Sondowanie kinetyki mRNA w czasie i przestrzeni u Escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

smFISH jest znany z pomiaru liczby bezwzględnej jako subkomórkowej lokalizacji mRNA. Nasz dwukolorowy protokół sMFISH ma dodatkową możliwość pomiaru kinetyki transkrypcji i degradacji mRNA. Dzięki tej metodzie można przetwarzać wiele próbek jednocześnie bez dodatkowego czasu i wysiłku.

Na przykład cztery eksperymenty w czasie, w wyniku których uzyskano 48 próbek, można przetworzyć do obrazowania w ciągu ośmiu godzin. Nasz protokół ma szerokie zastosowanie w przypadku wielu genów i gatunków bakterii. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych i szkiełek do eksperymentu.

Za pomocą kleszczy umieść szkiełka nakrywkowe i szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 100% etanolu i umieść słoik w kąpieli wodnej z ultradźwiękami na 15 do 20 minut. Pod koniec sonikacji umyj szkiełka i szkiełka nakrywkowe trzy do czterech razy ultra czystą wodą, a następnie ponownie napełnij słoik 70% etanolem i powtórz sonikację. Po wykonaniu wszystkich etapów sonikacji osusz szkiełka nakrywkowe i szkiełka nakrywkowe gazowym azotem.

Umieść szkiełka pokrywy w pustym pudełku na końcówki do pipet o pojemności 1000 mikrolitrów i umieść szkiełka w czystym pudełku na szkiełka. Następnie, podążając za otworami w pudełku z końcówkami do pipet, użyj markera hydrofobowego, aby narysować kółka na szkiełkach nakrywkowych i nałóż 20 mikrolitrów kropli 0,1% polilizyny do każdej z tych studzienek. Aby przeprowadzić eksperyment z kursem czasowym, dodaj 750 mikrolitrów z 20-mililitrowej wykładniczo rosnącej kultury E. coli do 1,5-mililitrowej probówki hodowlanej oznaczonej czasem zero.

I natychmiast odwróć rurkę. Wywołaj ekspresję lac Z za pomocą 0,2 do jednego milimolowego IPTG i uruchom timer. Po sprawdzeniu timera, zbierz kulturę komórkową w każdym kolejnym eksperymentalnym punkcie czasowym, jak właśnie pokazano.

W odpowiednim momencie podczas eksperymentu dodaj pięć milimolowych ONPF do kolby, aby stłumić ekspresję lac Z i kontynuuj pobieranie próbek z kultur w celu śledzenia degradacji mRNA. Pod koniec pobierania próbki w czasie inkubacji próbek należy je inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie inkubować na lodzie przez 30 minut. Pod koniec inkubacji odwirować próbki w celu usunięcia utrwalacza i użyć pipety do usunięcia supernatantu.

Ponownie zawieś bakterie w jednym mililitrze DEPC PBS i umyj komórki jeszcze dwa razy w jednym mililitrze świeżego DEPC PBS na pranie. Po ostatnim praniu ponownie zawieś ogniwa w 30 mikrolitrach świeżego DEPC PBS. Do przepuszczalności komórek.

Najpierw dodaj próbkę z każdego punktu czasowego do indywidualnych studzienek hydrofobowych na jednym z szkiełek nakrywkowych ze szkła sterylizowanego etanolem. I pozwól komórkom przylegać do szkiełka nakrywkowego w 10 do 30 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji dodaj 15 mikrolitrów 70% etanolu do każdej studzienki.

Po czterech minutach odessać etanol z każdej studzienki, tak aby studzienki były całkowicie suche. Po umyciu dodaj 30 mikrolitrów roztworu do wstępnej hybrydyzacji do każdej studzienki przepuszczalnych komórek i inkubuj komórki przez 30 minut w piecu o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zastąp roztwór przed hybrydyzacją około 30 mikrolitrami roztworu do hybrydyzacji sondy na studzienkę.

I przykryj komorę folią aluminiową na dwie godziny inkubacji w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji użyj pipety wielokanałowej, aby przepłukać studzienki trzy do pięciu razy 30 mikrolitrami roztworu płuczącego na studzienkę na płukanie. Po ostatnim myciu inkubować komórki przez 15 do 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie przemyć studzienki pięciokrotnie 30 mikrolitrami świeżego DEPC PBS na mycie.

Po ostatnim praniu odessać cały płyn z szkiełka nakrywkowego. I dodaj cztery mikrolitry świeżego DEPC PBS do każdej studzienki. Za pomocą kleszczyków ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku sterylizowanym etanolem sample stroną do dołu i użyj silikonowej gumy dentystycznej, aby uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego.

Aby zlokalizować obszar zainteresowania, wybierz tryb obrazowania na żywo z kontrastem fazowym i manewruj joystickiem stolika, aby zmienić pole widzenia w studni. Umieszczono obszar, w którym gęstość komórek jest optymalna, i dostosuj ostrość Z tak, aby obrazy komórek z kontrastem fazowym były ostre. Następnie uzyskaj obraz C 5 z czterosekundową ekspozycją, obraz C 3 z dwusekundową ekspozycją i obraz z kontrastem fazowym z 0,2 sekundy ekspozycji dla około 10 różnych obszarów na studzienkę.

Alternatywnie można przeprowadzić akwizycję NDI, w której obrazy C pięć, C trzy i kontrast fazowy są pozyskiwane szeregowo. Gdy wszystkie dołki zostaną zobrazowane, otwórz odpowiednie narzędzie do segmentacji komórek i odznacz stos. Załaduj interesujące Cię obrazy kontrastu fazowego i wybierz niezależne klatki, a następnie kliknij opcję Oblicz profil fazowy jako zero.

Aby rozpocząć proces segmentacji, podczas którego komórki zostaną zidentyfikowane i obliczone zostaną ich kontury. Załaduj parametry podane w folderze GitHub i kliknij wszystkie ramki. Na końcu przetwarzania wybierz kontur, aby zobrazować siatkę.

Następnie, pod zakładką wykrywania plamek, odznacz stos, sprawdź siatki i kliknij pocieranie, aby rozpocząć identyfikację miejsca i kwantyfikację na podstawie dwóch łączników Gaussa D. Wybierz folder zawierający obrazy fluorescencyjne i plik siatki, który został właśnie obliczony na podstawie procedury wykrywania komórek, i wskaż nazwę pliku, w którym zostaną zapisane wyniki wykrywania plamki. Następnie użyj przepływu pracy analizy obrazu udostępnionego w usłudze GitHub, aby przeanalizować obrazy fluorescencyjne.

W tym pełnym polu widzenia można zaobserwować około 500 komórek E. coli o dobrej gęstości do segmentacji komórek. Morfologia komórek na obrazach z kontrastem fazowym powinna pozostać porównywalna z morfologią żywych komórek dla celów segmentacji. Jeśli komórki są nadmiernie przepuszczalne, ich morfologia stanie się nieodpowiednia do segmentacji.

Rozkład intensywności plamki mRNA lac Z przed indukcją nie pasuje dobrze do rozkładu normalnego lub Poissona ze względu na obecność plamek o dużej intensywności. Kiedy ekspresja lac Z jest indukowana, sygnał pięciu pierwszych mRNA lac Z wzrasta przed wzrostem sygnału trzech pierwszych mRNA lac Z. Jeśli ekspresja lac Z zostanie stłumiona, zmniejsza się zarówno pięcio, jak i trzy główne sygnały mRNA lac Z.

Aby uzyskać szybkość wydłużania transkrypcji, wzrost pięciu i trzech sygnałów głównych jest dopasowany do linii. Podczas gdy szybkość degradacji mRNA uzyskuje się poprzez dopasowanie obszaru rozpadu do funkcji wykładniczej. Ponieważ ryba jednocząsteczkowa jest techniką jednokomórkową, można również analizować zmienność transkrypcji między komórkami.

Ponadto analiza kolokalizacji pięciu pierwszych i trzech pierwszych mRNA lac Z pozwala na ilościowe określenie gęstości polimeraz RNA na genie lac Z. Ponieważ podczas tej procedury próbki z różnych punktów czasowych są przetwarzane jednocześnie. Ważne jest, aby próbki były oddzielone, gdy znajdują się w probówkach i na szkiełku nakrywkowym.

Korzystanie z tej techniki mikroskopii pojedynczej cząsteczki pojedynczej komórki. Naukowcy mogą teraz zbadać, w jaki sposób kinetyka transkrypcji i degradacji mRNA jest powiązana z liczbami bezwzględnymi lub subkomórkowymi lokalizacjami mRNA.