Name: Zgniatanie wypławków jako ilościowy odczyt behawioralny dla wyczuwania szkodliwych bodźców (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy zachowań wypławków słodkowodnych w odpowiedzi na szkodliwe bodźce. Technika ta umożliwia badanie funkcji układu nerwowego i ocenę wpływu ksenobiotyków na organizm.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Panu Tapan Goelowi za komentarze do manuskryptu. Praca ta została sfinansowana ze środków NSF CAREER Grant 1555109.

<ol><li>Rink, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+systems+and+regeneration+in+planaria%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Stem cell systems and regeneration in planaria.</a> Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).</li>
<li>Reddien, P. W., Alvarado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+Planarian+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of Planarian Regeneration.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).</li>
<li>Cebrià, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+the+central+nervous+system%3A+how+easy+for+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Regenerating the central nervous system: how easy for planarians.</a> Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).</li>
<li>Pearl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memoirs%3A+The+Movements+and+Reactions+of+Fresh-Water+Planarians%3A+A+Study+in+Animal+Behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour.</a> Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).</li>
<li>Mc Connell, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMc+Connell%2C+J+%22A+Manual+of+Psychological+Experimentation+on+Planarians%22">A Manual of Psychological Experimentation on Planarians</a>. , Planarian Press. (1967).</li>
<li>Talbot, J., Schötz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+planarian+wild-type+behavior+as+a+platform+for+screening+locomotion+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes.</a> Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).</li>
<li>Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrunching%3A+a+novel+escape+gait+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Scrunching: a novel escape gait in planarians.</a> Physical Biology. 12, 055001(2015).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+shows+decision-making+behavior+in+response+to+multiple+stimuli+by+integrative+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Letters%22%5BJournal%5D)">Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function.</a> Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).</li>
<li>Arenas, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+planarian+TRPA1+by+reactive+oxygen+species+reveals+a+conserved+mechanism+for+animal+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception.</a> Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).</li>
<li>Shomrat, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+training+paradigm+reveals+long-term+memory+in+planarians+and+its+persistence+through+head+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration.</a> Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).</li>
<li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Second-Generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+Molecularly-Tractable+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms.</a> PLoS One. 5, 1-20 (2010).</li>
<li>Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nervous+system+development+and+regeneration+in+freshwater+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews-Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nervous system development and regeneration in freshwater planarians.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266(2017).</li>
<li>Cebrià, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+neural-specific+genes+reveals+the+structural+and+molecular+complexity+of+the+planarian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system.</a> Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).</li>
<li>Mineta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolutionary+process+of+the+CNS+elucidated+by+comparative+genomics+analysis+of+planarian+ESTs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).</li>
<li>Ross, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SoxB1+Activity+Regulates+Sensory+Neuron+Regeneration%2C+Maintenance%2C+and+Function+in+Planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians.</a> Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+Dopaminergic+Neural+Network+and+Locomotion+Function+in+Planarian+Regenerates%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).</li>
<li>Birkholz, T. R., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+planarian+TRPA1+homolog+mediates+extraocular+behavioral+responses+to+near-ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).</li>
<li>Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+sources+of+hedgehog+modulate+neurogenesis+in+the+adult+planarian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smed-dynA-1+is+a+planarian+nervous+system+specific+dynamin+1+homolog+required+for+normal+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion.</a> Biology Open. , 1-8 (2014).</li>
<li>Currie, K. W., Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+lhx1%2F5-1+and+pitx+are+required+for+the+maintenance+and+regeneration+of+serotonergic+neurons+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians.</a> Development. 140, 3577-3588 (2013).</li>
<li>Hagstrom, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+cholinesterase%3A+molecular+and+functional+characterization+of+an+evolutionarily+ancient+enzyme+to+study+organophosphorus+pesticide+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity.</a> Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).</li>
<li>Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+brain+regeneration+as+a+model+system+for+developmental+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology.</a> Regeneration. 3, 65-77 (2016).</li>
<li>Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshwater+planarians+as+an+alternative+animal+model+for+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology.</a> Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).</li>
<li>Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-behavioral+endpoint+testing+of+an+87-chemical+compound+library+in+freshwater+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians.</a> Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).</li>
<li>Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+neurotoxic+potential+of+15+flame+retardants+using+freshwater+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology+and+Teratology%22%5BJournal%5D)">Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians.</a> Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).</li>
<li>Wu, J. P., Li, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+freshwater+planarians+in+environmental+toxicology+studies%3A+Advantages+and+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).</li>
<li>Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+ciliary+assembly+and+function+in+planaria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of ciliary assembly and function in planaria.</a> Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).</li>
<li>Sabry, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+or+genetic+targeting+of+Transient+Receptor+Potential+%28TRP%29+channels+can+disrupt+the+planarian+escape+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response.</a> PLoS One. , 753244(2019).</li>
<li>Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slo1+regulates+ethanol-induced+scrunching+in+freshwater+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians.</a> Physical Biology. 13, 1-12 (2016).</li>
<li>Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+zebrafish+and+planarian+model+systems+for+developmental+neurotoxicity+screens+using+an+87-compound+library%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library.</a> Toxicological Sciences. , (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Behaviors+and+Wall-Curvature+Lead+to+Apparent+Wall+Preference+in+Planarian%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian.</a> PLoS One. 10, 0142214(2015).</li>
<li>Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+Phototactic+Assay+Reveals+Differential+Behavioral+Responses+Based+on+Wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength.</a> PLoS One. 9, 114708(2014).</li>
<li>Petrus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+TRPA1+in+mechanical+hyperalgesia+is+revealed+by+pharmacological+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition.</a> Molecular Pain. 3, 40(2007).</li>
<li>Takano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration-dependent+conditional+gene+knockdown+%28Readyknock%29+in+planarian%3A+Demonstration+of+requirement+for+Djsnap-25+expression+in+the+brain+for+negative+phototactic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior.</a> Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+glutamic+acid+decarboxylase+gene+and+distribution+of+GABAergic+nervous+system+in+the+planarian+Dugesia+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica.</a> Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermosensory+signaling+by+TRPM+is+processed+by+brain+serotonergic+neurons+to+produce+planarian+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis.</a> Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korzystając z tego protokołu, można ilościowo badać wpływ bodźców fizycznych i chemicznych 7,28,29 lub manipulacji genetycznej (RNAi)28,29 na lokomocję wypławków. Aby zmaksymalizować rozdzielczość przestrzenną, najlepiej jest przesunąć kamerę jak najbliżej areny, upewniając się, że cała arena znajduje się w polu widzenia. Aby zwiększyć przepustowość, zachowanie wielu wyp...

Oprócz ich popularności w badaniach nad komórkami macierzystymi i regeneracją1,2,3, słodkowodne wypławki od dawna są wykorzystywane w badaniach behawioralnych4,5, wykorzystując ich stosunkowo duży rozmiar (kilka milimetrów długości), łatwość i niski koszt utrzymania laboratorium oraz szerokie spektrum obserwowalnych zachowań. Wprowadzenie wizji komputerowej i automatycznego śledzenia do badań nad zachowaniem wypławków6,7,8,9,10,11 umożliwiły ilościowe zróżnicowanie fenotypów behawioralnych. Zachowanie zwierząt to bezpośredni odczyt funkcji neuronalnych. Ponieważ płaski układ nerwowy jest średniej wielkości i złożoności, ale dzieli konserwatywne kluczowe elementy z mózgiem kręgowców12,13,14, badanie zachowania wypławków może dostarczyć wglądu w konserwatywne mechanizmy działania neuronów, które mogą być trudne do bezpośredniego zbadania w bardziej złożonych organizmach. Tak więc wypławki są cennym modelem dla porównawczych badań neurobiologicznych8,12,15,16,17,18,19,20,21. Ponadto środowisko wodne pozwala na szybką i łatwą ekspozycję na chemikalia w celu zbadania ich wpływu na funkcjonowanie mózgu u regenerujących się i dorosłych wypławków, co czyni je popularnym systemem w neurotoksykologii22,23,24,25,26.
Planarianie posiadają trzy różne chody, określane jako ślizganie, perystaltyka i zgniatanie. Każdy chód jest prezentowany w określonych okolicznościach: ślizganie się jest chodem domyślnym, perystaltyka występuje, gdy funkcja rzęsek jest zaburzona7,27, a zgniatanie to chód ucieczki – niezależny od funkcji rzęsek – w odpowiedzi na pewne szkodliwe bodźce7. Wykazaliśmy, że zgniatanie jest specyficzną reakcją, wywoływaną przez odczuwanie pewnych sygnałów chemicznych lub fizycznych, w tym ekstremalnych temperatur lub pH, urazów mechanicznych lub określonych induktorów chemicznych, a zatem nie jest ogólną reakcją na stres7,28,29.
Ze względu na swoją specyficzność i stereotypowe parametry, które można łatwo określić ilościowo za pomocą tego protokołu, zgniatanie jest potężnym fenotypem behawioralnym, który umożliwia badaczom przeprowadzanie badań mechanistycznych analizujących ścieżki czuciowe i neuronalną kontrolę zachowania25,28. Ponadto wykazano, że zgniatanie jest czułym punktem końcowym do oznaczania niekorzystnego wpływu chemicznego na rozwój i funkcjonowanie układu nerwowego w badaniach neurotoksykologicznych22,24,25,30. Ponieważ kilka różnych ścieżek czuciowych wydaje się zbiegać, aby wywołać zgniatanie za pomocą różnych mechanizmów28, zgniatanie różni się od innych zachowań wypławkowych, ponieważ różne, ale specyficzne bodźce mogą być wykorzystywane do analizowania odrębnych obwodów neuronalnych i badania, w jaki sposób różne sygnały są integrowane w celu wytworzenia fenotypu zgniatania.
Co ważne, istnieją różnice gatunkowe, gdzie jedna substancja chemiczna może wywołać zgniatanie u jednego gatunku wypławków, ale inną reakcję behawioralną u innego. Na przykład odkryliśmy, że anandamid indukuje zgniatanie u wypławków Dugesia japonica, ale wywołuje perystaltykę u Schmidtea mediterranea28. Przykład ten podkreśla, jak ważna jest umiejętność niezawodnego rozróżniania różnych chodów, ponieważ są one fenotypowymi przejawami różnych mechanizmów molekularnych. Jednak odróżnienie zgniatania od perystaltyki jelit jest trudne przy użyciu jakościowych danych obserwacyjnych, ponieważ oba chody są napędzane muskulaturą i mają podobieństwa jakościowe7,28. W związku z tym, aby rozróżnić chody, konieczne jest wykonanie obrazowania rzęsek lub ilościowego badania behawioralnego, które pozwala na rozróżnienie na podstawie charakterystycznych parametrów7,28. Ponieważ obrazowanie rzęsek jest eksperymentalnie trudne i wymaga specjalistycznego sprzętu, takiego jak mikroskop złożony o dużym powiększeniu i szybka kamera7,28, nie jest tak szeroko dostępne dla badaczy, jak ilościowa analiza behawioralna.
Tutaj prezentujemy protokół (1) indukcji zgniatania za pomocą różnych bodźców fizycznych (szkodliwa temperatura, amputacja, światło bliskie UV) i chemicznych (izotiocyjanian allilu (AITC), aldehyd cynamonowy) oraz (2) ilościowej analizy zachowania wypławków za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania. Określając ilościowo cztery parametry (częstotliwość oscylacji długości ciała, prędkość względna, maksymalna amplituda oraz asymetria wydłużania i kurczenia się ciała)7, zgniatanie można odróżnić od szybowania, perystaltyki jelit i innych stanów behawioralnych opisywanych w literaturze, takich jak lokomocja przypominająca węża15 lub epilepsje15. Co więcej, podczas gdy zgniatanie jest zachowane wśród różnych gatunków wypławków7, każdy gatunek ma swoją własną charakterystyczną częstotliwość i prędkość; W związku z tym, po ustaleniu prędkości ślizgania i zgniatania gatunku, sama prędkość może być użyta jako środek do odróżnienia zgniatania od ślizgania się i perystaltyki29. Protokół zakłada brak wcześniejszego szkolenia w zakresie obliczeniowej analizy obrazu lub badań behawioralnych, a zatem może być również stosowany do eksperymentów behawioralnych wypławków w kontekście laboratorium dydaktycznego na poziomie licencjackim. Przykładowe dane ułatwiające adaptację protokołu znajdują się w materiałach uzupełniających.

<table><tbody><tr><td>Izotiocyjanian allilu, 95% (AITC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>377430-5G</td><td>UWAGA:&nbsp; Łatwopalny i silnie toksyczny; w dygestorium z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.</td></tr><tr><td>Obiektyw aparatu, 2/3 25mm F/1.4&nbsp;</td><td>Tamron</td><td>23FM25SP</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych, 6-dołkowe, poddane hodowli tkankowej</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe, 50 ml polipropylenu, sterylne</td><td>MedSupply Partners</td><td>62-1019-2</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd cynamonowy, >95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W228613-100G-K</td><td></td></tr><tr><td>Ściemnialna kaseton świetlny A4 LED Tracer</td><td>Amazon</td><td>B07HD631RP</td><td></td></tr><tr><td>Flea3 Kamera USB3</td><td>FLIR</td><td>FL3-U3-13E4M</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice żaroodporne</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-394-298</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Fisher Scientific</td><td>HP88854200</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt, przygotowana w wodzie dejonizowanej</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td>Przygotować w wodzie dejonizowanej w stężeniu 0,5 g/L.</td></tr><tr><td>Montj&uuml; sole krzemowe, przygotowane w wodzie Milli-Q</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>różne</td><td>Przygotować w wodzie mili-Q o stężeniu 1,6 mM NaCl, 1,0 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM KCl, 1,2 mM NaHCO3 dostosować pH do 7,0 za pomocą HCl.</td></tr><tr><td>szalki Petriego, 100 mm x 20 mm, sterylny polistyren</td><td>Pipeta Simport</td><td>D210-7</td><td></td></tr><tr><td>, 20-200 &mu; Seria L</td><td></td><td>Zlewka Rainin</td> 17008652 <td></td></tr><tr><td>PYREX 150 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS1000150</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka, 0,22 mm</td> Filtr barwny <td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Roscolux:&nbsp; Golden Amber</td><td>Rosco</td><td>R21</td><td>Alternatywnie kup selektor kolorów Roscolux Designer (produkt Musson Theatrical #SBLUX0306), który zawiera wszystkie 3 filtry kolorów razem.</td></tr><tr><td>Filtr kolorów Roscolux:&nbsp; Średni czerwony</td> filtr barwny <td>Rosco</td><td>R27</td><td></td></tr><tr><td>Roscolux:&nbsp; Storaro Red</td><td>Rosco</td><td>R2001</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa Samco, 62 i mikro; L Stojak</td> pomocniczy <td>Thermo Fisher</td><td>691TS</td><td></td>o dużej aperturze</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Termometr Fisher Scientific</td><td>12-947-976</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89095-600</td><td></td></tr><tr><td>Wskaźnik laserowy UV</td><td>Amazon</td><td>B082DGS86R</td><td>Jest to laser klasy II (405nm &plusmn; 10nm) o mocy wyjściowej < 5 mW.</td></tr></tbody></table>

zgniatanie wypławków jako ilościowy odczyt behawioralny dla wyczuwania szkodliwych bodźców

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Słodkowodne wypławki zwykle płynnie ślizgają się przez napęd rzęskowy po swojej brzusznej stronie. Pewne warunki środowiskowe mogą jednak indukować formy lokomocji napędzane przez mięśnie: perystaltykę jelit lub zgniatanie. Podczas gdy perystaltyka wynika z ubytku rzęsek, zgniatanie jest niezależne od funkcji rzęsek i jest specyficzną reakcją na określone bodźce, w tym amputację, szkodliwą temperaturę, ekstremalne pH i etanol. Tak więc te dwa chody napędzane mięśniami są mechanicznie różne. Jednak mogą być trudne do odróżnienia jakościowo. Tutaj przedstawiamy protokół wywoływania zgniatania za pomocą różnych bodźców fizycznych i chemicznych. Szczegółowo opisujemy ilościową charakterystykę zgniatania, którą można wykorzystać do odróżnienia go od perystaltyki i ślizgu, korzystając z ogólnodostępnego oprogramowania. Ponieważ zgniatanie jest uniwersalnym chodem wypławkowym, choć z charakterystycznymi różnicami specyficznymi dla gatunku, protokół ten może być szeroko stosowany do wszystkich gatunków wypławków, przy zastosowaniu odpowiednich rozważań. Aby to zademonstrować, porównujemy reakcję dwóch najpopularniejszych gatunków wypławków wykorzystywanych w badaniach behawioralnych, Dugesia japonica i Schmidtea mediterranea, na ten sam zestaw bodźców fizycznych i chemicznych. Co więcej, specyfika zgniatania pozwala na stosowanie tego protokołu w połączeniu z interferencją RNA i/lub ekspozycją farmakologiczną w celu przeanalizowania zaangażowanych celów molekularnych i obwodów neuronalnych, potencjalnie zapewniając mechanistyczny wgląd w ważne aspekty nocycepcji i komunikacji nerwowo-mięśniowej.

Pozawzrokowa percepcja bliskiego zakresu UV u planariów S. mediterranea zależy od kanału TRPA1 i według hipotez jest powiązana z uwalnianiem H2O217. Ponieważ ekspozycja na H2O2 indukuje zależne od TRPA1 kurczenie się (tzw. scrunching) u planariów S. mediterranea oraz D. japonica28, kroki opisane w sekcji 2.1.4 mogą zostać wykorzystane do sprawdzenia, czy ekspozycja na światło bliskiego zakresu UV indukuj...

Wypławki słodkowodne wykazują trzy chody (ślizganie się, perystaltyka i zgniatanie), które można rozróżnić za pomocą ilościowej analizy behawioralnej. Opisujemy metodę wywoływania zgniecania za pomocą różnych szkodliwych bodźców, ich kwantyfikację oraz odróżnienie od perystaltyki i ślizgu. Korzystając z knockdownu genów, demonstrujemy specyfikę zgniatania jako ilościowego odczytu fenotypowego.

Zgniatanie wypławków jako ilościowy odczyt behawioralny dla wyczuwania szkodliwych bodźców

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Protokół ten pozwala naukowcom wyjaśnić zachowanie wypławków i mechanizmy sec leżące u podstaw tego zachowania poprzez połączenie ilościowej analizy behawioralnej z perturbacjami molekularnymi i chemicznymi. Technika ta jest łatwo dostępna dla wszystkich poziomów umiejętności, ponieważ nie wymaga zaawansowanych instrumentów ani specjalistycznego oprogramowania, aby uzyskać ilościowe odczyty behawioralne swobodnie poruszających się wypławków. Zgniatanie może być używane do badania wyjątków u wypławków i służy jako czuły punkt końcowy do testu, zakłócając funkcjonowanie układu nerwowego spowodowane przez ksenobiotyki i choroby.Zacznij od umieszczenia ściemnialnego panelu LED na płaskiej powierzchni, który zapewni jednolite białe tło i może być używany jako regulowane źródło światła w celu uzyskania odpowiedniego kontrastu. Umieść 100-milimetrową arenę szalki Petriego na panelu LED. Zamontuj kamerę na ringu, statywie nad areną i w razie potrzeby dostosuj jej położenie, wysokość i ostrość, tak aby cała arena była wyśrodkowana w polu widzenia i była ostra.Napełnij arenę około 25 mililitrami odpowiedniego nośnika ekspozycyjnego, aby uzyskać maksymalną głośność, włącz panel LED i wyłącz wszelkie inne źródła światła, które mogą negatywnie wpłynąć na jakość nagrywania. Upuść wypławka na środku areny za pomocą pipety transferowej. Podczas testowania roztworu chemicznego przenieś wypławkę z jak najmniejszą ilością wody wypławkowej, aby stężenie substancji chemicznej nie uległo znaczącej zmianie.Rozpocznij nagrywanie danych jako sekwencji obrazów w natywnym formacie Fidżi. W przypadku eksperymentów szybowniczych zapisz od jednej do dwóch minut zachowania ślizgowego, w przypadku eksperymentów z zgniataniem lub perystaltyką nagrań wystarczająco długo, aby uchwycić co najmniej trzy kolejne oscylacje występujące w linii prostej. Po zakończeniu eksperymentu zakończ nagrywanie.Jeśli wypławka dotrze do granicy areny, nie spełniając kryterium zakończenia, pipetuj wypławka z powrotem do środka areny. Otwórz sekwencję obrazów RAW do eksperymentu na Fidżi, przekonwertuj ją na ośmiobitową i użyj narzędzia strzałki lub suwaka u dołu stosu obrazów, aby przesunąć sekwencję obrazów. Aby wyodrębnić okres i region zainteresowania, narysuj obszar zainteresowania obejmujący pełną ścieżkę wypławka za pomocą narzędzia prostokąta.Kliknij prawym przyciskiem myszy stos obrazów i wybierz duplikat, zaznacz pole, w którym zduplikowany stos. Wprowadź pierwszą i ostatnią klatkę interesującej Cię sekwencji, a następnie kliknij przycisk OK. W przypadku eksperymentów szybowniczych wyodrębnij okres szybowania, w którym wypławka porusza się co najmniej dwukrotnie długością ciała w celu eksperymentów z zgniataniem lub perystaltyką.Wyodrębnij przypadek, w którym wypławka przechodzi co najmniej trzy następujące po sobie i pełne oscylacje ciała w linii prostej. Zastosuj próg do zduplikowanego stosu obrazów, aby zbinaryzować obraz i wyodrębnić wypławkę z tła, dostosuj przesuwane paski tak, aby cała płaśnik był podświetlony na czerwono. Dokładne wartości zależą od jakości obrazowania.Pozostaw pola na ciemne tło, histogram stosu i nie resetuj zakresu bez zaznaczenia. Przewiń stos obrazów, aby upewnić się, że zakres progowy jest dobry, a następnie kliknij przycisk Zastosuj. W oknie konwersji stosu na binarny ustaw metodę na domyślną, a tło na jasne.Odznacz wszystkie pola w tym oknie, a następnie kliknij OK. Pojawi się binaryzowany obraz przedstawiający czarnego wypławka na białym tle. Upewnij się, że cała płaszczyzna jest widoczna we wszystkich klatkach sekwencji obrazu.Ustaw pomiary, klikając Analizuj i Ustaw pomiary. Zaznacz pola powierzchni, środka masy, położenia stosu i dopasowania elipsy, a następnie kliknij przycisk OK. Wybierz otwarty stos obrazów, a następnie wybierz pozycję Analizuj i analizuj cząstki.W oknie analizy cząstek wybierz opcję pokaż i maski, aby otworzyć nowy stos pokazujący wszystkie obiekty, które zostały wykryte z wybranymi parametrami. Ustaw filtr rozmiaru, aby usunąć niechciany szum, wprowadzając przybliżony obszar wypławka. Następnie zaznacz pola wyświetl wyniki i wyczyść wyniki, a następnie kliknij OK.Przesuwaj stos obrazów maski za pomocą suwaka u dołu panelu, aby upewnić się, że nie ma szumów ani ramek bez wypławka. W oknie wyników zapisz dane za pomocą file i zapisz jako, dodaj rozszerzenie CSV do nazwy pliku, aby zapisać dane jako wartości oddzielone przecinkami. Po zapisaniu danych stosu obrazów zamknij odpowiednie okna stosu obrazów i maski.Aby wywołać zgniatanie za pomocą szkodliwej temperatury, podgrzej płaską wodę w szklanej zlewce do 65 stopni Celsjusza na gorącej płycie. Umieść wypławka na środku areny i poczekaj, aż ustawi się pionowo i zacznie szybować, a następnie rozpocznij nagrywanie. Użyj pipety P 200, aby powoli i konsekwentnie pipetować 100 mikrolitrów podgrzanej wody wypławkowej, po gardle na końcu wypławka, aby wywołać zgniatanie.Zatrzymaj nagrywanie, gdy ustanie zgniatanie. Umieść wypławka w pojemniku do odzysku i zamień pożywkę na szalce Petriego na świeżą wodę o temperaturze pokojowej, jeśli przeprowadzasz więcej eksperymentów. Aby wywołać zgniatanie poprzez amputację, przenieś wypławka na środek areny i poczekaj, aż wypławka ustawi się pionowo i zacznie ślizgać się.Następnie rozpocznij nagrywanie, amputuj wypławkę czystą żyletką. Upewnij się, że lokalizacja cięcia jest spójna we wszystkich eksperymentach. Przerwij nagrywanie, gdy przednia część przestanie się zgniatać.Usuń oba kawałki, umieść je w osobnym pojemniku i pozwól im się zregenerować przez siedem dni. Amputowane wypławki mogą być ponownie włączone do pojemnika domowego po regeneracji. Protokół ten został wykorzystany do sprawdzenia, czy ekspozycja na światło UV w pobliżu wywołuje zgniatanie u wypławków S. mediterranea i D.japonica, podczas gdy wypławki D. japonica zgniatają się, gdy są wystawione na działanie światła bliskiego UV, wypławki S. mediterranea wykazują ścieńczenie ogona lub brak reakcji.Kwantyfikacja parametrów zgniatania dla wypławków D.japonica, które wykazywały co najmniej trzy kolejne zgniecenia w linii prostej, ujawnia charakterystyczne parametry zgniatania dla tego gatunku W przeciwieństwie do ekspozycji na 250 mikromolowy aldehyd cynamonowy nieznany TRPA, jeden agonista u myszy, powoduje zgniatanie i S. mediterranea. Natomiast wypławki D. japonica wykazują mieszaninę wężowych i oscylacyjnych ruchów, przerywanych ślizganiem się lub energicznymi obrotami głowy. Kwantyfikacja próbek z co najmniej trzema kolejnymi oscylacjami dała znacznie niższe wartości dla trzech z czterech parametrów niż oczekiwano dla zgniatania u D. japonica, co wskazuje, że obserwowany ruch oscylacyjny nie jest zgniataniem.RNAi potwierdza specyfikę zgniatania i reakcję na ekspozycję na aldehyd cynamonowy w S. mediterranea. W ciągu 180 sekund od ekspozycji w wodzie wypławkowej wszystkie kontrolne RNAi wypławki zgniatały się. W porównaniu z żadnym z wypławków SMTRPA jeden RNAi wykazujący, że S.mediterranea zgniatająca się w aldehydzie cynamonowym wymaga SMTRPA.Istotne jest, aby być konsekwentnym i w jaki sposób manipuluje się zwierzętami, aby zredukować hałas i zapewnić powtarzalność pomiarów behawioralnych. Projekty te mogą zostać rozszerzone o analizę kształtu ciała, co pozwoliłoby na identyfikację i kwantyfikację innych zachowań wypławków, które nie zostały tutaj uchwycone.

planarian-scrunching-as-quantitative-behavioral-readout-for-noxious

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule opisano metodę elektrofizjologiczną służącą do izolowanej stymulacji chemicznej poszczególnych sensilli poprzez zewnątrzkomórkowe rejestracje końcówkowe w oleju mineralnym.

Elektrofizjologia sensilli typu peg u skorpionów

Ze względu na prostotę zabiegu chirurgicznego oraz wyraźne efekty behawioralne, przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego jest jednym z najważniejszych modeli zwierzęcych bólu neuropatycznego. W ciągu 24 h po operacji rozwija się nadwrażliwość bólowa, którą można zmierzyć ilościowo za pomocą estezjometru von Freya (test mechaniczny) oraz urządzenia do pomiaru analgesii podeszwowej (test termiczny).

Przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego i badanie nadwrażliwości bólowej u szczurów

W niniejszym artykule przedstawiamy testy służące do badania nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Jeden z testów polega na stymulacji ograniczonej przestrzennie (lokalnej) nocyceptorów termicznych1,2, natomiast drugi obejmuje całkowitą (globalną) aktywację większości lub wszystkich takich neuronów3. Wspólnie techniki te umożliwiają wizualizację i kwantyfikację funkcji behawioralnych neuronów sensorycznych nocyceptywnych Drosophila.

Lokalne i globalne metody oceny nocycepcji termicznej u larw Drosophila

Infekcja prostaty może być czynnikiem przyczyniającym się do pośredniczenia w bólu miednicy w przewlekłym zapaleniu gruczołu krokowego. Opisujemy procedurę przygotowania standaryzowanego inokulum bakteryjnego, wkraplania bakterii do cewki moczowej samców myszy oraz metodologii pomiaru allodynii dotykowej u myszy w czasie.

Pomiar dotykowej allodynii w mysim modelu bakteryjnego zapalenia gruczołu krokowego

Ten film demonstruje protokół przeprowadzania jednowłóknistych zapisów elektrofizjologicznych na preparacie in vitro mysiego nerwu jelita grubego.

Metody in vitro Charakterystyka funkcjonalna zakończeń aferentnych jelita grubego myszy

Tutaj demonstrujemy nowatorski test do badania zimnej nocycepcji u larw Drosophila. Test ten wykorzystuje specjalnie skonstruowaną sondę Peltiera, zdolną do zastosowania ogniskowego szkodliwego bodźca zimna i skutkuje wymiernymi zachowaniami specyficznymi dla zimna. Technika ta pozwoli na dalszą komórkową i molekularną sekcję zimnej nocycepcji.

Nowy test na zimną nocycepcję u larw Drosophila

Nowe narzędzia do badań mechanobiologii są potrzebne, aby zrozumieć, jak stres mechaniczny aktywuje szlaki biochemiczne i wywołuje reakcje biologiczne. W tym artykule prezentujemy nową metodę selektywnej stymulacji mechanicznej unieruchomionych zwierząt za pomocą pułapki mikroprzepływowej, umożliwiającej obrazowanie odpowiedzi komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak przeprowadzić ulepszony test mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila. Używamy tutaj testu, aby wykazać, że nadwrażliwość mechaniczna (allodynia i hiperalgezja) występuje u larw Drosophila.

Ulepszony test i narzędzia do pomiaru mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila

Częściowe podwiązanie nerwu kulszowego wywołuje długotrwały przewlekły ból neuropatyczny, charakteryzujący się przesadnymi reakcjami na bodźce termiczne i mechaniczne. Ten mysi model bólu neuropatycznego jest powszechnie stosowany do badania innowacyjnych terapii leczenia bólu. W tym artykule szczegółowo opisano procedurę chirurgiczną w celu poprawy standaryzacji i odtwarzalności.

Częściowe podwiązanie nerwu kulszowego: mysi model przewlekłego bólu neuropatycznego w celu zbadania antynocyceptywnego działania nowych terapii

Napady negatywnie wpływają na różne funkcje i jakość życia. Robaki Planaria były wystawione na działanie różnych stężeń chemoconvulsantów w celu oceny ich fenotypów napadowych i ruchliwości destrukcyjnej. W badaniu tym zaproponowano wykorzystanie robaków wypławkowych jako modelu ostrych napadów padaczkowych u ludzi i ma znaczenie w opracowywaniu leków na padaczkę.

Wypławka jako model zwierzęcy do eksperymentalnego ostrego napadu padaczkowego

Protokół ten przedstawia powtarzalny model szczura wykorzystujący nerwy czuciowe do naśladowania bólu neuromimy u człowieka oraz oceny zabiegów chirurgicznych, oferując cenne narzędzie do badań nad neuromią translacyjną.

Nowy chirurgiczny model gryzonia do badania opcji leczenia bólu nerwiaka z wykorzystaniem ukierunkowanej renerwacji mięśni przez nerw odpiszczelowy

Poznaj metodę ilościowej analizy zachowań wypławków słodkowodnych w odpowiedzi na szkodliwe bodźce. Technika ta umożliwia badanie funkcji układu nerwowego i ocenę wpływu ksenobiotyków na organizm.

Zgniatanie wypławków jako ilościowy odczyt behawioralny dla wyczuwania szkodliwych bodźców

Przeglądaj więcej filmów