Zgniatanie wypławków jako ilościowy odczyt behawioralny dla wyczuwania szkodliwych bodźców
30 lipca 2020
Wypławki słodkowodne wykazują trzy chody (ślizganie się, perystaltyka i zgniatanie), które można rozróżnić za pomocą ilościowej analizy behawioralnej. Opisujemy metodę wywoływania zgniecania za pomocą różnych szkodliwych bodźców, ich kwantyfikację oraz odróżnienie od perystaltyki i ślizgu. Korzystając z knockdownu genów, demonstrujemy specyfikę zgniatania jako ilościowego odczytu fenotypowego.
Protokół ten pozwala naukowcom wyjaśnić zachowanie wypławków i mechanizmy sec leżące u podstaw tego zachowania poprzez połączenie ilościowej analizy behawioralnej z perturbacjami molekularnymi i chemicznymi. Technika ta jest łatwo dostępna dla wszystkich poziomów umiejętności, ponieważ nie wymaga zaawansowanych instrumentów ani specjalistycznego oprogramowania, aby uzyskać ilościowe odczyty behawioralne swobodnie poruszających się wypławków. Zgniatanie może być używane do badania wyjątków u wypławków i służy jako czuły punkt końcowy do testu, zakłócając funkcjonowanie układu nerwowego spowodowane przez ksenobiotyki i choroby.
Zacznij od umieszczenia ściemnialnego panelu LED na płaskiej powierzchni, który zapewni jednolite białe tło i może być używany jako regulowane źródło światła w celu uzyskania odpowiedniego kontrastu. Umieść 100-milimetrową arenę szalki Petriego na panelu LED. Zamontuj kamerę na ringu, statywie nad areną i w razie potrzeby dostosuj jej położenie, wysokość i ostrość, tak aby cała arena była wyśrodkowana w polu widzenia i była ostra.
Napełnij arenę około 25 mililitrami odpowiedniego nośnika ekspozycyjnego, aby uzyskać maksymalną głośność, włącz panel LED i wyłącz wszelkie inne źródła światła, które mogą negatywnie wpłynąć na jakość nagrywania. Upuść wypławka na środku areny za pomocą pipety transferowej. Podczas testowania roztworu chemicznego przenieś wypławkę z jak najmniejszą ilością wody wypławkowej, aby stężenie substancji chemicznej nie uległo znaczącej zmianie.
Rozpocznij nagrywanie danych jako sekwencji obrazów w natywnym formacie Fidżi. W przypadku eksperymentów szybowniczych zapisz od jednej do dwóch minut zachowania ślizgowego, w przypadku eksperymentów z zgniataniem lub perystaltyką nagrań wystarczająco długo, aby uchwycić co najmniej trzy kolejne oscylacje występujące w linii prostej. Po zakończeniu eksperymentu zakończ nagrywanie.
Jeśli wypławka dotrze do granicy areny, nie spełniając kryterium zakończenia, pipetuj wypławka z powrotem do środka areny. Otwórz sekwencję obrazów RAW do eksperymentu na Fidżi, przekonwertuj ją na ośmiobitową i użyj narzędzia strzałki lub suwaka u dołu stosu obrazów, aby przesunąć sekwencję obrazów. Aby wyodrębnić okres i region zainteresowania, narysuj obszar zainteresowania obejmujący pełną ścieżkę wypławka za pomocą narzędzia prostokąta.
Kliknij prawym przyciskiem myszy stos obrazów i wybierz duplikat, zaznacz pole, w którym zduplikowany stos. Wprowadź pierwszą i ostatnią klatkę interesującej Cię sekwencji, a następnie kliknij przycisk OK. W przypadku eksperymentów szybowniczych wyodrębnij okres szybowania, w którym wypławka porusza się co najmniej dwukrotnie długością ciała w celu eksperymentów z zgniataniem lub perystaltyką.
Wyodrębnij przypadek, w którym wypławka przechodzi co najmniej trzy następujące po sobie i pełne oscylacje ciała w linii prostej. Zastosuj próg do zduplikowanego stosu obrazów, aby zbinaryzować obraz i wyodrębnić wypławkę z tła, dostosuj przesuwane paski tak, aby cała płaśnik był podświetlony na czerwono. Dokładne wartości zależą od jakości obrazowania.
Pozostaw pola na ciemne tło, histogram stosu i nie resetuj zakresu bez zaznaczenia. Przewiń stos obrazów, aby upewnić się, że zakres progowy jest dobry, a następnie kliknij przycisk Zastosuj. W oknie konwersji stosu na binarny ustaw metodę na domyślną, a tło na jasne.
Odznacz wszystkie pola w tym oknie, a następnie kliknij OK. Pojawi się binaryzowany obraz przedstawiający czarnego wypławka na białym tle. Upewnij się, że cała płaszczyzna jest widoczna we wszystkich klatkach sekwencji obrazu.
Ustaw pomiary, klikając Analizuj i Ustaw pomiary. Zaznacz pola powierzchni, środka masy, położenia stosu i dopasowania elipsy, a następnie kliknij przycisk OK. Wybierz otwarty stos obrazów, a następnie wybierz pozycję Analizuj i analizuj cząstki.
W oknie analizy cząstek wybierz opcję pokaż i maski, aby otworzyć nowy stos pokazujący wszystkie obiekty, które zostały wykryte z wybranymi parametrami. Ustaw filtr rozmiaru, aby usunąć niechciany szum, wprowadzając przybliżony obszar wypławka. Następnie zaznacz pola wyświetl wyniki i wyczyść wyniki, a następnie kliknij OK.
Przesuwaj stos obrazów maski za pomocą suwaka u dołu panelu, aby upewnić się, że nie ma szumów ani ramek bez wypławka. W oknie wyników zapisz dane za pomocą file i zapisz jako, dodaj rozszerzenie CSV do nazwy pliku, aby zapisać dane jako wartości oddzielone przecinkami. Po zapisaniu danych stosu obrazów zamknij odpowiednie okna stosu obrazów i maski.
Aby wywołać zgniatanie za pomocą szkodliwej temperatury, podgrzej płaską wodę w szklanej zlewce do 65 stopni Celsjusza na gorącej płycie. Umieść wypławka na środku areny i poczekaj, aż ustawi się pionowo i zacznie szybować, a następnie rozpocznij nagrywanie. Użyj pipety P 200, aby powoli i konsekwentnie pipetować 100 mikrolitrów podgrzanej wody wypławkowej, po gardle na końcu wypławka, aby wywołać zgniatanie.
Zatrzymaj nagrywanie, gdy ustanie zgniatanie. Umieść wypławka w pojemniku do odzysku i zamień pożywkę na szalce Petriego na świeżą wodę o temperaturze pokojowej, jeśli przeprowadzasz więcej eksperymentów. Aby wywołać zgniatanie poprzez amputację, przenieś wypławka na środek areny i poczekaj, aż wypławka ustawi się pionowo i zacznie ślizgać się.
Następnie rozpocznij nagrywanie, amputuj wypławkę czystą żyletką. Upewnij się, że lokalizacja cięcia jest spójna we wszystkich eksperymentach. Przerwij nagrywanie, gdy przednia część przestanie się zgniatać.
Usuń oba kawałki, umieść je w osobnym pojemniku i pozwól im się zregenerować przez siedem dni. Amputowane wypławki mogą być ponownie włączone do pojemnika domowego po regeneracji. Protokół ten został wykorzystany do sprawdzenia, czy ekspozycja na światło UV w pobliżu wywołuje zgniatanie u wypławków S. mediterranea i D.japonica, podczas gdy wypławki D. japonica zgniatają się, gdy są wystawione na działanie światła bliskiego UV, wypławki S. mediterranea wykazują ścieńczenie ogona lub brak reakcji.
Kwantyfikacja parametrów zgniatania dla wypławków D.japonica, które wykazywały co najmniej trzy kolejne zgniecenia w linii prostej, ujawnia charakterystyczne parametry zgniatania dla tego gatunku W przeciwieństwie do ekspozycji na 250 mikromolowy aldehyd cynamonowy nieznany TRPA, jeden agonista u myszy, powoduje zgniatanie i S. mediterranea. Natomiast wypławki D. japonica wykazują mieszaninę wężowych i oscylacyjnych ruchów, przerywanych ślizganiem się lub energicznymi obrotami głowy. Kwantyfikacja próbek z co najmniej trzema kolejnymi oscylacjami dała znacznie niższe wartości dla trzech z czterech parametrów niż oczekiwano dla zgniatania u D. japonica, co wskazuje, że obserwowany ruch oscylacyjny nie jest zgniataniem.
RNAi potwierdza specyfikę zgniatania i reakcję na ekspozycję na aldehyd cynamonowy w S. mediterranea. W ciągu 180 sekund od ekspozycji w wodzie wypławkowej wszystkie kontrolne RNAi wypławki zgniatały się. W porównaniu z żadnym z wypławków SMTRPA jeden RNAi wykazujący, że S.mediterranea zgniatająca się w aldehydzie cynamonowym wymaga SMTRPA.
Istotne jest, aby być konsekwentnym i w jaki sposób manipuluje się zwierzętami, aby zredukować hałas i zapewnić powtarzalność pomiarów behawioralnych. Projekty te mogą zostać rozszerzone o analizę kształtu ciała, co pozwoliłoby na identyfikację i kwantyfikację innych zachowań wypławków, które nie zostały tutaj uchwycone.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje odrębne sposoby poruszania się (ślizganie, perystaltyka i kurczenie się) planariów słodkowodnych z wykorzystaniem ilościowej analizy behawioralnej. Opracowany protokół umożliwia indukcję kurczenia się poprzez zastosowanie różnych bodźców drażniących, oferując metodę ilościowego określenia tego zachowania i odróżnienia go od innych sposobów poruszania się.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Analiza behawioralna planariów słodkowodnych
- Wpływ bodźców szkodliwych na ruch planariów
- Zastosowanie w badaniach nad funkcjonowaniem układu nerwowego
Wstęp
- Słodkowodne planarie wykazują trzy odrębne sposoby poruszania się
- Skracanie ciała (scrunching) może dostarczyć informacji o zaburzeniach układu nerwowego
- Łatwy w obsłudze układ eksperymentalny wymagający minimalnego zaawansowanego sprzętu
Zastosowane metody
- Indukcja kurczenia się (scrunching) za pomocą ciepła i zaburzeń fizycznych
- Ilościowe odczyty behawioralne z nagrań wideo
- Wykorzystanie oprogramowania statystycznego do analizy danych
Główne wyniki
- Charakterystyka kurczenia się (scrunching) jako unikalnej odpowiedzi behawioralnej
- Ilościowe odróżnienie kurczenia się od ślizgania i perystaltyki
- Walidacja kurczenia się jako odczytu fenotypowego dla efektów działania leków
Wnioski
- Wykazuje wrażliwość kurczenia się (scrunching) na zaburzenia neurologiczne
- Zapewnia badaczom metodę oceny wpływu substancji chemicznych na zachowanie planariów
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kurczenie się planarii stanowi mierzalny punkt końcowy zachowania, który pozwala na ocenę odpowiedzi neurotoksycznych i nocyceptywnych w genetycznie podatnym modelu. Podejście to umożliwia wczesne ograniczanie ryzyka mechanistycznego związków poprzez powiązanie fenotypów behawioralnych ze specyficznymi celami molekularnymi, takimi jak ortologi TRPA1. Metoda ta wspiera walidację celów oraz rozwój testów w procesach odkrywania leków w neurofarmakologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków nocyceptywnych i funkcji obwodów neuronalnych za pomocą specyficznych dla bodźca odczytów behawioralnych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez powiązanie reakcji kurczenia się z wyciszeniem genów lub perturbacją farmakologiczną.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnienie specyficznych efektów neurobehawioralnych od ogólnej toksyczności lokomotorycznej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, wysokorozdzielcze dane behawioralne odpowiednie do analizy zależności dawka-odpowiedź oraz analizy przebiegu czasowego.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje dostępny sprzęt obrazujący i oprogramowanie otwartoźródłowe, co umożliwia standaryzację pomiędzy laboratoriami.
- Gotowość testu: Dostarcza powtarzalne, porównywalne międzygatunkowo wyniki do przesiewowania bibliotek związków wpływających na funkcje nerwowo-mięśniowe lub sensoryczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie translacyjne: Oferuje istotny w kontekście chorobowym system do badania konserwatywnych mechanizmów nocycepcji w modelach bezkręgowców i kręgowców.
- Ciągłość przedkliniczna: Umożliwia screening fenotypowy, który łączy oddziaływanie na cel z funkcjonalnymi wynikami behawioralnymi.
- Ocena ryzyka: Pomaga w priorytetyzacji związków na podstawie profili bezpieczeństwa neurobehawioralnego przed badaniami na ssakach.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Protokół ten wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywczych, wspierając weryfikację hipotez w neurobiologii oraz umożliwiając identyfikację związków wiodących poprzez screening fenotypowy wpływu substancji na zachowanie planariów.
- Biologia odkryć: Wspiera badanie mechanizmów nocycepcji i sygnalizacji nerwowo-mięśniowej z wykorzystaniem mierzalnych wyników behawioralnych.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne testy behawioralne do oceny zmian w częstotliwości lub kinetyce kurczenia się (scrunching) indukowanych przez związki chemiczne.
- Analityka: Pozwala na wyodrębnienie parametrów (np. liczby oscylacji, amplitudy, czasu trwania) do porównań statystycznych między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy zależne od TRPA1 kurczenie się planarii ze ścieżkami nocycepcji u kręgowców, co wspiera walidację celów terapeutycznych międzygatunkowo.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Tworzy skalowalną platformę o niskich wymaganiach infrastrukturalnych, przeznaczoną do wielokrotnego użytku w wielu projektach i seriach związków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie powiązania celu z hipotezą poprzez specyficzne odpowiedzi behawioralne wywołane bodźcem.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki zestandaryzowanym procedurom indukcji, obrazowania i analizy.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez redukcję wyników fałszywie dodatnich w przesiewaniu związków neuroaktywnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia wczesną selekcję związków na podstawie ryzyka neurobehawioralnego, co obniża ryzyko niepowodzenia na późnych etapach badań.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli planariów, obserwacji behawioralnych oraz podstawowej analizy wideo.
- Zależność od standardowego wyposażenia laboratoryjnego: oświetlenia LED, szalek Petriego, kamer oraz oprogramowania open-source (np. Fiji).
- Konieczne jest przestrzeganie ustandaryzowanych protokołów dostarczania bodźców i rejestracji wideo przez wszystkie zespoły.
- Należy uwzględnić różnice gatunkowe w morfologii kurczenia się (scrunching) oraz progach reakcji.
- Metoda ogranicza się do wykrywania ogólnych fenotypów nerwowo-mięśniowych i nocyceptywnych; rozdzielczość subkomórkowa wymaga zastosowania metod komplementarnych.
