnicowania w osteoblasty, adipocyty i osteoklasty.

Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Osteoklasty to specyficzne tkankowo polikariony makrofagów wywodzące się z linii monocyty-makrofag hematopoetycznych komórek macierzystych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób izolować komórki szpiku kostnego, aby uzyskać duże ilości osteoklastów przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka wypadków występujących przy tradycyjnych metodach.

Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Ten protokół opisuje wykrywanie migracji komórek macierzystych okostnej szkieletu za pośrednictwem CCL5 w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii intravital żywych zwierząt.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym indukowanej przez CCL5 migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy

Opisujemy tutaj metodę obrazowania megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kości czaszki żywych myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy

Obecny artykuł opisuje wykonywanie metody obrazowania przyżyciowego w celu obserwacji mechanicznie indukowanej sygnalizacji wapniowej osadzonych osteocytów in vivo w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na mechaniczne obciążenie trzeciej kości śródstopia myszy na poziomie tkankowym.

Fluorescencyjne obrazowanie przyżyciowe w celu zbadania dynamiki sygnalizacji wapniowej wywołanej obciążeniem w osteocytach myszy

To badanie przedstawia metodę wizualizacji i rozwoju trójwymiarowych (3D) modeli osteocytów w sieci lacunarno-kanalicznej (LCN) do analizy obliczeniowej dynamiki płynów (CFD). Wygenerowane modele wykorzystujące tę metodę pomagają zrozumieć mechanosensację osteocytów w zdrowych lub chorych kościach.

Analiza i obrazowanie osteocytów

Mikroskopia przyżyciowa umożliwia badanie dynamicznych procesów biologicznych, takich jak regeneracja tkanek i rozwój guza. Szpik kostny kalwarii, wysoce dynamiczna tkanka, oferuje wgląd w hematopoezę i funkcję naczyń krwionośnych. Korzystanie z biokompatybilnego, wydrukowanego w 3D implantu mocującego głowę pozwala na powtarzalne obrazowanie podłużne, zwiększając naszą wiedzę na temat dynamiki tkanek i mikrośrodowiska guza.

Przyżyciowe obrazowanie podłużne dynamiki naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej

Poznaj metodę izolacji pierwotnych osteocytów eksprymujących GFP z myszy dmp1-topaz przy użyciu FACS. Protokół zmniejsza czas manipulacji i zwiększa wydajność uzyskiwania komórek z minimalnym zanieczyszczeniem.

Uzyskiwanie pierwotnych osteocytów poprzez mysie frakcjonowanie kalwaryjne osteocytów eksprymujących GFP

Przeglądaj więcej filmów