Wykorzystanie zmętnienia i tromboelastografii do charakterystyki skrzepów komplementarnych
4 czerwca 2020
Fibryna jest odpowiedzialna za tworzenie skrzepów podczas hemostazy i zakrzepicy. Testy zmętnienia i małozakrzepowości (TEG) mogą być wykorzystywane jako narzędzia synergiczne, które zapewniają komplementarną ocenę skrzepu. Te dwie techniki razem mogą dać lepszy wgląd w to, jak warunki krzepnięcia wpływają na tworzenie skrzepów fibryny.
Tromboelastografia i testy zmętnienia to dwie proste i charakterystyczne metody charakteryzacji skrzepów. Techniki te razem oferują bardziej wszechstronne zrozumienie, w jaki sposób zmienne krzepnięcia wpływają na cechy skrzepu. Oba te testy nie tylko oferują analizę skrzepów w punkcie końcowym, ale także przyciągają tworzenie się skrzepów fibryny w czasie, w przeciwieństwie do wielu innych narzędzi do charakteryzacji skrzepów Techniki te mogą pomóc w opracowaniu fizjologicznie istotnej platformy syntetycznych skrzepów, która może zapewnić wiarygodną diagnozę stanu fibrynolitycznego pacjentów z zakrzepicą Aby monitorować zmętnienie skrzepów w czasie, użyj dowolnego dostępnego na rynku spektrometru o zakresie absorbancji od 350 do 700 nanometrów.
Włącz spektrometr i otwórz odpowiednie oprogramowanie analityczne. Następnie wybierz płytę pierwszą i otwórz zakładkę Ustawienia blachy. Kliknij ABS i kinetyczny, aby monitorować absorbancję dynamiczną w czasie.
Wybierz 550 nanometrów w zakładce długości fali, a następnie przejdź do zakładki pomiaru czasu i dostosuj całkowity czas pracy do 60 minut w odstępie 30 sekund, wybierz interesujące Cię studnie, podświetlając je. Odpipetować 140 mikrolitrów PBS do jednego dołka przezroczystej dla promieni UV płytki 96-dołkowej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów trombiny i wymieszaj, natychmiast rozpocznij krzepnięcie, dodając 50 mikrolitrów fibrynogenu do studzienki i pipetuj w górę iw dół pięć razy, używając tylko pierwszego oporu pipety, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków.
Umieść płytkę w uchwycie talerza i kliknij odczyt w oprogramowaniu, aby rozpocząć odczyt zmętnienia. Po zakończeniu odczytu pobierz dane dotyczące zmętnienia i uzyskaj krzywą śledzenia zmętnienia, wykreślając zmiany absorbentów w czasie, wyprowadź maksymalne zmętnienie, biorąc maksymalną wartość absorbancji krzywej w czasie, a następnie oblicz 90% maksymalnego zmętnienia, mnożąc maksymalne zmętnienie przez 0,9. Wyznacz czas do maksymalnego zmętnienia, obliczając czas od zainicjowania skrzepu do 90% maksymalnego zmętnienia.
Włącz tromboelastografię lub analizator TEG i poczekaj, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 37 stopni Celsjusza, a następnie otwórz oprogramowanie TEG i utwórz nazwę eksperymentu w sekcji ID. Kliknij kartę TEG i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby przeprowadzić test eTest dla wszystkich kanałów. Następnie ustaw dźwignię z powrotem w pozycji obciążenia po zakończeniu wszystkich kontroli.
Kliknij przycisk Gotowe na stronie informacyjnej i wprowadź przykładowe informacje o kanałach, które będą używane. Umieść przezroczysty, niepowlekany kubek TEG w odpowiednim kanale. Przesuń nosidełko do góry i naciśnij spód kubka pięć razy, aby przymocować kołek do pręta skrętnego, a następnie opuść nośnik i dociśnij kubek w dół do podstawy, aż usłyszysz kliknięcie.
Odpipetować 20 mikrolitrów roztworu trombiny do kubka TEG, a następnie zainicjować krzepnięcie, dodając 340 mikrolitrów fibrynogenu do kubka, aby uzyskać roztwór krzepnięcia o pojemności 360 mikrolitrów. Wymieszaj zawartość kubka, pipetując pięć razy w górę i w dół. Przesuń pojemnik załadowany kubkiem do góry, przesuń dźwignię do pozycji odczytu i kliknij start w oprogramowaniu, aby rozpocząć odczyt TEG.
Po zakończeniu odczytu pobierz parametry i uzyskaj krzywą śledzenia TEG, wykreślając amplitudę w czasie. Wybierz MA jako maksymalną amplitudę, która wskazuje na odkształcenie skrzepu i TMA jako czas do maksymalnej amplitudy z oprogramowania. Przedstawiono tutaj reprezentatywne zmętnienie i krzywe śledzenia TEG skrzepów fibryny ludzkiej i bydlęcej przy różnych poziomach fibrynogenu.
Krzywe śledzenia pokazują, że po okresie opóźnienia po zainicjowaniu skrzepu, zmętnienie skrzepu lub amplituda skrzepu wzrasta w czasie i wyrównuje się pod koniec tworzenia skrzepu. Maksymalne zmętnienie i czas do maksymalnej mętności to dwa parametry wyprowadzone z zmętnienia, podczas gdy maksymalna amplituda i czas do maksymalnej amplitudy pochodzą z TEG. Przy wyższym poziomie fibrynogenu w roztworze krzepliwym wszystkie cztery wartości wzrastają.
Maksymalne zmętnienie jest optyczną miarą struktury skrzepu, która wskazuje na grubość włókien fibryny i gęstość sieci fibryny. Podczas gdy maksymalna amplituda jest miarą mechaniczną, która odzwierciedla bezwzględne odkształcenie skrzepu, razem wzięte te dwie wartości zapewniają uzupełniający wgląd w mikrostruktury skrzepu. Procedura ta demonstruje uproszczony model krzepnięcia w celu zbadania zmiennych, które głównie wpływają na polimeryzację fibryny.
Model ten można dostosować poprzez włączenie dodatkowych czynników krzepnięcia w celu zbadania innych parametrów. Model krzepnięcia można łatwo modyfikować przy użyciu klinicznych próbek osocza w celu monitorowania tworzenia się skrzepów i rozczarowania w obecności leków przeciwzakrzepowych. Wyniki mogą pomóc w leczeniu pacjentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Fibryna odgrywa kluczową rolę w tworzeniu skrzepów podczas hemostazy i zakrzepicy. Tromboelastografia oraz testy mętności to dwie komplementarne techniki, które pozwalają lepiej zrozumieć warunki krzepnięcia oraz proces tworzenia się skrzepu fibrynowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hemostaza
- Zakrzepica
- Charakterystyka skrzepu
Wstęp
- Fibryna jest niezbędna do tworzenia skrzepów.
- Testy mętności oraz tromboelastografia dostarczają informacji na temat zmiennych krzepnięcia.
- Metody te umożliwiają dynamiczne monitorowanie tworzenia skrzepu.
- Mogą one pomóc w opracowaniu syntetycznych platform skrzepów do celów diagnostycznych.
Cel badania
- Charakterystyka skrzepów z wykorzystaniem testów mętności i tromboelastografii.
- Zrozumienie wpływu czynników krzepnięcia na cechy skrzepu.
- Zapewnienie wiarygodnej diagnozy stanu fibrynolitycznego u pacjentów z zakrzepicą.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie testów mętności do monitorowania mętności skrzepu w czasie.
- Zastosowanie tromboelastografii do kompleksowej analizy skrzepu.
- Użycie dostępnych komercyjnie spektrometrów do pomiaru absorbancji.
- Dynamiczne monitorowanie absorbancji przy użyciu oprogramowania analitycznego.
Główne wyniki
- Obie techniki zapewniają analizę końcową skrzepu oraz monitorowanie dynamiczne.
- Ujawniają one, w jaki sposób warunki krzepnięcia wpływają na tworzenie się skrzepu fibryny.
- Zdobyta wiedza może prowadzić do udoskonalenia platform diagnostycznych.
- Metody te są odmienne, a jednocześnie synergistyczne w ocenie charakterystyki skrzepów.
Wnioski
- Testy mętności oraz tromboelastografia są skutecznymi metodami charakterystyki skrzepu.
- Połączenie tych metod pozwala na lepsze zrozumienie zmiennych procesu krzepnięcia.
- Mogą one przyczynić się do opracowania lepszych podejść diagnostycznych w zakrzepicy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Integracja pomiaru mętności oraz tromboelastografii (TEG) umożliwia zespołom biofarmaceutycznym kompleksową charakterystykę skrzepu, wspierając zarówno strukturalną, jak i mechaniczną ocenę tworzenia się fibryny. To podwójne podejście analityczne zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad wczesną zakrzepicą i pozwala na podejmowanie decyzji skorygowanych o ryzyko w procesie rozwoju terapeutyków. Adaptacyjność tej metody do różnorodnych warunków krzepnięcia i typów próbek sprawia, że stanowi ona narzędzie możliwe do wielokrotnego wykorzystania w przepływach pracy na etapie odkrywania leków oraz w badaniach translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów polimeryzacji fibryny w kontrolowanych warunkach.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez rozróżnienie strukturalnych i mechanicznych właściwości skrzepu.
- Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów dla szlaków związanych z zakrzepicą.
Przesiewanie i rozwój testów
- Przygotowuje zwalidowane modele skrzepów do dalszego przesiewania związków oraz badań mechanistycznych.
- Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wyniki niezbędne do odtwarzalnego opracowania testów.
- Umożliwia skalowalną, wysokoprzepustową ocenę czynników modyfikujących skrzepy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje in vitro modele skrzepów do parametrów istotnych dla danej choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera ocenę efektów leków przeciwzakrzepowych w systemach istotnych fizjologicznie.
- Zapewnia mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie wdrażania kandydatów w fazie przedklinicznej.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ta platforma z dwoma rodzajami analiz łączy wczesny etap odkryć, identyfikację związków wiodących oraz badania przedkliniczne, umożliwiając rzetelną charakterystykę skrzepów na każdym etapie procesu badań i rozwoju.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących relacji między strukturą a funkcją fibryny oraz modulacji szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty do oceny związków i standaryzacji testów.
- Analityka: Dostarcza dynamicznych pomiarów kinetyki tworzenia skrzepu i wytrzymałości mechanicznej do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Ułatwia adaptację do klinicznych próbek osocza oraz badań nad odpowiedzią na leki.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Oferuje elastyczną, modyfikowalną platformę dla różnorodnych modeli krzepnięcia i celów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w biologii skrzepu.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji, odtwarzalności i skalowalności testów w różnych zespołach.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez ograniczanie ryzyka w programach na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów związanych z zakrzepicą.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biologii skrzepów oraz obsługi testów.
- Wymaga dostępu do spektrometrów (350–700 nm) i analizatorów TEG z kompatybilnym oprogramowaniem.
- Wymaga standaryzacji protokołów i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Umożliwia adaptację do różnych systemów modelowych i typów próbek klinicznych.
- Zależne od starannej kontroli zmiennych krzepnięcia w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
