Name: Nowy paradygmat warunkowania strachu Pawłowa do badania zachowań związanych z zamarzaniem i ucieczką (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj nowy paradygmat warunkowania strachu Pawłowa do badania zachowań związanych z zamarzaniem i ucieczką u gryzoni. Ta metoda pozwala analizować mechanizmy zachowań obronnych związanych z PTSD i zaburzeniami lękowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Radę Regentów Luizjany poprzez fundusz wsparcia Rady Regentów (LEQSF(2018-21)-RD-A-17) oraz Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem nagrody R01MH122561. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Następujące kroki/procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi po zatwierdzeniu przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tulane.
1. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Używaj samców i/lub samic dorosłych myszy w wieku od 3 do 5 miesięcy. W niniejszym badaniu użyliśmy samców myszy C57BL / 6J uzyskanych z Jackson Laboratory, ale można użyć dowolnego szczepu myszy od renomowanego dostawcy.</li>
	<li>Co najmniej tydzień przed eksperymentem należy umieścić wszystkie myszy indywidualnie w cyklu światła/ciemności trwającym 12:12 godzin przez cały czas trwania badania. Zapewnij myszom ad libitum dostęp do pożywienia i wody.</li>
	<li>Wykonuj wszystkie eksperymenty behawioralne podczas cyklu światła. Wykonuj wszystkie sesje o tej samej porze dnia w ramach danej kohorty. Jeśli na przykład eksperyment rozpoczyna się o godzinie 9 rano pierwszego dnia, kontynuuj go o tej godzinie, aż eksperyment zostanie zakończony.</li>
</ol>
2. Przygotowanie materiałów do nauki
<ol>
	<li>Konteksty badawcze
	<ol>
		<li>Wybierz dwa różne konteksty, w których chcesz przeprowadzić eksperymenty.</li>
		<li>Użyj cylindrycznej komory złożonej z przezroczystej pleksiglasu (średnica 30 cm) jako kontekstu A, z gładką podłogą z pleksiglasu. Wysokość komory powinna być wystarczająca, aby zapobiec ucieczce (co najmniej 30 cm wysokości).</li>
		<li>W przypadku Kontekstu B należy użyć prostokątnej obudowy (25 cm x 30 cm) z podłogą z siatki elektrycznej używanej do dostarczania wstrząsów nożnych prądem przemiennym. Wysokość tej komory jest bardzo ważna i powinna wynosić co najmniej 35 cm. wysokości. Alternatywnie użyj przezroczystego dachu (upewnij się, że wideo może być nagrywane przez ten materiał). 
		UWAGA: Użyj komory o gładkich powierzchniach ścian, które można łatwo wyczyścić.</li>
		<li>Użyj innego roztworu czyszczącego, aby wyczyścić konteksty. Na przykład czysty kontekst A z 1% kwasem octowym, a kontekst B z 70% etanolem. Oczyść konteksty przed rozpoczęciem pierwszej sesji, między testowaniem poszczególnych myszy i po zakończeniu sesji dziennych. Jest to niezbędne, aby usunąć sygnały węchowe z poprzednich myszy. Dokładne czyszczenie pomoże również zapobiec osadzaniu się moczu na siatce uderzeniowej, co zagrozi sesjom kondycjonującym. 
		UWAGA: Roztwory czyszczące służą również jako wskazówka węchowa, dlatego używaj tego samego płynu czyszczącego w określonym kontekście.</li>
		<li>Umieść kontekst A lub kontekst B w pudełku tłumiącym dźwięk podczas odpowiednich sesji studyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generator dźwięku
	<ol>
		<li>Zamontuj głośnik górny nad kontekstami, aby dostarczać bodźce słuchowe na poziomie 75 dB.</li>
		<li>Użyj programowalnego generatora audio, aby wygenerować bodźce słuchowe zgodnie z wcześniej zdefiniowanym harmonogramem. Czysty ton 7,5 kHz to dźwięk o przebiegu sinusoidalnym, podczas gdy biały szum to losowy sygnał o równym natężeniu przy różnych częstotliwościach, w zakresie od 1 do 20 000 Hz.</li>
		<li>Używaj impulsów TTL do dostarczania bodźców słuchowych i sygnałów wstrząsowych z czasową precyzją. 
		UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentów zmierz natężenie dźwięku wyjściowego z zamontowanego głośnika w każdej komorze za pomocą miernika dB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Shocker: Podłącz wstrząs do podłogi sieci elektrycznej, która jest używana do dostarczania wstrząsu prądu przemiennego o natężeniu 0.9 mA. Określ częstotliwość, początek i czas trwania wstrząsów w programie komputerowym. Dostarczaj każdy bodziec uderzeniowy na końcu każdego SCS przez 1 s, co daje w sumie pięć par SCS-szok na sesję kondycjonowania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie programu komputerowego i śledzenie wideo
<ol>
	<li>Generuj protokoły behawioralne za pomocą kodowania w programie.</li>
	<li>W programie zdefiniuj szeregowy bodziec złożony SCS. Ten bodziec to seryjna prezentacja 10-sekundowego czystego tonu (każdy pips jest prezentowany przez 500 ms, z częstotliwością 7,5 kHz i częstotliwością 1 Hz) i 10-sekundowego białego szumu (500 ms pipsów przy 1 Hz).</li>
	<li>Zdefiniuj interwały międzybadawcze (ITI) prezentowane po każdym badaniu, pseudolosowo.</li>
	<li>Podczas badania nagraj całe zachowanie myszy na wideo w celu późniejszej analizy. 
	UWAGA: Dostępne na rynku pudełka kondycjonujące strach mogą nie być skonfigurowane do rejestrowania zachowań za pomocą kamery zamontowanej na górze. Jest to bardzo ważne, ponieważ nagrany film służy do obliczania ruchu poziomego, prędkości i całkowitej odległości przebytej przez zwierzę.</li>
	<li>Aby ustawić śledzenie programowe, umieść mysz testową w każdym odpowiednim kontekście, dostosuj czułość śledzenia konturu i zdefiniuj środek ciężkości. Zapewni to uzyskanie wiarygodnych danych na temat względnego położenia. Ponadto zdefiniuj cały obszar kontekstowy dostępny dla tematu. 
	UWAGA: Dostosowanie rozmiaru konturu dla obu kontekstów jest ważne, ponieważ zmiana jasności w różnych kontekstach zmieni rozmiar konturu.</li>
	<li>Określ współczynnik kalibracji, korzystając ze znanych rozmiarów komór i wymiarów pikseli kamery, które można wykorzystać do obliczenia prędkości (cm/s).</li>
	<li>Synchronizuj zdarzenia znacznika czasowego komputera do pobierania danych z ich wystąpieniami w czasie rzeczywistym.</li>
</ol>
4. Eksperyment behawioralny
<ol>
	<li>Włącz cały sprzęt: komputery, kontroler skrzynki kondycjonującej strach, szoker oraz oprogramowanie do nagrywania wideo i znaczników czasu. Upewnij się, że instrumenty są włączone w odpowiedniej kolejności.</li>
	<li>Sprawdź wszystkie funkcje, w tym ton, biały szum i dostarczanie wstrząsów, i skonfiguruj system do zbierania danych.</li>
	<li>Przetransportować zwierzęta z pomieszczenia do pomieszczenia do klimatyzacji. Pozwól im się tam zaaklimatyzować przez co najmniej 10 minut.</li>
	<li>Wyjmij zwierzę z domowej klatki, delikatnie umieść je w odpowiednim kontekście, a następnie natychmiast aktywuj programy komputerowe. 
	UWAGA: Inicjalizacja zarówno systemu warunkowania strachu, jak i oprogramowania do zbierania danych (znaczniki czasu, śledzenie myszy i nagrywanie wideo) na raz może być zsynchronizowana za pomocą aktywacji za pośrednictwem impulsów TTL.</li>
	<li>Kondycjonowanie wstępne/ekspozycja wstępna
	<ol>
		<li>Pierwszego dnia umieść badany w kontekście A (neutralnym kontekście). Pozwól mu zaaklimatyzować się w komorze przez 3 minuty (okres podstawowy), a następnie poddaj go 4 próbom SCS trwającym łącznie 20 s (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A-1B).</li>
		<li>Utrzymuj średnią 90 s pseudolosowy ITI (zakres 80-100 s). Całkowity czas trwania każdej sesji przedekspozycyjnej wynosi 590 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Warunkowanie strachu
	<ol>
		<li>W Dniu 2 i Dniu 3 umieść temat w Kontekście B. Po upływie 3-minutowego okresu bazowego wystaw badanego na pięć par SCS kończących się wstrząsem nożnym AC o natężeniu 1 s, 0,9 mA.</li>
		<li>Utrzymuj średni pseudolosowy ITI 120 s (zakres 90-150 s). Niech każda sesja kondycjonowania trwa łącznie 820 s (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>W zależności od celu eksperymentu, w dniu 4 myszy poddano testowi przypominania (patrz krok 4.7) lub w obawie przed wyginięciem (patrz krok 4.8).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przywołanie strachu (w celu przetestowania zależności od kontekstu)
	<ol>
		<li>W dniu 4 umieść temat w kontekście A. Po 3-minutowym okresie wyjściowym przedstaw mu 4 próby SCS bez wstrząsu stopowego, przez 590 s.</li>
		<li>Utrzymuj średnią 90 s pseudolosowy ITI (zakres 80-100 s).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygaśnięcie strachu
	<ol>
		<li>W dniu 4 umieść temat w kontekście B. Po 3-minutowym okresie wyjściowym przedstaw 16 prób SCS bez wstrząsu stopy, przez 1910 s.</li>
		<li>Utrzymuj średni pseudolosowy ITI z 90 s (zakres 60-120 s).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść zwierzę z powrotem w jego klatce domowej i powtórz procedurę dla wszystkich zwierząt.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja zachowania
<ol>
	<li>Poproś obserwatora, który jest ślepy na eksperyment, aby ocenił nagrane filmy pod kątem zachowania zamrażania za pomocą automatycznego progowania detektora zamrażania, a następnie analizy zmian pikseli klatka po klatce. 
	UWAGA: Inne pakiety oprogramowania mogą być również używane do automatycznego obliczania zamrażania przy użyciu systemu 2 kamer. Możliwe jest również, aby obserwator ręcznie ocenił zachowanie podczas zamrażania.</li>
	<li>Zdefiniuj zamrożenie jako całkowite zaprzestanie ruchów ciała, z wyjątkiem tych, które są wymagane do oddychania, przez co najmniej 1 s.</li>
	<li>Wynik skacze, gdy wszystkie 4 łapy odrywają się od podłogi, co powoduje ruch pionowy i/lub poziomy.</li>
	<li>Wyeksportuj zaznaczony plik ze znacznikami zamrożenia, skoku i zdarzenia.</li>
	<li>Wyodrębnij odpowiednie zdarzenia (zawieszanie się i skoki) ze zdefiniowanych okresów czasu (np. 10 s czasu trwania pre-SCS, ton i biały szum dla każdej próby).</li>
	<li>Korzystając z wyodrębnionych czasów trwania start-stop zdarzeń w pliku arkusza kalkulacyjnego, oblicz czas trwania zamrażania (w s), odejmując czas rozpoczęcia od czasu zakończenia od odpowiednich okresów próbnych.</li>
	<li>Przedstaw te dane w ujęciu próbnym lub dziennym, sumując czas zamarzania ze wszystkich prób. 
	UWAGA: W zależności od celu badania, zachowania związane z lotem lub zamrożeniem mogą być oceniane i obliczane na podstawie dowolnej próby/czasu trwania sesji badawczej.</li>
	<li>Suma łącznej liczby skoków z określonego czasu trwania próby.</li>
	<li>Wyodrębnij plik wygenerowany przez współrzędne śledzenia myszy z klatka po klatce ruchu osi X-Y środka ciężkości myszy i oblicz prędkość myszy (cm/s). 
	UWAGA: Dane dotyczące prędkości mogą być dostępne w formacie cm/s lub pikseli/s. Przelicz jednostkę pikseli/s na cm/s, używając wartości cal lub cm/piksel zdefiniowanej w filmie dla tego kontekstu testowego (patrz sekcja 3.6).</li>
	<li>Po wyodrębnieniu danych o prędkości ruchu zwierzęcia klatka po klatce, w oparciu o liczbę klatek na sekundę wideo (najlepiej 30 klatek/s), oblicz średnią prędkość zwierzęcia w określonym przedziale numerów klatek (pomnóż czas rozpoczęcia i zakończenia w s przez 30, aby uzyskać numer klatki początkowej i końcowej).</li>
	<li>Oblicz wyniki lotu, dzieląc średnią prędkość podczas każdego SCS przez średnią prędkość podczas 10 s przed SCS (linia bazowa, BL), a następnie dodając 1 punkt za każdy skok ewakuacyjny (prędkośćCS/speedBL + # skoków). Wynik lotu równy 1 oznacza zatem brak zmian w zachowaniu podczas lotu w porównaniu z okresem przed SCS.</li>
	<li>Opcjonalnie możesz ręcznie oceniać filmy pod kątem innych zachowań, takich jak odchow i pielęgnacja.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Analizowanie danych pod kątem istotności statystycznej przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej. Dla wszystkich testów definicja istotności statystycznej to P<0,05.</li>
	<li>Sprawdź dane dotyczące rozkładu normalnego za pomocą testu normalności Shapiro-Wilka (α=0,05).</li>
	<li>Aby przetestować wpływ wskazówek, przeprowadź porównania parami za pomocą odpowiedniego testu parametrycznego (sparowany test t) lub nieparametrycznego (test rang ze znakiem Wilcoxona).</li>
	<li>Aby ocenić dwukierunkową interakcję czynników (próba cue X), wykonaj dwukierunkową ANOVA, a następnie testy post-hoc (np. test wielokrotnego porównania Bonferroniego/test Tukeya).</li>
</ol>

<ol><li>Gross, C. T., Canteras, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+paths+to+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The many paths to fear.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (9), 651-658 (2012).</li>
<li>LeDoux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rethinking+the+Emotional+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rethinking the Emotional Brain.</a> Neuron. , (2012).</li>
<li>Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+Pavlovian+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of Pavlovian fear conditioning.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 897-931 (2001).</li>
<li>Johnson, P. L., Truitt, W. A., Fitz, S. D., Lowry, C. A., Shekhar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+pathways+underlying+lactate-induced+panic%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Neural pathways underlying lactate-induced panic.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (9), 2093-2107 (2008).</li>
<li>Mobbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+threat+to+fear%3A+The+neural+organization+of+defensive+fear+systems+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">From threat to fear: The neural organization of defensive fear systems in humans.</a> Journal of Neuroscience. 29 (39), 12236-12243 (2009).</li>
<li>Münsterkötter, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+or+no+spider%3F+neural+correlates+of+sustained+and+phasic+fear+in+spider+phobia%5BTitle%5D)+AND+%22Depression+and+Anxiety%22%5BJournal%5D)">Spider or no spider? neural correlates of sustained and phasic fear in spider phobia.</a> Depression and Anxiety. 32 (9), 656-663 (2015).</li>
<li>Kessler, R. C., Wai, T. C., Demler, O., Walters, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+severity%2C+and+comorbidity+of+12-month+DSM-IV+disorders+in+the+National+Comorbidity+Survey+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+General+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Prevalence, severity, and comorbidity of 12-month DSM-IV disorders in the National Comorbidity Survey Replication.</a> Archives of General Psychiatry. 62 (6), 617-627 (2005).</li>
<li>National Institute of Mental Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+anxiety+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22National+Institute+of+Mental+Health%22%5BJournal%5D)">Generalized anxiety disorder.</a> National Institute of Mental Health. , 3-8 (2017).</li>
<li>Herry, C., Johansen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+of+fear+learning+and+memory+in+distributed+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Encoding of fear learning and memory in distributed neuronal circuits.</a> Nature Neuroscience. 17 (12), 1644-1654 (2014).</li>
<li>Janak, P. H., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+circuits+to+behaviour+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From circuits to behaviour in the amygdala.</a> Nature. 517 (7534), 284-292 (2015).</li>
<li>Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuits+for+fear+and+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuits for fear and anxiety.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).</li>
<li>Seidenbecher, T., Laxmi, T. R., Stork, O., Pape, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdalar+and+hippocampal+theta+rhythm+synchronization+during+fear+memory+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amygdalar and hippocampal theta rhythm synchronization during fear memory retrieval.</a> Science. 301 (5634), 846-850 (2003).</li>
<li>Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Defensive behaviors, fear, and anxiety. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlanchard%2C+DC+%22Handbook+of+Anxiety+and+Fear.+Handbook+of+behavioral+neuroscience%22">Handbook of Anxiety and Fear. Handbook of behavioral neuroscience</a>. Blanchard, D. C. , Elsevier Academic Press. 63-79 (2008).</li>
<li>Perusini, J. N., Fanselow, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobehavioral+perspectives+on+the+distinction+between+fear+and+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Neurobehavioral perspectives on the distinction between fear and anxiety.</a> Learning and Memory. 22 (9), 417-425 (2015).</li>
<li>Fadok, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+competitive+inhibitory+circuit+for+selection+of+active+and+passive+fear+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses.</a> Nature. 542 (7639), 96-99 (2017).</li>
<li>Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+or+electrolytic+lesions+of+the+ventral+subiculum+produce+deficits+in+the+acquisition+and+expression+of+Pavlovian+fear+conditioning+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic or electrolytic lesions of the ventral subiculum produce deficits in the acquisition and expression of Pavlovian fear conditioning in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 113 (2), 283-290 (1999).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hippocampal+pathways+mediate+dissociable+roles+of+context+in+memory+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct hippocampal pathways mediate dissociable roles of context in memory retrieval.</a> Cell. 167 (4), 961-972 (2016).</li>
<li>Curzon, P., Rustay, N. R. Chapter 2: Cued and contextual fear conditioning for rodents. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCurzon%2C+P+%22Methods+of+Behavior+Analysis+in+Neuroscience.+2nd+edition%22">Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. 2nd edition</a>. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2009).</li>
<li>Mollenauer, S., Bryson, R., Robison, M., Phillips, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+avoidance+in+the+C57BL%2F6J+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Learning+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Noise avoidance in the C57BL/6J mouse.</a> Animal Learning & Behavior. 20 (1), 25-32 (1992).</li>
<li>Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+salience+determines+defensive+behaviors+elicited+by+aversively+conditioned+serial+compound+auditory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli.</a> eLife. 9, (2020).</li>
<li>Dong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cortico-intrathalamic+circuit+for+flight+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel cortico-intrathalamic circuit for flight behavior.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 941-949 (2019).</li>
<li>Borkar, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+behavioral+responses+during+a+conditioned+flight+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Sex differences in behavioral responses during a conditioned flight paradigm.</a> Behavioural Brain Research. 389, 112623(2020).</li>
<li>Fadok, J. P., Markovic, M., Tovote, P., Lüthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+perspectives+on+central+amygdala+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">New perspectives on central amygdala function.</a> Current Opinion in Neurobiology. 49, 141-147 (2018).</li>
<li>Pitman, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+studies+of+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biological studies of post-traumatic stress disorder.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (11), 769-787 (2012).</li>
<li>Canteras, N. S., Graeff, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Executive+and+modulatory+neural+circuits+of+defensive+reactions%3A+Implications+for+panic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Executive and modulatory neural circuits of defensive reactions: Implications for panic disorder.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. , (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane parametry dźwięku i wstrząsu są istotnymi elementami tego protokołu. Dlatego tak ważne jest, aby przed rozpoczęciem eksperymentów przetestować amplitudę wstrząsów i poziom ciśnienia akustycznego. Badania kondycjonowania strachu zwykle wykorzystują poziomy ciśnienia akustycznego 70-80 dB i intensywność wstrząsów 0,1-1 mA18; Tym samym opisane parametry mieszczą się w granicach tradycyjnych paradygmatów warunkowania strachu. W poprzednim eksperymencie kontrolnym tylko CS (bez wstrząsu stopą) ...

Strach jest ewolucyjnie zachowaną reakcją adaptacyjną na bezpośrednie zagrożenie1,2. Podczas gdy organizmy posiadają wrodzone reakcje obronne na zagrożenie, wyuczone skojarzenia są kluczowe dla wywołania odpowiednich reakcji obronnych na bodźce przewidujące niebezpieczeństwo3. Rozregulowanie obwodów mózgowych kontrolujących reakcje obronne prawdopodobnie przyczynia się do nieprzystosowawczych reakcji związanych z wieloma wyniszczającymi zaburzeniami lękowymi, takimi jak zespół stresu pourazowego (PTSD), zespół lęku napadowego4 i fobie specyficzne5,6. Częstość występowania zaburzeń lękowych w Stanach Zjednoczonych wynosi 19,1% dla dorosłych i 31,9% dla młodzieży7,8. Obciążenie tymi chorobami jest niezwykle duże w codziennej rutynie osób i negatywnie wpływa na jakość ich życia.
W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat, warunkowanie strachu Pawłowa służyło jako potężny system modelowy, który pozwolił uzyskać ogromny wgląd w mechanizmy neuronalne leżące u podstaw uczenia się i pamięci związanej ze strachem9,10,11. Warunkowanie strachu Pawłowa polega na sparowaniu bodźca warunkowego (CS, takiego jak bodziec słuchowy) z awersyjnym bodźcem bezwarunkowym (US; na przykład elektryczny wstrząs stopą)12. Ponieważ zamrożenie jest dominującym zachowaniem wywoływanym i mierzonym w standardowych paradygmatach warunkowania Pawłowa, mechanizmy kontroli neuronalnej aktywnych form zachowań obronnych, takich jak reakcje ucieczki/ucieczki, pozostają w dużej mierze niezbadane. Wcześniejsze badania pokazują, że różne formy zachowań obronnych, takich jak ucieczka, są wywoływane w zależności od intensywności zagrożenia, bliskości i kontekstu13,14. Badanie, w jaki sposób mózg kontroluje różne rodzaje zachowań obronnych, może znacząco przyczynić się do zrozumienia procesów neuronalnych, które są rozregulowane w zaburzeniach lękowych i lękowych.
Aby zaspokoić tę krytyczną potrzebę, opracowaliśmy zmodyfikowany paradygmat warunkowania Pawłowa, który wywołuje skoki ucieczki i ucieczki, oprócz zamrażania15. W tym paradygmacie myszy są warunkowane bodźcem szeregowym złożonym (SCS) składającym się z czystego tonu, po którym następuje biały szum. Po dwóch dniach parowania SCS z silnym elektrycznym wstrząsem nożnym, myszy wykazują zamrożenie w odpowiedzi na składową tonu i ucieczkę podczas białego szumu. Behawioralne przełączanie między warunkowym zamrożeniem a zachowaniem podczas lotu jest szybkie i konsekwentne. Co ciekawe, myszy wykazują zachowanie podczas lotu tylko wtedy, gdy biały szum CS jest prezentowany w tym samym kontekście, co wcześniej dostarczony wstrząs stopowy (kontekst kondycjonowania), ale nie w neutralnym kontekście. Zamiast tego w tym neutralnym kontekście dominują reakcje zamrożenia, ze znacznie wyższym poziomem zamrożenia w odpowiedzi na biały szum w porównaniu z tonem. Jest to zgodne z rolą kontekstu w modulowaniu intensywności reakcji obronnej oraz z regulacyjną rolą informacji kontekstowej w uczeniu się i pamięci związanej ze strachem, którą można znaleźć w tradycyjnych paradygmatach warunkowania zagrożeń16,17. Model ten pozwala na bezpośrednie, wewnątrzobiektowe porównania wielu zachowań obronnych w sposób specyficzny dla kontekstu.

<table><tbody><tr><td>Neutralny kontekst</td><td></td><td></td><td>Cylinder z pleksi 30 X 30 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Pudełko do kondycjonowania strachu</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>VFC-008</td><td>Wymiary 25 X 30 X 35 cm</td></tr><tr><td>Generator audio&nbsp;</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>ANL-926&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Shocker</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV-414S</td><td>Głośnik siatkowy ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td></td><td>Med Associates, Inc.</td><td>ENV-224AM</td><td>Nadaje się do czystych tonów i białego szumu&nbsp;</td></tr><tr><td>Myszy C57/BL6J Laboratorium</td><td>Jacksona, USA</td><td>664</td><td>W wieku 3-5 miesięcy</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Cineplex (Editor/ studio)</td><td>Plexon</td><td>CinePlex Studio v3.8.0</td><td>Do śledzenia wideo i analizy punktacji behawioralnej</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MedPC V</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>SOF-736</td><td></td></tr><tr><td>Neuroexplorer</td><td>Plexon</td><td></td><td>Służy do wyodrębniania danych o zamrożeniu uzyskanych w PlexonEditor</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td>Wersja 8</td><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td></tr></tbody></table>

nowy paradygmat warunkowania strachu pawłowa do badania zachowań związanych z zamarzaniem i ucieczką

A Novel Pavlovian Fear Conditioning Paradigm to Study Freezing and Flight Behavior

Zachowania związane ze strachem i lękiem znacząco przyczyniają się do przetrwania organizmu. Jednak przesadne reakcje obronne na postrzegane zagrożenie są charakterystyczne dla różnych zaburzeń lękowych, które są najbardziej rozpowszechnioną formą choroby psychicznej w Stanach Zjednoczonych. Odkrycie mechanizmów neurobiologicznych odpowiedzialnych za zachowania obronne pomoże w opracowaniu nowych interwencji terapeutycznych. Warunkowanie strachu Pawłowa jest szeroko stosowanym paradygmatem laboratoryjnym do badania uczenia się i pamięci związanej ze strachem. Głównym ograniczeniem tradycyjnych paradygmatów warunkowania strachu Pawłowa jest to, że zamrożenie jest jedynym monitorowanym zachowaniem obronnym. Niedawno opracowaliśmy zmodyfikowany paradygmat warunkowania strachu Pawłowa, który pozwala nam badać zarówno uwarunkowane zamrożenie, jak i zachowanie ucieczki (znane również jako ucieczka) u poszczególnych badanych. Model ten wykorzystuje wstrząsy stopy o większej intensywności i większą liczbę par między bodźcem warunkowym a bodźcem bezwarunkowym. Dodatkowo, ten paradygmat lotu warunkowego wykorzystuje seryjną prezentację bodźców słuchowych o czystym tonie i białym szumie jako bodźca warunkowego. Po warunkowaniu w tym paradygmacie myszy wykazują zachowanie zamrożenia w odpowiedzi na bodziec dźwiękowy i reakcje ucieczki podczas białego szumu. Ten model warunkowania można zastosować do badania szybkich i elastycznych przejść między reakcjami behawioralnymi niezbędnymi do przetrwania.

Zgodnie z opisem na schemacie (Rycina 1A), sesja rozpoczyna się od wstępnej ekspozycji (Dzień 1), po której następuje warunkowanie lękowe (Dni 2 i 3), a następnie wygaszanie lub przywoływanie (Dzień 4).
Prezentacje SCS w sesji przedekspozycyjnej (Dzień 1) nie wywołały reakcji ucieczki ani zamarcia u myszy (Rysunek 2A-2B). Analiza behawioralna podczas warunkowania (Dni 2 i 3) wykazała, że komponent dźwiękowy SCS znaczą...

Defensywne reakcje behawioralne zależą od intensywności zagrożenia, bliskości i kontekstu ekspozycji. Opierając się na tych czynnikach, opracowaliśmy klasyczny paradygmat warunkowania, który wywołuje wyraźne przejścia między warunkowym zamrożeniem a zachowaniem podczas lotu u poszczególnych badanych. Model ten ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patologii związanych z zaburzeniami lękowymi, panikowymi i stresem pourazowym.

Nowy paradygmat warunkowania strachu Pawłowa do badania zachowań związanych z zamarzaniem i ucieczką

Fear- and anxiety-related behaviors significantly contribute to an organism&#8217;s survival. However, exaggerated defensive responses to perceived threat ...

Ogólnym celem tego paradygmatu jest ocena złożonych zachowań obronnych gryzoni. Protokół ten jest istotny, ponieważ ułatwia badania nad przejściami między zachowaniami obronnymi, co czyni go idealnym rozwiązaniem dla badaczy zainteresowanych badaniem złożonych reakcji adaptacyjnych na zagrożenie. Protokół ten wykorzystuje tymczasowo precyzyjne bodźce warunkowe w celu wywołania przejścia między reakcjami obronnymi, co pozwala nam badać zarówno warunkowe zamrożenie, jak i zachowania związane z ucieczką w obrębie indywidualnego podmiotu.Wykorzystanie tego modelu do odkrycia mechanizmów zachowań obronnych może zapewnić wgląd w dysfunkcje związane z PTSD i zaburzenia lękowe oraz może pomóc w opracowaniu nowych metod terapeutycznych. Aby skonfigurować protokoły behawioralne, w programie zdefiniuj SCS, ustawiając bodźce, które mają być dostarczane jako dziesięciosekundowy czysty ton lub dziesięciosekundowy biały szum, oraz definiując interwały między próbami, które mają być prezentowane pseudolosowo po każdej próbie. Aby skonfigurować śledzenie programowe, umieść mysz testową w każdym odpowiednim kontekście, zdefiniuj środek ciężkości i dostosuj rozmiar konturu.Użyj rozmiaru komór i wymiarów pikseli kamery, aby określić współczynnik kalibracji. Następnie wygeneruj kod impulsowy TTL do synchronizacji znaczników zdarzeń komputera centralnego z ich wystąpieniami w czasie rzeczywistym. Przed rozpoczęciem eksperymentu włącz kontroler skrzynki kondycjonującej strach, szoker i oprogramowanie do nagrywania wideo.Zamontuj głośnik górny nad kontekstami dostarczania bodźców słuchowych o natężeniu 75 decybeli i ustaw programowalny generator audio tak, aby generował bodźce słuchowe zgodnie z predefiniowanym harmonogramem. Po potwierdzeniu, że ton i biały szum działają, ustaw system na akwizycję danych i przetransportuj trzymiesięczne samce lub samice myszy do pomieszczenia klimatyzacyjnego. Przed rozpoczęciem próby kondycjonowania wstępnego wyczyść przezroczystą cylindryczną komorę z pleksiglasu o średnicy 30 centymetrów i wysokości 30 centymetrów 1% kwasem octowym, która ma być używana jako komora Kontekst A.W celu przygotowania do przygotowania umieść mysz w kontekście A i pozwól jej zaaklimatyzować się przez trzy minuty, a następnie wystawij mysz na cztery 20-sekundowe ślady SCS ze średnim pseudolosowym interwałem między próbami wynoszącym 90 sekund. Po 10 minutach aklimatyzacji przenieś jedną mysz do komory Kontekstu A i natychmiast aktywuj system warunkowania strachu i programy do zbierania danych. Przed rozpoczęciem eksperymentu z warunkowaniem strachu wyczyść prostokątną obudowę o wysokości co najmniej 35 centymetrów i wymiarach 25 na 30 centymetrów z podłogą z siatki elektrycznej z 70% etanolem, który ma być użyty jako komora Kontekst B.Następnie należy połączyć wstrząs z podłogą sieci elektrycznej komory Kontekst B i zdefiniować częstotliwość, początek i czas trwania wstrząsów w odpowiednim programie komputerowym. Po ustawieniu wszystkich parametrów sprawdź, czy intensywność wstrząsu jest prawidłowo dostarczana zarówno z amortyzatora, jak i z podłogi siatki. W drugim i trzecim dniu umieść mysz w komorze Kontekstu B na trzy minuty, a następnie wystawij zwierzę na pięć par SCS, które kończą się jednosekundowym wstrząsem o natężeniu 0,9 miliampera AC i średnim interwałem między próbami wynoszącym 120 sekund.Pod koniec sesji umieść mysz z powrotem w klatce domowej. W zależności od celu eksperymentu, aby poddać zwierzęta sesji Przywołania, w czwartym dniu umieść mysz w komorze Kontekstu A na trzy minuty przed przedstawieniem zwierzęciu czterech prób SCS bez wstrząsu stopy ze średnią 90-sekundową pseudolosową interwałem między próbami przez 590 sekund, aby przetestować reakcję zwierzęcia na przywołanie strachu. Lub, aby przetestować wygaszanie strachu, w czwartym dniu umieść mysz w komorze Kontekstu B na trzy minuty przed poddaniem zwierzęcia 16 próbom SCS bez wstrząsu stopy ze średnią 90-sekundową pseudolosową interwałem między próbami przez okres 1910 sekund.Aby określić ilościowo zachowanie myszy, pod koniec eksperymentu poproś obserwatora, który nie śledzi analizy, aby ocenił nagrane filmy pod kątem zachowania zamrażania za pomocą automatycznego progowania detektora zamrażania, a następnie analizy zmian pikseli klatka po klatce. Zamrożenie należy zdefiniować jako całkowite zaprzestanie ruchów ciała, z wyjątkiem tych, które są niezbędne do oddychania przez co najmniej jedną sekundę. Wykonaj skok w sytuacji, gdy wszystkie cztery łapy opuszczają podłogę, co skutkuje ruchem pionowym i/lub poziomym.Po przeanalizowaniu całego segmentu wyeksportuj oznaczony plik ze znacznikami zawieszania, skoku i zdarzeń i wyodrębnij odpowiednie zdarzenia ze zdefiniowanych okresów zainteresowania do arkusza kalkulacyjnego. Aby obliczyć czas trwania zamrażania, odejmij czas rozpoczęcia od czasu zakończenia dla każdego odpowiedniego okresu próbnego. Suma łącznej liczby skoków z określonego czasu trwania próby.Aby obliczyć szybkość myszy, śledź współrzędne od ruchu osi XY klatka po klatce środka ciężkości myszy. Aby obliczyć wyniki lotu, podziel średnią prędkość podczas każdego SCS przez średnią prędkość podczas dziesięciu sekund przed SCS i dodaj jeden punkt za każdy skok ewakuacyjny. Wynik lotu równy jeden wskazuje na brak zmian w zachowaniu podczas lotu w porównaniu z okresem przed SCS.Następnie przeanalizuj dane pod kątem istotności statystycznej za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy statystycznej. Prezentacje SCS w sesji przedekspozycyjnej nie wywołują reakcji ucieczki lub zamrożenia u myszy. Analiza behawioralna podczas kondycjonowania ujawnia, że komponent Tone SCS znacznie zwiększa zamrażanie w porównaniu z zamrażaniem podczas pre-SCS.Wyniki lotu zmieniały się znacznie w różnych sesjach, a myszy wykazywały wyższe prędkości i więcej skoków do sygnału białego szumu w porównaniu ze sygnałem tonowym. Myszy wykazują wyraźną zmianę zachowań obronnych, wykazując niższe wyniki lotu podczas tonu i wyższe wyniki lotu podczas białego szumu, z odwrotnym skutkiem obserwowanym w przypadku reakcji zamrożenia. Myszy poddane 16 próbom treningu wymierania wykazują szybkie wygaszanie uwarunkowanego lotu, przy czym wyniki walki podczas pierwszego bloku czterech prób były wyższe podczas białego szumu w porównaniu ze wskazówkami tonowymi.Pod koniec sesji wymierania zachowanie w locie nie jest już wywoływane przez żadną wskazówkę. Zamrożenie do tonu jest znacznie wyższe niż zamrożenie do białego szumu dla pierwszego bloku z czterech prób podczas wymierania. Zamrożenie wywołane tonem zmniejsza się w ciągu 16 prób wygaszania, podczas gdy obserwuje się wzrost zamrażania za pośrednictwem białego szumu.W sesji Przywołania ekspozycja na biały szum w neutralnym kontekście nie wywołuje ucieczki, ponieważ wyniki lotu są poniżej jednego. Raczej prezentacje Białego Szumu w neutralnym kontekście wywołują zamrażające reakcje, które są wyższe niż te wywołane przez Ton. Ważne jest, aby dokładnie oczyścić kontekst i bardzo ważne jest, aby przetestować amplitudę wstrząsu i poziom ciśnienia akustycznego przed rozpoczęciem eksperymentu.Ten paradygmat jest obecnie używany przez grupy, które są zainteresowane zrozumieniem złożoności zachowań obronnych i może być wykorzystany do pogłębienia naszego zrozumienia wyboru działań obronnych.

a-novel-pavlovian-fear-conditioning-paradigm-to-study-freezing-flight

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Warunkowany lęk może zostać zredukowany poprzez proces hamowania nazywany wygaszaniem, jednak może on powrócić w określonych warunkach, takich jak upływ czasu lub ekspozycja na stres. Nasz protokół przedstawia nową metodę zapobiegania powrotowi lęku poprzez wprowadzenie wygaszania podczas okna rekonsolidacji (fazy ponownego utrwalania reaktywowanego wspomnienia).

Trening wygaszania w oknie rekonsolidacji zapobiega powrotowi lęku

Źródło: Childs, J. E., et al. Stymulacja nerwu błędnego jako narzędzie do indukowania plastyczności w szlakach istotnych dla uczenia się wymierania. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje metodę stymulacji nerwu błędnego (VNS) w modelu szczura w celu zmniejszenia zachowania związanego z zamarzaniem. Szczury uwarunkowane strachem otrzymują VNS podczas ponownej ekspozycji na dźwięk, co prowadzi do zmniejszenia zamrażania i ujawnia jego potencjał terapeutyczny.

Stymulacja nerwu błędnego w modelu szczura w celu zmniejszenia zachowania związanego z zamarzaniem

Ten artykuł przedstawia protokół dla kontekstowego i podpowiedzianego testu warunkowania strachu przy użyciu systemu analizy wideo do oceny uczenia się strachu i pamięci u myszy.

Kontekstowy i sygnalizowany test warunkowania strachu przy użyciu systemu analizy wideo u myszy

W poniższym eksperymencie opisujemy protokół warunkowania strachu śladowego u myszy. Ten rodzaj pamięci asocjacyjnej obejmuje okres śladowy, który oddziela bodziec neutralny od bodźca bezwarunkowego.

Warunkowanie strachu śladowego u myszy

Ten protokół opisuje metodę chemicznego rozpalania pentylenotetrazolu i dostarcza mysi model padaczki. Protokół ten może być również wykorzystany do badania podatności na indukcję i patogenezę napadów padaczkowych po napadach padaczkowych u myszy.

Model rozpałki indukowany pentylenotetrazolem

Tutaj opisujemy szczegółową metodologię wymaganą do przeprowadzenia eksperymentów z uczeniem się strachu wzmocnionego stresem (SEFL), przedklinicznego modelu zespołu stresu pourazowego, zarówno u szczurów, jak i myszy. Model wykorzystuje aspekty warunkowania i zamrażania strachu Pawłowa jako wskaźnik zwiększonego strachu u gryzoni.

Uczenie się strachu wzmocnione stresem, solidny model zespołu stresu pourazowego u gryzoni

Opisujemy rozszerzony protokół warunkowania strachu, który powoduje przetrenowanie i inkubację strachu u szczurów. Protokół ten obejmuje pojedynczą sesję treningową z 25 parami ton-shock (tj. przetrenowanie) i porównaniem reakcji warunkowego zamrażania podczas testów kontekstowych i cue 48 godzin (krótkoterminowo) i 6 tygodni (długoterminowo) po treningu.

Inkubacja strachu przy użyciu rozszerzonego protokołu warunkowania strachu dla szczurów

Aby badać zachowania związane z lotem w kontekście strachu, wprowadzamy zmodyfikowany protokół warunkowania strachu. Protokół ten zapewnia, że myszy konsekwentnie wykazują zachowania związane z lotem podczas prezentacji wskazówek w warunkowaniu strachu.

Zmodyfikowane warunkowanie strachu w celu wywołania zachowań związanych z lotem u myszy

Paradygmat strachu obserwacyjnego ocenia zastępcze zamrożenie u gryzoni jako model empatii afektywnej. Procedura ta polega na wystawieniu gryzoni-obserwatorów na działanie demonstrantów tego samego gatunku, którzy otrzymują awersyjne wstrząsy stopami w celu wywołania empatycznych reakcji zamrożenia. Stosując obserwacyjne testy strachu, naukowcy mogą zbadać mechanizmy neuronalne leżące u podstaw empatii afektywnej.

Strach obserwacyjny jako model empatii afektywnej u myszy

Opisano procedurę badania zdolności kontekstu środowiskowego związanego z alkoholem do wywoływania u szczurów wznowienia zachowań związanych z poszukiwaniem alkoholu.

Procedura obserwacji wywołanego kontekstem odnowienia zachowań związanych z poszukiwaniem alkoholu uwarunkowanych przez Pawłowa u szczurów

Poznaj nowy paradygmat warunkowania strachu Pawłowa do badania zachowań związanych z zamarzaniem i ucieczką u gryzoni. Ta metoda pozwala analizować mechanizmy zachowań obronnych związanych z PTSD i zaburzeniami lękowymi.

Nowy paradygmat warunkowania strachu Pawłowa do badania zachowań związanych z zamarzaniem i ucieczką

Przeglądaj więcej filmów