Wykorzystanie zmętnienia i tromboelastografii do charakterystyki skrzepów komplementarnych
June 4th, 2020
Fibryna jest odpowiedzialna za tworzenie skrzepów podczas hemostazy i zakrzepicy. Testy zmętnienia i małozakrzepowości (TEG) mogą być wykorzystywane jako narzędzia synergiczne, które zapewniają komplementarną ocenę skrzepu. Te dwie techniki razem mogą dać lepszy wgląd w to, jak warunki krzepnięcia wpływają na tworzenie skrzepów fibryny.
Tromboelastografia i testy zmętnienia to dwie proste i charakterystyczne metody charakteryzacji skrzepów. Techniki te razem oferują bardziej wszechstronne zrozumienie, w jaki sposób zmienne krzepnięcia wpływają na cechy skrzepu. Oba te testy nie tylko oferują analizę skrzepów w punkcie końcowym, ale także przyciągają tworzenie się skrzepów fibryny w czasie, w przeciwieństwie do wielu innych narzędzi do charakteryzacji skrzepów Techniki te mogą pomóc w opracowaniu fizjologicznie istotnej platformy syntetycznych skrzepów, która może zapewnić wiarygodną diagnozę stanu fibrynolitycznego pacjentów z zakrzepicą Aby monitorować zmętnienie skrzepów w czasie, użyj dowolnego dostępnego na rynku spektrometru o zakresie absorbancji od 350 do 700 nanometrów.
Włącz spektrometr i otwórz odpowiednie oprogramowanie analityczne. Następnie wybierz płytę pierwszą i otwórz zakładkę Ustawienia blachy. Kliknij ABS i kinetyczny, aby monitorować absorbancję dynamiczną w czasie.
Wybierz 550 nanometrów w zakładce długości fali, a następnie przejdź do zakładki pomiaru czasu i dostosuj całkowity czas pracy do 60 minut w odstępie 30 sekund, wybierz interesujące Cię studnie, podświetlając je. Odpipetować 140 mikrolitrów PBS do jednego dołka przezroczystej dla promieni UV płytki 96-dołkowej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów trombiny i wymieszaj, natychmiast rozpocznij krzepnięcie, dodając 50 mikrolitrów fibrynogenu do studzienki i pipetuj w górę iw dół pięć razy, używając tylko pierwszego oporu pipety, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków.
Umieść płytkę w uchwycie talerza i kliknij odczyt w oprogramowaniu, aby rozpocząć odczyt zmętnienia. Po zakończeniu odczytu pobierz dane dotyczące zmętnienia i uzyskaj krzywą śledzenia zmętnienia, wykreślając zmiany absorbentów w czasie, wyprowadź maksymalne zmętnienie, biorąc maksymalną wartość absorbancji krzywej w czasie, a następnie oblicz 90% maksymalnego zmętnienia, mnożąc maksymalne zmętnienie przez 0,9. Wyznacz czas do maksymalnego zmętnienia, obliczając czas od zainicjowania skrzepu do 90% maksymalnego zmętnienia.
Włącz tromboelastografię lub analizator TEG i poczekaj, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 37 stopni Celsjusza, a następnie otwórz oprogramowanie TEG i utwórz nazwę eksperymentu w sekcji ID. Kliknij kartę TEG i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby przeprowadzić test eTest dla wszystkich kanałów. Następnie ustaw dźwignię z powrotem w pozycji obciążenia po zakończeniu wszystkich kontroli.
Kliknij przycisk Gotowe na stronie informacyjnej i wprowadź przykładowe informacje o kanałach, które będą używane. Umieść przezroczysty, niepowlekany kubek TEG w odpowiednim kanale. Przesuń nosidełko do góry i naciśnij spód kubka pięć razy, aby przymocować kołek do pręta skrętnego, a następnie opuść nośnik i dociśnij kubek w dół do podstawy, aż usłyszysz kliknięcie.
Odpipetować 20 mikrolitrów roztworu trombiny do kubka TEG, a następnie zainicjować krzepnięcie, dodając 340 mikrolitrów fibrynogenu do kubka, aby uzyskać roztwór krzepnięcia o pojemności 360 mikrolitrów. Wymieszaj zawartość kubka, pipetując pięć razy w górę i w dół. Przesuń pojemnik załadowany kubkiem do góry, przesuń dźwignię do pozycji odczytu i kliknij start w oprogramowaniu, aby rozpocząć odczyt TEG.
Po zakończeniu odczytu pobierz parametry i uzyskaj krzywą śledzenia TEG, wykreślając amplitudę w czasie. Wybierz MA jako maksymalną amplitudę, która wskazuje na odkształcenie skrzepu i TMA jako czas do maksymalnej amplitudy z oprogramowania. Przedstawiono tutaj reprezentatywne zmętnienie i krzywe śledzenia TEG skrzepów fibryny ludzkiej i bydlęcej przy różnych poziomach fibrynogenu.
Krzywe śledzenia pokazują, że po okresie opóźnienia po zainicjowaniu skrzepu, zmętnienie skrzepu lub amplituda skrzepu wzrasta w czasie i wyrównuje się pod koniec tworzenia skrzepu. Maksymalne zmętnienie i czas do maksymalnej mętności to dwa parametry wyprowadzone z zmętnienia, podczas gdy maksymalna amplituda i czas do maksymalnej amplitudy pochodzą z TEG. Przy wyższym poziomie fibrynogenu w roztworze krzepliwym wszystkie cztery wartości wzrastają.
Maksymalne zmętnienie jest optyczną miarą struktury skrzepu, która wskazuje na grubość włókien fibryny i gęstość sieci fibryny. Podczas gdy maksymalna amplituda jest miarą mechaniczną, która odzwierciedla bezwzględne odkształcenie skrzepu, razem wzięte te dwie wartości zapewniają uzupełniający wgląd w mikrostruktury skrzepu. Procedura ta demonstruje uproszczony model krzepnięcia w celu zbadania zmiennych, które głównie wpływają na polimeryzację fibryny.
Model ten można dostosować poprzez włączenie dodatkowych czynników krzepnięcia w celu zbadania innych parametrów. Model krzepnięcia można łatwo modyfikować przy użyciu klinicznych próbek osocza w celu monitorowania tworzenia się skrzepów i rozczarowania w obecności leków przeciwzakrzepowych. Wyniki mogą pomóc w leczeniu pacjentów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
Fibryna odgrywa kluczową rolę w tworzeniu skrzeplin podczas hemostazy i trombozy. Tromboelastografia i badania mętności to dwie uzupełniające się techniki, które poprawiają zrozumienie warunków krzepnięcia i tworzenia się skrzeplin z fibriny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hemostaza
- Tromboza
- Charakterystyka skrzeplin
Tło
- Fibryna jest niezbędna do tworzenia skrzeplin.
- Badania mętności i tromboelastografia dostarczają informacji na temat zmiennych krzepnięcia.
- Metody te pozwalają na dynamiczne monitorowanie tworzenia się skrzeplin.
- Mogą pomóc w opracowaniu syntetycznych platform skrzeplinowych do diagnostyki.
Cel badania
- Charakteryzowanie skrzeplin za pomocą badań mętności i tromboelastografii.
- Zrozumienie, jak zmienne krzepnięcia wpływają na cechy skrzeplin.
- Zapewnienie wiarygodnej diagnozy stanu fibrinolitycznego u pacjentów z zatorowością.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie badań mętności do monitorowania mętności skrzeplin w czasie.
- Zastosowanie tromboelastografii do kompleksowej analizy skrzeplin.
- Wykorzystanie komercyjnie dostępnych spektrofotometrów do pomiaru absorbancji.
- Dynamiczne monitorowanie absorbancji za pomocą oprogramowania analitycznego.
Główne wyniki
- Obie techniki zapewniają analizę końcową skrzeplin i dynamiczne monitorowanie.
- Ujawniają, jak warunki krzepnięcia wpływają na tworzenie się skrzeplin z fibriny.
- Uzyskane informacje mogą prowadzić do ulepszonych platform diagnostycznych.
- Te metody są odrębne, ale synergiczne w ocenie cech skrzeplin.
Wnioski
- Badania mętności i tromboelastografia są skuteczne w charakteryzowaniu skrzeplin.
- Łączenie tych metod poprawia zrozumienie zmiennych krzepnięcia.
- Mogą przyczynić się do lepszych podejść diagnostycznych w przypadku zatorowości.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Integrating turbidity and thromboelastography (TEG) enables biopharma teams to achieve comprehensive clot characterization, supporting both structural and mechanical assessment of fibrin formation. This dual-assay approach enhances predictive confidence in early thrombosis research and informs risk-adjusted decisions for therapeutic development. The method's adaptability to diverse clotting conditions and sample types positions it as a reusable capability across discovery and translational workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of fibrin polymerization mechanisms under controlled conditions.
- Supports biological de-risking by distinguishing structural versus mechanical clot properties.
- Facilitates predictive confidence in target validation for thrombosis-related pathways.
Screening & Assay Development
- Prepares validated clot models for downstream compound screening and mechanistic studies.
- Delivers standardized, quantitative outputs for reproducible assay development.
- Enables scalable, high-throughput assessment of clot-modifying agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro clot models with disease-relevant parameters for translational continuity.
- Supports evaluation of antithrombotic drug effects in physiologically relevant systems.
- Provides mechanistic de-risking for preclinical candidate advancement.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-assay platform bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling robust clot characterization across the R&D continuum.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on fibrin structure-function relationships and pathway modulation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Delivers dynamic measurements of clot formation kinetics and mechanical strength for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates adaptation to clinical plasma samples and drug response studies.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, modifiable platform for diverse clotting models and research objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in clot biology.
- Operational Value: Promotes assay standardization, reproducibility, and scalability across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of thrombosis-related assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in clot biology and assay operation.
- Needs access to spectrometers (350–700 nm) and TEG analyzers with compatible software.
- Demands cross-team standardization of protocols and data analysis.
- Allows adaptation to various model systems and clinical sample types.
- Dependent on careful control of clotting variables for reproducible outputs.
