Name: Sondowanie kinetyki mRNA w czasie i przestrzeni u Escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj dwukolorową hybrydyzację fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ do badania kinetyki transkrypcji i degradacji mRNA u Escherichia coli. Metoda umożliwia jednoczesne przetwarzanie 48 próbek w ciągu ośmiu godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten protokół został opracowany przez S.K. podczas jej badań podoktoranckich w laboratorium dr Christine Jacobs-Wagner w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa i Instytucie Nauk Mikrobiologicznych na Uniwersytecie Yale. Dziękujemy dr Jacobs-Wagner i członkom jej laboratorium za różnorodny wkład podczas opracowywania metody oraz Laurze Troyer za krytyczną lekturę manuskryptu. SK dziękuje za wsparcie ze strony programu Searle Scholars; K.V. dziękuje za wsparcie przyznane przez Uniwersytet Illinois nagrodzie James Scholar Preble Research Award.

<ol><li>Bervoets, I., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+versatility+and+complexity+of+bacterial+gene+regulation+mechanisms%3A+opportunities+and+drawbacks+for+applications+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).</li>
<li>Epshtein, V., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+RNA+polymerase+molecules+in+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation.</a> Science. 300 (5620), 801-805 (2003).</li>
<li>Vogel, U., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+chain+elongation+rate+in+Escherichia+coli+depends+on+the+growth+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).</li>
<li>Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+dystrophin+gene+requires+16+hours+to+be+transcribed+and+is+cotranscriptionally+spliced%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced.</a> Nature Genetics. 9, 184(1995).</li>
<li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16, 1128(2009).</li>
<li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li>
<li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li>
<li>Pérez-Ortín, J. E., Medina, D. A., Chávez, S., Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+you+mean+by+transcription+rate%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">What do you mean by transcription rate.</a> BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li>
<li>Kuchina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+single-cell+RNA+sequencing+by+split-pool+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding.</a> BioRxiv. , 869248(2019).</li>
<li>Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotic+single-cell+RNA+sequencing+by+in+situ+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing.</a> Nature Microbiology. , (2020).</li>
<li>Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Montero Llopis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).</li>
<li>So, L. -h, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).</li>
<li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li>
<li>Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+architecture+dictates+cell-to-cell+variability+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression.</a> Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).</li>
<li>Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantitative+measurement+of+transcriptional+kinetic+parameters+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo.</a> Nucleic Acids Research. 44 (18), 142(2016).</li>
<li>Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Distance+Cooperative+and+Antagonistic+RNA+Polymerase+Dynamics+via+DNA+Supercoiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling.</a> Cell. 179 (1), 106-119 (2019).</li>
<li>Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+transcription+at+a+single+gene+copy+reveals+hidden+drivers+of+bacterial+individuality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality.</a> Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).</li>
<li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJoo%2C+C+%22Labeling+DNA+%28or+RNA%29+for+single-molecule+FRET%22">Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET</a>. 2012 (9), Cold Spring Harbor. 1005-1008 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Standard+Ethanol+Precipitation+of+DNA+in+Microcentrifuge+Tubes%22">Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes</a>. 2006 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 4456(2006).</li>
<li>Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li>
<li>Adesnik, M., Levinthal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+and+degradation+of+lactose+operon+messenger+RNA+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).</li>
<li>Campbell, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+for+rifampicin+inhibition+of+bacterial+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase.</a> Cell. 104 (6), 901-912 (2001).</li>
<li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaj%2C+A+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Walter, N. G. 472, Academic Press. 365-386 (2010).</li>
<li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).</li>
<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+an+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).</li>
<li>Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoffitt%2C+JR+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. 572, Academic Press. 1-49 (2016).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+gene+expression+in+live+cells%2C+one+protein+molecule+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time.</a> Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).</li>
<li>Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+mRNA+degradation+and+transcript+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli.</a> Molecular Systems Biology. 11 (1), 781(2015).</li>
<li>Vogel, U., Sørensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreasing+transcription+elongation+rate+in+Escherichia+Coli+exposed+to+amino+acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation.</a> Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+and+translation+contribute+to+gene+locus+relocation+to+the+nucleoid+periphery+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli.</a> Nature Communications. 10 (1), 5131(2019).</li>
<li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li>
<li>Fontenete, S., Guimarães, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+melting+temperatures+in+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+procedures+using+thermodynamic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).</li>
<li>Sepúlveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+gene+regulation+in+individual+cells+reveals+rapid+switching+between+promoter+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states.</a> Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> eLife. 5, 13065(2016).</li>
<li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu przedstawiliśmy protokół smFISH do pomiaru kinetyki mRNA u E. coli. We wcześniej opublikowanych protokołach smFISH dla bakterii23 komórki były trzymane w probówkach do samego końca protokołu, czyli do momentu, gdy będą gotowe do obrazowania. Chociaż ma to wiele zalet, takich jak minimalne niespecyficzne wiązanie sond fluorescencyjnych na powierzchni szkiełka nakrywkowego23, trudno jest przestrzegać tych protokołów, gdy istnieje wiele próbek z eksperymentu z przebiegiem czasu. Po pierwsze, należy pobrać stosunkowo dużą objętość komórek (>1 ml), a nawet pobrać je przed utrwaleniem. Po drugie, próbki komórek muszą być wielokrotnie odwirowywane w celu wymiany roztworów i umycia po etapie hybrydyzacji. W naszym protokole niewielka objętość (<1 ml) kultury jest bezpośrednio mieszana z roztworem utrwalającym w probówce o pojemności 1,5 ml, co pomaga szybko "zamrozić" stan komórki w momencie pobierania próbki. Ponadto komórki pozostają przyczepione do powierzchni przez cały czas trwania zabiegu, a różne roztwory można szybko wymieniać, zasysając ciecze za pomocą systemu filtracji próżniowej i nakładając krople roztworu za pomocą pipety wielokanałowej. Ta różnica sprawia, że nasz protokół jest bardzo korzystny, gdy trzeba przetworzyć dużą liczbę próbek jednocześnie. Korzystając z naszego protokołu, można jednocześnie obsługiwać od 12 do 48 próbek, a cała procedura FISH może zostać zakończona w ciągu ~8 godzin, czyli mniej więcej tyle czasu potrzebnego na kilka próbek (ryc. 2). Chociaż użyliśmy ekspresji lacZ w E. coli jako przykładu, protokół ma szerokie zastosowanie do różnych genów i gatunków bakterii, z rozważaniami omówionymi poniżej.
W przypadku różnych genów pierwszą rzeczą, którą należy wziąć pod uwagę, są sondy smFISH. Można zaprojektować sondy oligonukleotydowe, które kafelkują mRNA będące przedmiotem zainteresowania (Figura 1A)13. W tym podejściu "kafelkowym" każda sonda ma długość ~20 zasad i jest oznaczona fluoroforem na końcu 5' lub 3'. Ta strategia jest wygodna, ponieważ nie jest potrzebna żadna manipulacja genetyczna. Alternatywnie, powtórzenie tandemowe sekwencji ~ 20 pz, obcej sekwencji genomowej (np. Tablica sekwencji lacO w Caulobacter crescentus14), może zostać wstawiona do nieulegającego translacji regionu genu będącego przedmiotem zainteresowania, a pojedyncza sonda komplementarna do jednostki powtórzenia jest używana do znakowania mRNA (podejście "tablicowe"; Rysunek 1B). W obu przypadkach wiele fluoroforów zdobi mRNA, dając wzmocniony sygnał fluorescencyjny, który można łatwo odróżnić od pojedynczej sondy niespecyficznie związanej wewnątrz komórki.
To, czy wybrać podejście "kafelkowe" czy "macierzowe", zależy od kontroli negatywnej, próbki, w której testowane jest niespecyficzne wiązanie sond z powodu braku docelowego mRNA. W przypadku sond kafelkowych (ryc. 1A) zmutowany szczep bez interesującego genu lub stanu, w którym gen nie jest transkrybowany (np. Tłumienie lacZ) może służyć jako kontrola ujemna do testowania niespecyficznego wiązania sond. W przypadku smFISH opartego na macierzy (rysunek 1B) szczep typu dzikiego pozbawiony macierzy może służyć jako kontrola negatywna, ponieważ nie zawiera miejsc wiązania dla sond.
Optymalne warunki hybrydyzacji mogą zależeć od sekwencji sondy, a nawet wyboru barwników fluoroforowych. Zoptymalizowaliśmy warunki hybrydyzacji dla zestawów sond lacZ, utrzymując temperaturę hybrydyzacji na poziomie 37 °C i testując różne stężenia zestawów sond i formamidu w roztworze hybrydyzacyjnym. Wyższe stężenia formamidu mają tendencję do zmniejszania zarówno niespecyficznego, jak i swoistego wiązania26,35. Zalecamy systematyczną zmianę hybrydyzacji i warunków jej prania przy zachowaniu tego samego czasu i temperatury hybrydyzacji. W miarę jak warunek staje się bardziej rygorystyczny, zmniejsza się zarówno wiązanie niespecyficzne, jak i swoiste (ryc. 6). Ważne jest, aby znaleźć punkt, w którym niespecyficzne wiązanie zaczyna spadać poniżej akceptowalnego progu bez dalszego naruszania specyficznego wiązania. Na przykład jako próg użyliśmy poziomu sygnału uzyskanego bez żadnych sond ("brak sond") (rysunek 6).
Dwukolorowa metoda smFISH znakująca dwa oddzielne regiony mRNA jest ograniczona do długich genów. Aby zmierzyć tempo wydłużania transkrypcji, wykorzystaliśmy fakt, że lacZ jest długi (3075 pz), a jego ekspresja może być indukowana przez IPTG. Gdy gen jest krótki, trudno jest zaprojektować dwa zestawy sond kafelkowych (w pobliżu końców 5' i 3') i rozwiązać opóźnienie czasowe między pojawieniem się regionów mRNA 5' vs. 3'. W takim przypadku można policzyć powstające mRNA w stanie stacjonarnym za pomocą smFISH i przeanalizować ich rozkład za pomocą modelu analitycznego, w którym szybkość wydłużania transkrypcji jako odpowiedni parametrwynosi 20. Ponadto, gdy interesujący nas gen nie jest indukowalny, można leczyć komórki ryfampicyną w czasie zero i mierzyć zmianę czasową w podregionach mRNA 5' i 3'. Opóźnienie od spadku sygnału 5' mRNA do spadku sygnału 3' mRNA można następnie wykorzystać do obliczenia szybkości wydłużania transkrypcji, jak to miało miejsce wcześniej31.
Wreszcie, protokół smFISH jest wszechstronny i można go łączyć z innymi schematami etykietowania. Wcześniej locus DNA wizualizowano razem z mRNA poprzez połączenie mRNA FISH z DNA FISH14 lub fluorescencyjnym systemem reporter-operator20. Produkty białkowe można uwidocznić, wykonując immunofluorescencję razem z mRNA FISH 14,36. Można go również połączyć z trójwymiarową mikroskopią superrozdzielczą37 w celu wizualizacji mRNA we wszystkich trzech wymiarach 38,39.

Przepływ informacji genetycznej od DNA do mRNA i białka jest jednym z najbardziej podstawowych procesów komórkowych, którego regulacja jest ważna dla sprawności komórkowej1. Liczba mRNA w komórce jest określana przez dwa dynamiczne procesy, transkrypcję i degradację mRNA. Jednak sposób, w jaki transkrypcja i degradacja mRNA są regulowane w czasie i przestrzeni pojedynczej komórki, pozostaje nie do końca zrozumiały, głównie z powodu braku metod eksperymentalnych do ilościowego pomiaru ich kinetyki in vivo.
Metody oparte na całkowitej liczbie mRNA wyekstrahowanych z populacji komórek, takie jak Northern blot, RT-PCR, sekwencjonowanie RNA i mikromacierze ekspresji genów, mogą mierzyć względną różnicę w poziomach mRNA i były szeroko stosowane do analizy szybkości wydłużania transkrypcji2,3,4,5 lub szybkość degradacji mRNA6,7. Nie podają one jednak bezwzględnej liczby mRNA na komórkę, a zatem nie nadają się do badania szybkości inicjacji transkrypcji8. Ponadto, ponieważ mRNA są ekstrahowane z populacji komórek, nie można zmierzyć przestrzennego rozkładu mRNA w pojedynczej komórce i zmienności liczby kopii mRNA między komórkami.
Sekwencjonowanie RNA nowej generacji na pojedynczych komórkach (scRNAseq) może określić ilościowo liczbę mRNA na komórkę w skali genomowej9. Jednak nadal trudno jest zastosować tę technikę do pomiaru kinetyki transkrypcji ze względu na wyzwania związane z przygotowaniem próbki i wysokie koszty. W szczególności zastosowanie scRNAseq do bakterii było technicznie trudne ze względu na niską liczebność mRNA10,11.
Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (smFISH) opiera się na hybrydyzacji znakowanych fluorescencyjnie jednoniciowych sond, których sekwencje są komplementarne do docelowego mRNA będącego przedmiotem zainteresowania12,13. Koncepcja hybrydyzacji specyficznej dla sekwencji jest podobna do tej stosowanej w Northern blot lub RT-PCR, ale hybrydyzacja odbywa się in situ w utrwalonych komórkach, aby zachować natywną lokalizację mRNA. Sygnał pojedynczego mRNA jest wzmacniany za pomocą wielu sond o długości ~20 nukleotydów (nt), hybrydyzujących z różnymi częściami mRNA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A)<klasa sup = "xref">13. W tym podejściu "kafelkowym" liczba sond potrzebnych do wykrycia pojedynczego mRNA wyznacza dolną granicę długości mRNA, które można oznaczyć. Alternatywnie, interesujące mRNA może być transkrypcyjnie połączone z niekodującą matrycą tandemowych sekwencji operatorów Lac, tak że wiele kopii znakowanej fluorescencyjnie sondy lacO hybrydyzuje z pojedynczym mRNA (<silna klasa = "xfig">Figura 1B)14.
smFISH został użyty do ilościowego określenia liczby mRNA na komórkę w stanie ustalonym (tj. gdy synteza i rozpad są w równowadze) oraz do analizy średniej i zmienności mRNA wśród komórek bakteryjnych15,16,17. Ostatnio smFISH został zastosowany do ilościowego określania liczby mRNA w stanie niestacjonarnym, zaraz po indukcji lub represji ekspresji genów w E. coli18,19,20. Czasowe zmiany w bezwzględnej liczbie kopii mRNA wykorzystano następnie do obliczenia szybkości inicjacji, wydłużania i zakończenia transkrypcji, a także szybkości degradacji mRNA. W tym przypadku konwencjonalne procedury smFISH mogą być kłopotliwe, ponieważ istnieje wiele próbek, z których każda reprezentuje jeden punkt czasowy, które muszą przejść przez wiele etapów wymiany (tj. wirowania i mycia). W tym miejscu opisujemy protokół smFISH, w którym etapy postępowania z próbką są znacznie uproszczone dzięki przyklejeniu komórek do powierzchni szkiełka nakrywkowego i zasysaniu cieczy za pomocą systemu filtracji próżniowej14,19. Na przykładzie ekspresji lacZ w E. coli pokazano pełny przebieg pracy (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2), w tym analizę obrazu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3) uzyskując kinetykę in vivo transkrypcji (inicjacji, wydłużenia i zakończenia) oraz degradacji mRNA, zmienności ekspresji mRNA między komórkami i lokalizacji mRNA. Przewidujemy, że protokół będzie miał szerokie zastosowanie do badania kinetyki in vivo i lokalizacji innych mRNA w różnych gatunkach bakterii.

<table><tbody><tr><td><silny>Szczep bakteryjny</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MG1655</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Chemikalia, peptydy i inne</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td>Bufor UPLC B</td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Fisher Chemical</td><td>A661-500</td><td>Aby zrobić podłoże M9</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td>Hybrydyzacja sondy</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Acros Organics</td><td>349610250</td><td>Do produkcji pożywki</td></tr><tr><td>M9 Casaminokwas</td><td>BD Difco</td><td>223050</td><td>Do produkcji M9 pożywka</td></tr><tr><td>Cy3B NHS</td> ester <td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>PA63101</td><td>Fluorofor do sond FISH</td></tr><tr><td>Cy5 NHS ester</td><td>GE Healthcare Life Nauki</td><td>PA15101</td><td>Fluorofor do sond FISH</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>Millipore</td><td>S4030</td><td>Hybrydyzacja sondy</td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16</td><td>Aby stłumić ekspresję lacZ</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Aby rozpuścić fluorofory</td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td>Hybrydyzacja sondy</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>Stosowany w oczyszczaniu, lizie i czyszczeniu szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>DNA Sondy</td><td>FISH Technologie</td><td></td> biowyszukiwania <td>Sekwencje są publikowane w ref#16</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Ladd Research Industries</td><td>20295</td><td>Utrwalenie</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>American Bio</td><td>AB00600</td><td>Hybrydyzacja sondy, wstępna hybrydyzacja i mycie</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Americanbio</td><td>AB00751-01000</td><td>Aby uzyskać podłoże M9</td></tr><tr><td>Izopropylotio-&beta;-galaktozyd (IPTG)</td><td>Invitrogen</td><td>15529019</td><td>indukcji lacZ</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fisher Chemical</td><td>M65-500</td><td>Aby zrobić podłoże</td></tr><tr><td>M9 2-nitrofenyl &beta;-D-fukopirazyd (ONPF)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-216258</td><td>Tłumienie lacZ</td></tr><tr><td>Picodent twinsil 22</td><td>Picodent</td><td>1300 1000</td><td>Uszczelniacz</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Do obróbki powierzchni szkiełka nakrywkowego</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>Do produkcji PBS</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP362-500</td><td>Do wytwarzania pożywki PBS i M9</td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td>Aby zatrzymać inicjację transkrypcji</td></tr><tr><td>Bufor solno-cytrynianu sodu (SSC)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9763</td><td>Hybrydyzacja sondy, wstępna hybrydyzacja i płukanie</td></tr><tr><td>wodorowęglanu sodu</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP328-500</td><td>Koniugacja fluorofor-sonda</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-1</td><td>Do oczyszczania DNA, PBS i M9 pożywka</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>Do wytwarzania pożywki PBS i M9</td></tr><tr><td>Monozasadowy fosforan sodu</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP329-500</td><td>Do wytwarzania buforu fosforanu sodu</td></tr><tr><td>Super PAP Pen</td><td>Invitrogen</td><td>8899</td><td>Marker hydrofobowy do szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>TetraSpek mikrosfery</td><td>Invitrogen</td><td>T7280</td><td>Kontrole dla rejestracja wielokanałowa</td></tr><tr><td>Tiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td>Aby uzyskać medium M9</td></tr><tr><td>Octan trietyloamonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90358</td><td>Bufor UPLC Kompleks</td></tr><tr><td>rybonukleozydów wanadylu (VRC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94742</td><td>Hybrydyzacja sondy i wstępna hybrydyzacja</td></tr> <tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 kolumna</td><td>Waters</td><td>Acquity BEH C18 kolumna</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka nablatowa</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator nablatowy</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer F1.5</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator (piekarnik)</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030514</td><td>Konwekcja grawitacyjna</td></tr><tr><td>System oczyszczania wody</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q Reference</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td></td></tr><tr><td>Azot gazowy</td><td>Budynek</td><td></td><td>Do suszenia nadmuchem szkiełek nakrywkowych i szkiełek szklanych</td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity UPLC System</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum i aspirator</td><td>Budynek</td><td></td><td>Aspirator wykonany jest z kolby filtracyjnej z bocznym ramieniem.</td></tr><tr><td>Koncentrator próżniowy</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td>Centrivap; do suszenia próbek pobranych z UPLC.</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>Genie-2 SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do kąpieli wodnej</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 3100</td><td>Krytyczne dla eksperymentów w czasie</td></tr><tr><td>Sonikator do kąpieli wodnej</td><td>VWR</td><td>97043-960</td><td>Do czyszczenia szkiełek nakrywkowych i szkiełek</td></tr> <tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówek</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td>Probówki do lamin DNA</td></tr><tr><td>1000-uL Pudełko na końcówki do pipet</td><td>Denville Scientific</td><td>P1126</td><td>Puste pudełko po użyciu wszystkich końcówek</td></tr><tr><td>Słoik Coplin</td><td>SPI</td><td>01240-AB</td><td>Do czyszczenia szkiełek nakrywkowych i szkiełek Szkiełko</td></tr><tr><td>nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-230</td><td>24x60 No1</td></tr><tr><td>Filtrowane końcówki do pipet</td><td>Denville Scientific</td><td>P1121,P1122,P1126</td><td>SHARP&reg; Precyzyjne końcówki barierowe</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>SPI</td><td>K35a</td><td>Do obsługi czystych szkiełek nakrywkowych i szkiełek szkiełkowych</td></tr><tr><td>Szkiełko</td><td>szklane Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice</td><td>Pipeter wielokanałowy Microflex</td><td>MK-296-M</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>2231300045</td><td>Do użycia na etapie mycia</td></tr> <tr><td>Pipeta</td><td>Gilson</td><td>P1000, P200, P20</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik odczynnika</td><td>MTC Bio</td><td>P8025-1S</td><td>Do użycia na etapie mycia</td></tr> <tr><td>Filtr strzykawkowy (0,22 um)</td><td>Milipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie i algorytmy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013 i nowsze</td><td>https://www.mathworks.com</td></tr><tr><td>MicrobeTracker lub Oufti</td><td></td><td></td><td>https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker</td></tr><tr><td colspan="4">https://oufti.org/</td></tr> <tr><td>Stellaris Probe Designer</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer</td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>kamera Hamamatsu Zestaw filtrów Photonics</td><td>Orca-II-ER</td><td></td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Chroma</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów Cy5</td><td>Chroma</td><td>49006</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td>Do kontrastu fazowego i epi fluorescencji</td></tr><tr><td>Źródło wzbudzenia fluorescencji</td><td>Lumencor</td><td>SOLA-E</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Elements oprogramowanie</td><td>Nikon</td><td></td><td>oprogramowanie sterujące konfiguracją mikroskopu</td></tr><tr><td>Obiektyw z kontrastem fazowym 100x</td><td>Plan Apochromat Nikon (NA 1.45)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sekwencja sondy</td>DNA z modyfikacją aminową C6 na końcu 5' <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biosearch Technologies Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lacZ1</td><td></td><td>GTGAATCCGTAATCATGGTC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ2</td><td></td><td>TCACGACGTTGTAAAACGAC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ3</td><td></td><td>ATTAAGTTGGGTAACGCCAG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ4</td><td></td><td>TATTACGCCAGAGCTGGCGAAA</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ5</td><td></td><td>ATTCAGGCTGCGCAACTGTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ6</td><td></td><td>AAACCAGGCAAAGCGCCATT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ7</td><td></td><td>AGTATCGGCCTCAGGAAGAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ8</td><td></td><td>AACCGTGCATCTGCCAGTTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ9</td><td></td><td>TAGGTCACGTTGGTGTAGAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ10</td><td></td><td>AATGTGAGCGAGTAACAACC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ11</td><td></td><td>GTAGCCAGCTTTCATCAACA</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ12</td><td></td><td>AATAATTCGCGTCTGGCCTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ13</td><td></td><td>AGATGAAACGCCGAGTTAAC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ14</td><td></td><td>AATTCAGACGGCAAACGACT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ15</td><td></td><td>TTTCTCCGGGGCGCGTAAAAAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ16</td><td></td><td>ATCTTCCAGATAACTGCCGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ17</td><td></td><td>AACGAGACGTCACGGAAAAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ18</td><td></td><td>GCTGATTTGTGTAGTCGGTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ19</td><td></td><td>TTAAAGCGAGTGGCAACATG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ20</td><td></td><td>AACTGTTACCCGTAGGTAGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ21</td><td></td><td>ATAATTTCACCGCCGAAAGG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ22</td><td></td><td>TTTCGACGTTCAGACGTAGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ23</td><td></td><td>ATAGAGATTCGGGATTTCGG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ24</td><td></td><td>TTCTGCTTCAATCAGCGTGC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ25</td><td></td><td>ACCATTTTCAATCCGCACCT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ26</td><td></td><td>TTAACGCCTCGAATCAGCAA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ27</td><td></td><td>ATGCAGAGGATGATGCTCGT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ28</td><td></td><td>TCTGCTCATCCATGACCTGA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ29</td><td></td><td>TTCATCAGCAGGATATCCTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ30</td><td></td><td>CACGGCGTTAAAGTTGTTCT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ31</td><td></td><td>TGGTTCGGATAATGCGAACA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ32</td><td></td><td>TTCATCCACCACATACAGGC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ33</td><td></td><td>TGCCGTGGGTTTCAATATTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ34</td><td></td><td>ATCGGTCAGACGATTCATTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ35</td><td></td><td>TGATCACACTCGGGTGATTA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ36</td><td></td><td>ATACAGCGCGTCGTGATTAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ37</td><td></td><td>GATCGACAGATTTGATCCAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ38</td><td></td><td>AAATAATGGTGGGGGTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ39</td><td></td><td>TTTGATGGACCATTTCGGCA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ40</td><td></td><td>TATTCGCAAAGGATCAGCGG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ41</td><td></td><td>AAGACTGTTACCCATCGCGT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ42</td><td></td><td>TGCCAGTATTTAGCGAAACC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ43</td><td></td><td>AAACGGATACTGACGAAAA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ44</td><td></td><td>TAATCAGCGACTGATCCACC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ45</td><td></td><td>GGGTTGCCGTTTTCATCATA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ46</td><td></td><td>TCGGCGTATCGCCAAAATCA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ47</td><td></td><td>TTCATACAGAACTGGCGATC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ48</td><td></td><td>TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ49</td><td></td><td>ACGGAACTGGAAAAAACTGCT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ50</td><td></td><td>TATTCGCTGGTCACTTCGAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ51</td><td></td><td>GTTATCGTATGACGGAACA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ52</td><td></td><td>TTTACCTTGTGGAGCGACAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ53</td><td></td><td>GTTCAGGCAGTTCAATCAAC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ54</td><td></td><td>TTGCACTACGCGTACTGTGA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ55</td><td></td><td>AGCGTCACACTGAGGTTTTC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ56</td><td></td><td>ATTTCGCTGGTGGTCAGATG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ57</td><td></td><td>ACCCAGCTCGATGCAAAAAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ58</td><td></td><td>CGGTTAAATTGCCAACGCTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ59</td><td></td><td>CTGTGAAAGAAAGCCTGACT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ60</td><td></td><td>GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ61</td><td></td><td>TACGCCAATGTCGTTATCCA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ62</td><td></td><td>TAAGGTTTTCCCCTGATGCT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ63</td><td></td><td>ATCAATCCGGTAGGTTTTCC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ64</td><td></td><td>GTAATCGCCATTTGACCACT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ65</td><td></td><td>AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ66</td><td></td><td>ATGTCTGACAATGGCAGATC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ67</td><td></td><td>ATAATTCAATTCGCGCGTCC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ68</td><td></td><td>TGATGTTGAACTGGAAGTCG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ69</td><td></td><td>TCAGTTGCTGTTGACTGACT 3</td><td>' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ70</td><td></td><td>ATTCAGCCATGTGCCTTCTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ71</td><td></td><td>AATCCCCATATGGAAACCGT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ72</td><td></td><td>AGACCAACTGGTAATGGTAG</td><td>3' mRNA</td></tr></tbody></table>

sondowanie kinetyki mrna w czasie i przestrzeni u escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) pozwala na zliczenie bezwzględnej liczby mRNA w poszczególnych komórkach. W tym miejscu opisujemy zastosowanie smFISH do pomiaru szybkości transkrypcji i degradacji mRNA w Escherichia coli. Ponieważ smFISH opiera się na stałych komórkach, wykonujemy smFISH w wielu punktach czasowych podczas eksperymentu z przebiegiem czasu, tj. gdy komórki przechodzą zsynchronizowane zmiany po indukcji lub represji ekspresji genów. W każdym punkcie czasowym podregiony mRNA są spektralnie rozróżniane w celu zbadania wydłużenia transkrypcji i przedwczesnego zakończenia. Wynik tego protokołu pozwala również na analizę wewnątrzkomórkowej lokalizacji mRNA i niejednorodności w liczbie kopii mRNA między komórkami. Korzystając z tego protokołu, wiele próbek (~50) może być przetworzonych w ciągu 8 godzin, co odpowiada czasowi potrzebnemu na zaledwie kilka próbek. Omówiliśmy, jak zastosować ten protokół do badania kinetyki transkrypcji i degradacji różnych mRNA w komórkach bakteryjnych.

Ten protokół opisuje zastosowanie hybrydyzacji in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFISH) do pomiaru kinetyki in vivo syntezy i degradacji mRNA.

Sondowanie kinetyki mRNA w czasie i przestrzeni u Escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISH jest znany z pomiaru liczby bezwzględnej jako subkomórkowej lokalizacji mRNA. Nasz dwukolorowy protokół sMFISH ma dodatkową możliwość pomiaru kinetyki transkrypcji i degradacji mRNA. Dzięki tej metodzie można przetwarzać wiele próbek jednocześnie bez dodatkowego czasu i wysiłku.Na przykład cztery eksperymenty w czasie, w wyniku których uzyskano 48 próbek, można przetworzyć do obrazowania w ciągu ośmiu godzin. Nasz protokół ma szerokie zastosowanie w przypadku wielu genów i gatunków bakterii. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych i szkiełek do eksperymentu.Za pomocą kleszczy umieść szkiełka nakrywkowe i szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 100% etanolu i umieść słoik w kąpieli wodnej z ultradźwiękami na 15 do 20 minut. Pod koniec sonikacji umyj szkiełka i szkiełka nakrywkowe trzy do czterech razy ultra czystą wodą, a następnie ponownie napełnij słoik 70% etanolem i powtórz sonikację. Po wykonaniu wszystkich etapów sonikacji osusz szkiełka nakrywkowe i szkiełka nakrywkowe gazowym azotem.Umieść szkiełka pokrywy w pustym pudełku na końcówki do pipet o pojemności 1000 mikrolitrów i umieść szkiełka w czystym pudełku na szkiełka. Następnie, podążając za otworami w pudełku z końcówkami do pipet, użyj markera hydrofobowego, aby narysować kółka na szkiełkach nakrywkowych i nałóż 20 mikrolitrów kropli 0,1% polilizyny do każdej z tych studzienek. Aby przeprowadzić eksperyment z kursem czasowym, dodaj 750 mikrolitrów z 20-mililitrowej wykładniczo rosnącej kultury E. coli do 1,5-mililitrowej probówki hodowlanej oznaczonej czasem zero.I natychmiast odwróć rurkę. Wywołaj ekspresję lac Z za pomocą 0,2 do jednego milimolowego IPTG i uruchom timer. Po sprawdzeniu timera, zbierz kulturę komórkową w każdym kolejnym eksperymentalnym punkcie czasowym, jak właśnie pokazano.W odpowiednim momencie podczas eksperymentu dodaj pięć milimolowych ONPF do kolby, aby stłumić ekspresję lac Z i kontynuuj pobieranie próbek z kultur w celu śledzenia degradacji mRNA. Pod koniec pobierania próbki w czasie inkubacji próbek należy je inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie inkubować na lodzie przez 30 minut. Pod koniec inkubacji odwirować próbki w celu usunięcia utrwalacza i użyć pipety do usunięcia supernatantu.Ponownie zawieś bakterie w jednym mililitrze DEPC PBS i umyj komórki jeszcze dwa razy w jednym mililitrze świeżego DEPC PBS na pranie. Po ostatnim praniu ponownie zawieś ogniwa w 30 mikrolitrach świeżego DEPC PBS. Do przepuszczalności komórek.Najpierw dodaj próbkę z każdego punktu czasowego do indywidualnych studzienek hydrofobowych na jednym z szkiełek nakrywkowych ze szkła sterylizowanego etanolem. I pozwól komórkom przylegać do szkiełka nakrywkowego w 10 do 30 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji dodaj 15 mikrolitrów 70% etanolu do każdej studzienki.Po czterech minutach odessać etanol z każdej studzienki, tak aby studzienki były całkowicie suche. Po umyciu dodaj 30 mikrolitrów roztworu do wstępnej hybrydyzacji do każdej studzienki przepuszczalnych komórek i inkubuj komórki przez 30 minut w piecu o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zastąp roztwór przed hybrydyzacją około 30 mikrolitrami roztworu do hybrydyzacji sondy na studzienkę.I przykryj komorę folią aluminiową na dwie godziny inkubacji w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji użyj pipety wielokanałowej, aby przepłukać studzienki trzy do pięciu razy 30 mikrolitrami roztworu płuczącego na studzienkę na płukanie. Po ostatnim myciu inkubować komórki przez 15 do 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie przemyć studzienki pięciokrotnie 30 mikrolitrami świeżego DEPC PBS na mycie.Po ostatnim praniu odessać cały płyn z szkiełka nakrywkowego. I dodaj cztery mikrolitry świeżego DEPC PBS do każdej studzienki. Za pomocą kleszczyków ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku sterylizowanym etanolem sample stroną do dołu i użyj silikonowej gumy dentystycznej, aby uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego.Aby zlokalizować obszar zainteresowania, wybierz tryb obrazowania na żywo z kontrastem fazowym i manewruj joystickiem stolika, aby zmienić pole widzenia w studni. Umieszczono obszar, w którym gęstość komórek jest optymalna, i dostosuj ostrość Z tak, aby obrazy komórek z kontrastem fazowym były ostre. Następnie uzyskaj obraz C 5 z czterosekundową ekspozycją, obraz C 3 z dwusekundową ekspozycją i obraz z kontrastem fazowym z 0,2 sekundy ekspozycji dla około 10 różnych obszarów na studzienkę.Alternatywnie można przeprowadzić akwizycję NDI, w której obrazy C pięć, C trzy i kontrast fazowy są pozyskiwane szeregowo. Gdy wszystkie dołki zostaną zobrazowane, otwórz odpowiednie narzędzie do segmentacji komórek i odznacz stos. Załaduj interesujące Cię obrazy kontrastu fazowego i wybierz niezależne klatki, a następnie kliknij opcję Oblicz profil fazowy jako zero.Aby rozpocząć proces segmentacji, podczas którego komórki zostaną zidentyfikowane i obliczone zostaną ich kontury. Załaduj parametry podane w folderze GitHub i kliknij wszystkie ramki. Na końcu przetwarzania wybierz kontur, aby zobrazować siatkę.Następnie, pod zakładką wykrywania plamek, odznacz stos, sprawdź siatki i kliknij pocieranie, aby rozpocząć identyfikację miejsca i kwantyfikację na podstawie dwóch łączników Gaussa D. Wybierz folder zawierający obrazy fluorescencyjne i plik siatki, który został właśnie obliczony na podstawie procedury wykrywania komórek, i wskaż nazwę pliku, w którym zostaną zapisane wyniki wykrywania plamki. Następnie użyj przepływu pracy analizy obrazu udostępnionego w usłudze GitHub, aby przeanalizować obrazy fluorescencyjne.W tym pełnym polu widzenia można zaobserwować około 500 komórek E. coli o dobrej gęstości do segmentacji komórek. Morfologia komórek na obrazach z kontrastem fazowym powinna pozostać porównywalna z morfologią żywych komórek dla celów segmentacji. Jeśli komórki są nadmiernie przepuszczalne, ich morfologia stanie się nieodpowiednia do segmentacji.Rozkład intensywności plamki mRNA lac Z przed indukcją nie pasuje dobrze do rozkładu normalnego lub Poissona ze względu na obecność plamek o dużej intensywności. Kiedy ekspresja lac Z jest indukowana, sygnał pięciu pierwszych mRNA lac Z wzrasta przed wzrostem sygnału trzech pierwszych mRNA lac Z. Jeśli ekspresja lac Z zostanie stłumiona, zmniejsza się zarówno pięcio, jak i trzy główne sygnały mRNA lac Z.Aby uzyskać szybkość wydłużania transkrypcji, wzrost pięciu i trzech sygnałów głównych jest dopasowany do linii. Podczas gdy szybkość degradacji mRNA uzyskuje się poprzez dopasowanie obszaru rozpadu do funkcji wykładniczej. Ponieważ ryba jednocząsteczkowa jest techniką jednokomórkową, można również analizować zmienność transkrypcji między komórkami.Ponadto analiza kolokalizacji pięciu pierwszych i trzech pierwszych mRNA lac Z pozwala na ilościowe określenie gęstości polimeraz RNA na genie lac Z. Ponieważ podczas tej procedury próbki z różnych punktów czasowych są przetwarzane jednocześnie. Ważne jest, aby próbki były oddzielone, gdy znajdują się w probówkach i na szkiełku nakrywkowym.Korzystanie z tej techniki mikroskopii pojedynczej cząsteczki pojedynczej komórki. Naukowcy mogą teraz zbadać, w jaki sposób kinetyka transkrypcji i degradacji mRNA jest powiązana z liczbami bezwzględnymi lub subkomórkowymi lokalizacjami mRNA.

probing-mrna-kinetics-space-time-escherichia-coli-using-two-color

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę mikroskopii fluorescencyjnej, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), do obrazowania produkcji cząsteczek białka w żywych komórkach z precyzją pojedynczej cząsteczki bez zakłócania funkcjonalności białka. Metoda ta została wykorzystana do śledzenia stochastycznej dynamiki ekspresji czynnika transkrypcyjnego, represora λ CI 1.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki regulacji genów in vivo przy użyciu aktywacji kotranslacyjnej przez rozszczepienie (CoTrAC)

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do liczenia mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Tutaj prezentujemy metodę bezpośredniego pomiaru poziomów ładowania transferowego RNA z oczyszczonego RNA Escherichia coli, a także sposób porównywania względnych poziomów transferowego RNA, lub dowolnego innego krótkiego RNA, w różnych próbkach na podstawie dodania komórek impulsowych wyrażających gen odniesienia.

Kwantyfikacja liczebności i poziomów naładowania transferowych RNA w Escherichia coli

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest techniką używaną do wprowadzania specyficznych mutacji w kwasie dezoksyrybonukleinowym (DNA). Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce za pomocą 2-etapowego i 3-etapowego podejścia opartego na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), które ma zastosowanie do dowolnego fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania.

Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.

Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH

Transfer energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki to metoda, która śledzi dynamikę tRNA podczas syntezy białek rybosomalnych. Śledząc poszczególne rybosomy, identyfikuje się niejednorodne populacje, które rzucają światło na mechanizmy. Metoda ta może być wykorzystana do śledzenia biologicznych zmian konformacyjnych w ogóle, aby ujawnić zależności dynamiczno-funkcyjne w wielu innych złożonych biosystemach. W metodach jednocząsteczkowych można zaobserwować etapy nieograniczające szybkości i...

Badanie transferu energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki w syntezie białek rybosomów

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Poznaj dwukolorową hybrydyzację fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ do badania kinetyki transkrypcji i degradacji mRNA u Escherichia coli. Metoda umożliwia jednoczesne przetwarzanie 48 próbek w ciągu ośmiu godzin.

Sondowanie kinetyki mRNA w czasie i przestrzeni u Escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (Wideo) | JoVE Journal

Sondowanie kinetyki mRNA w czasie i przestrzeni u Escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Przeglądaj więcej filmów