Name: Analiza hipermutacji somatycznej w intronie JH4 komórek B centrum rozrodczego z mysich plastrów Peyera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metodę analizy hipermutacji somatycznej w intronie JH4 komórek B centrum rozrodczego z mysich plastrów Peyera. Protokół łączy FACS, PCR i sekwencjonowanie Sanger do badania mechanizmów dywersyfikacji genów immunoglobulin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Tasuku Honjo za myszy AID-/-. Prace te były wspierane przez Narodowy Instytut Zdrowia Mniejszości i Dysproporcji Zdrowotnych (5G12MD007603), Narodowy Instytut Raka (2U54CA132378) oraz Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych (1SC1GM132035-01).

Wszystkie zmutowane myszy były utrzymywane na tle C57BL/6. We wszystkich eksperymentach wykorzystano dopasowane wiekowo (2-5 miesięcy) samce i samice myszy. Hodowla i eksperymenty na myszach były prowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez The City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Sekcja plam Peyera
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji 100% CO2 w dawce 3 l/min przez 5 minut, a następnie zwichnięcie szyjki macicy, aby potwierdzić śmierć. Sterylizuj narzędzia preparacyjne (nożyczki, kleszcze, kleszcze) i ręce w rękawiczkach 70% etanolem.</li>
	<li>Połóż mysz na podkładce sekcyjnej z odsłoniętym brzuchem. Obficie spryskaj ciało myszy 70% etanolem przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć w celu wysterylizowania obszaru sekcji.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w skórze w poprzek brzucha i usuń skórę z brzucha, ciągnąc jednocześnie po obu stronach nacięcia w kierunku głowy i ogona za pomocą kleszczy (lub wysterylizowanych rąk w rękawiczkach).</li>
	<li>Przypnij przednie i tylne kończyny myszy.</li>
	<li>Przetnij jamę otrzewnej nożyczkami, aby odsłonić narządy wewnętrzne.</li>
	<li>Zlokalizuj jelito cienkie między żołądkiem a jelitem ślepym (struktura w kształcie litery "J" w pobliżu okrężnicy). Usuń jelito cienkie, przecinając poniżej żołądka i powyżej kątnicy.</li>
	<li>Usuń tkankę łączną i tłuszcz łączący ze sobą fałdy jelita cienkiego. 
	UWAGA: Tłuszcz będzie miał charakterystyczny biały kolor, w przeciwieństwie do różowego koloru jelita cienkiego.</li>
	<li>Zbadaj zewnętrzną powierzchnię jelita cienkiego pod kątem plam Peyera (PP), które są małymi (~1 mm), owalnymi strukturami, które wydają się białe pod cienką warstwą półprzezroczystych komórek nabłonka.</li>
	<li>Ostrożnie wyciąć wszystkie widoczne PP nożyczkami. 
	UWAGA: Jedna mysz C57BL/6 typu dzikiego (WT) może dać 4-8 PP, podczas gdy mysz AID-/- będzie miała 6-10 PP.</li>
	<li>Zebrać PP do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml buforu FACS na lodzie. 
	UWAGA: PP powinien zatonąć, podczas gdy tłuszcz wypłynie na powierzchnię i będzie można go usunąć.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek dla FACS
<ol>
	<li>Umieścić filtr 40 μm w 6-dołkowym naczyniu z 1 ml zimnego (4 °C) buforu FACS.</li>
	<li>Wlej PP z probówki 1,5 ml na filtr.</li>
	<li>Przemyj PP 1 ml zimnego buforu FACS, upewniając się, że zawsze są w płynie i na lodzie.</li>
	<li>Użyj płaskiego końca tłoka ze strzykawki o pojemności 1 ml jako tłuczka, aby zmiażdżyć PP na filtrze, aż na filtrze pozostanie tylko tkanka łączna.</li>
	<li>Umyj filtr i tłok 1 ml zimnego buforu FACS, aby uwolnić komórki do naczynia 6-dołkowego.</li>
	<li>Zbierz ~ 4 ml komórek w zimnym buforze FACS i przefiltruj je przez probówkę FACS z filtrem siatkowym o średnicy 40 μm.</li>
	<li>Umyj nasadkę sitka 1 ml zimnego buforu FACS.</li>
	<li>Granulować komórki w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w wirówce z odchylanym wiadrem.</li>
	<li>Zdekantować supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 0,4 ml zimnego buforu FACS.</li>
	<li>Usuń 10 μL do liczenia komórek w celu sprawdzenia wydajności (spodziewaj się ~5 x 106 komórek/mysz, patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A)</li>
	<li>Przefiltruj pozostałe komórki przez nasadkę sitka 40 μm do probówki FACS i przystąp do barwienia pod kątem FACS.</li>
</ol>
3. Barwienie GCBC dla FACS
<ol>
	<li>Dodaj 1 μl bloku Fc (nieznakowany anty-mysz CD16/CD32) do 400 μl zawiesiny komórek i umieść komórki na lodzie na 15 minut.</li>
	<li>Dodaj 2 ml zimnego buforu FACS, aby umyć komórki.
	<ol>
		<li>Osadzać komórki w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 80 μl zimnego buforu FACS.</li>
	<li>Usunąć 10 μl komórek z WT PP dla każdej kontroli barwienia (w sumie 4, w tym 3 kontrolne pojedyncze barwienie i 1 kontrola niebarwiona). Pozostaw 40 μl WT PP na następny krok. Alternatywnie użyj koralików kompensacyjnych do kontroli barwienia.</li>
	<li>Każdą z próbek doświadczalnych (np. WT i AID-/-) zabarwić w 500 μl zimnego buforu FACS z 2,5 μl aglutyniny (PNA)-biotyny z orzeszków ziemnych przez 15 minut na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 2 ml zimnego buforu FACS, aby umyć komórki.
	<ol>
		<li>Osadzać komórki w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Każdą próbkę doświadczalną barwić 500 μl koktajlu w ciemności, na lodzie, przez 15 minut (tabela 1). Upewnij się, że komórki są całkowicie ponownie zawieszone w koktajlu barwiącym.</li>
	<li>Przygotuj kontrole pojedynczych plam dla matrycy kompensacji.
	<ol>
		<li>Wybarwić komórki w 500 μl zimnego buforu FACS, stosując rozcieńczenia określone w tabeli 2.</li>
		<li>Inkubować kontrole barwienia w ciemności, na lodzie, przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 2 ml zimnego buforu FACS do wszystkich probówek w krokach 3.7 i 3.8, zagnieździć komórki i wyrzucić supernatant w celu zmycia niezwiązanych przeciwciał lub DAPI.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl zimnego buforu FACS i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą sortera komórek zbierz B220 + PNAHI z każdej barwionej próbki eksperymentalnej. <silna klasa="xfig">Rysunek 3B pokazuje typowe procenty B220+ PNAHI uzyskane z WT i AID-/- PPs. <silna klasa="xfig">Rysunek 3C przedstawia strategię bramkowania FACS.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja DNA z GCBC
<ol>
	<li>Sortowane komórki osadzać w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml zimnego buforu FACS i przenieść komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
	<ol>
		<li>Osadzać komórki w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu do ekstrakcji DNA i 5 μl 20 mg/ml proteinazy K.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 56 °C przez noc.</li>
	<li>Wytrącić DNA za pomocą 500 μl izopropanolu i 1 μl 20 mg/ml glikogenu. Dokładnie wymieszaj probówkę, odwracając 5-6 razy.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Wirować w mikrowirówce przez 15 minut w temperaturze 25 °C i przy 21 000 x g.
	<ol>
		<li>Odrzucić supernatant i zachować osad, który zawiera wytrącone DNA i glikogen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj osad DNA 1 ml 70% etanolu.
	<ol>
		<li>Osadzać DNA w mikrowirówce przez 10 minut w temperaturze 25 °C przy 21 000 x g.</li>
		<li>Usuń 70% etanolu i wysusz na powietrzu osad DNA przez 5-10 min. 
		UWAGA: Unikaj nadmiernego wysuszenia, ponieważ DNA może nie nawodnić się całkowicie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić DNA w buforze TE o pojemności 30 μl i inkubować przez noc w temperaturze 56 °C.</li>
</ol>
5. Wzmocnienie i analiza sekwencji intronów JH4
<ol>
	<li>Określić ilościowo DNA, mierząc absorbancję przy długości fali 260 nm (A260). 
	UWAGA: Typowe stężenie DNA odzyskanego z posortowanych B220+PNAHI GCBC myszy C57BL/6 wynosi 20-40 ng/μL.</li>
	<li>Wykonać zagnieżdżony PCR dla intronu JH4 (Tabela 3, Tabela 4). Znormalizować całkowitą ilość genomowego DNA użytego w pierwszej reakcji PCR do próbki o najmniejszym stężeniu. (np. jeśli próbka o najmniejszym stężeniu wynosi 5 ng/μl, użyj 58,75 ng DNA dla wszystkich próbek w maksymalnej objętości wody (11,75 μl) w PCR #1).</li>
	<li>Rozpuścić produkt PCR na 1,5% żelu agarozowym pod napięciem 200 V przez 20 minut. Przewidywana wielkość amplikonu to 580 pz.</li>
	<li>Wyciąć amplikon z żelu i wyekstrahować DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta (patrz rysunek uzupełniający 1).
	<ol>
		<li>Eluować DNA za pomocą 30 μl wody i określić ilościowo ilość DNA, mierząc A260. 
		UWAGA: Typowe stężenie oczyszczonego produktu PCR wynosi 3-10 ng/μL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwiązać oczyszczony produkt PCR do plazmidu z końcami. Standaryzować całkowitą ilość produktu PCR użytego w każdej reakcji ligacji (Tabela 5).
	<ol>
		<li>Reakcję ligacji inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut lub przez noc w temperaturze 16 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć elektrokompetentne komórki bakteryjne za pomocą 2 μl reakcji ligacji.
	<ol>
		<li>Elektroporacja przy napięciu 1,65 kV.</li>
		<li>Ratunek w 600 μl pożywki SOC przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 225 obr./min.</li>
		<li>Umieścić 100 μl przekształconych bakterii na LB uzupełnionym ampicyliną (100 μg/ml) płytkach agarowych i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prześlij płytkę z koloniami bakteryjnymi do sekwencjonowania Sangera przy użyciu startera T7 do przodu. Alternatywnie, hoduj przez noc kultury każdej kolonii bakteryjnej i przeprowadź oczyszczanie plazmidu.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby powtórz PCR, ligację i/lub transformację, aby zoptymalizować wydajność kolonii bakteryjnych 
		UWAGA: Z każdej płytki należy wybrać co najmniej 30 kolonii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Standaryzacja danych sekwencji w plikach .txt
	<ol>
		<li>Usuń sekwencję plazmidu.</li>
		<li>Upewnij się, że każda sekwencja jest zorientowana od 5' do 3' zgodnie z sekwencją referencyjną intronu JH4 (NG_005838). W razie potrzeby wygeneruj odwrotne uzupełnienie dowolnej sekwencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dopasuj sekwencje uzyskane dla każdego PCR do sekwencji referencyjnej intronu JH4 (NG_005838) za pomocą oprogramowania Clustal Omega (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A).
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj różnice w stosunku do sekwencji referencyjnej jako mutacje</li>
		<li>Sprawdź, czy wszystkie mutacje są prawdziwymi mutacjami punktowymi, badając elektroferogram sekwencjonowania Sangera. W razie potrzeby powtórz sekwencjonowanie. (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B,C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tabelaryzuj i określ ilościowo unikalne mutacje w intronie JH4 dla każdego genotypu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5).
	<ol>
		<li>Policz sekwencje z identycznymi mutacjami tylko raz 
		UWAGA: Nie jest możliwe określenie, czy identyczne sekwencje zostały wygenerowane podczas PCR, czy identyczne zdarzenia SHM w różnych komórkach B.</li>
		<li>Policz każde wystąpienie sekwencji intronowych JH4 linii zarodkowej WT (tj. tych bez mutacji) jako unikalną sekwencję.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Scharakteryzowanie SHM w sekwencjach kodujących IgH i IgL V heterogenicznej populacji komórek B stanowi wyzwanie, biorąc pod uwagę, że każda komórka B w unikalny sposób reorganizuje segmenty kodujące V podczas rekombinacji V(D)J34. W artykule opisano metodę identyfikacji mutacji w intronie JH4 GCBC. Intron JH4, który znajduje się 3' ostatniego segmentu kodującego J w locus IgH, jest używany jako substytut SHM regionów V (Figura 1)31,33,34,35. Aby skatalogować te mutacje intronów JH4 i ocenić, jak określone geny wpływają na produkcję lub wzorzec mutacji, PP GCBC są specjalnie analizowane. Komórki te akumulują mutacje intronów JH4 w wyniku przewlekłej stymulacji przez mikrobiotę jelitową53. Co więcej, B220 + PNAHI GCBC z PP nieuodpornionych myszy mają widma mutacji, które porównuje się do GCBC śledziony od uodpornionych zwierząt54,55. Jednak mutacje w intronie JH4 nie mogą być skorelowane z dojrzewaniem powinowactwa do Ig, ponieważ mutacje te są niekodujące.
Aby ustalić, czy SHM zmienia powinowactwo do Ig, myszy powinny być immunizowane dootrzewnowo antygenem, takim jak NP (4-hydroksy-3-nitrofenyloacetyl) sprzężony z CGG (gamma globulina kurczaka) lub KLH (hemocyjanina przez dziurkę od klucza)56. Następnie mRNA można oczyścić ze śledziony B220 + PNA HI GCBC w celu zbadania SHM w VH 186.2, eksonie kodującym V, który najczęściej rozpoznaje NP i jest zmutowany po immunizacji NP-CGG lub NP-KLH 31,57,58,59,60. Mutacja tryptofanu-33 do leucyny w VH186.2 została scharakteryzowana w celu zwiększenia powinowactwa do Ig do 10-krotnego59,60 i dlatego jest jednym ze wskaźników, że SHM i selekcja klonalna wygenerowały wysokie powinowactwo Ig. Pomiar miana Ig swoistego dla NP7 i NP20 w surowicy za pomocą testu ELISA i obliczenie stosunku NP7/NP20 specyficznego dla Ig w trakcie immunizacji dokumentuje również dojrzewanie powinowactwa do Ig wynikające z SHM regionów V 17,21,36. Oba te testy można wykorzystać do skorelowania SHM w sekwencjach kodujących VH186.2 ze zmianami w dojrzewaniu powinowactwa Ig specyficznego dla NP.
Niezależnie od tego, czy do analizy SHM VH186.2 lub intronu JH4 wykorzystywane są zwierzęta uodpornione, czy nieuodpornione, GCBC muszą być dokładnie zidentyfikowane. Przedstawiamy podejście oparte na FACS do izolacji B220 + PNAHI GCBC. Alternatywnie, Fas i niesiarczanowy antygen α2-6-sialyl-LacNAc, który jest rozpoznawany przez przeciwciało GL7 61,62,63,64, mogą być również używane do izolacji GCBC, które są identyfikowane jako B220 + Fas + GL7 + 65 lub CD19 + Fas + GL7 + 37. Ekspresja GL7 ściśle odzwierciedla PNA w aktywowanych GCBC węzłów chłonnych 64,65,66. Oprócz stosowania markerów przeciwciał specyficznych dla GCBC, koktajle barwiące powinny maksymalizować wzbudzenie fluoroforu i wykrywanie biomarkera, jednocześnie minimalizując spektralne nakładanie się emisji fluorescencji. Antygeny ulegające ekspresji na niskich poziomach powinny być wykrywane za pomocą przeciwciała, które jest sprzężone z fluoroforem o silnej fluorescencji emisyjnej67. Zalecany protokół barwienia został zoptymalizowany pod kątem analizy na sortowniku komórek wyposażonym w cztery lasery (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) i 12 filtrów; Jednak konfiguracje filtrów i dostępność lasera różnią się w zależności od cytometru. W celu zmiany protokołu w zależności od dostępności odczynników i sprzętu, czytelnik jest odsyłany do dodatkowych zasobów, internetowych przeglądarek widma i opublikowanej literatury 67,68,69,70,71,72,73. Opisany w niniejszym dokumencie protokół barwienia wielobarwnego wymaga kompensacji nakładania się widma, aby zapewnić, że posortowane populacje komórek są GCBC, a nie niedokładnym wykrywaniem emisji fluorescencji. B220 służy jako użyteczna kontrola barwienia dla opisanego FACS (Tabela 1B), ponieważ PP będą miały charakterystyczne populacje ujemne i dodatnie B220 (Figura 3C), co pozwala na odpowiednią kompensację nakładania się widma. Strategię bramkowania przedstawioną na rysunku 3C należy stosować jako wskazówkę. Wykresy cytometrii przepływowej mogą się różnić w zależności od warunków barwienia i ustawień cytometru. Niemniej jednak 4-10% żywych komórek powinno być B220 + PNAHI 35, 52.
Wszystkie mutacje w obrębie intronu JH4 PP GCBC muszą zostać zwalidowane, aby upewnić się, że obserwowane mutacje naprawdę odzwierciedlają SHM, a nie artefakt PCR lub sekwencjonowania. Komórki AID -/- B mogą służyć jako użyteczna kontrola negatywna podczas badania fenotypu SHM w innych zmutowanych modelach myszy, ponieważ komórki te nie mogą ukończyć SHM17,19. Częstość mutacji intronów JH4 w AID-/- GCBC (mutacje 1,66x10-5/bp)20,21,36,37,38,50,74 jest porównywalna z częstością błędów polimerazy o wysokiej wierności (5,3x10-7 sub/zasada/podwojenie)51,52, która jest używana do amplifikacji DNA w zagnieżdżonym PCR. Jeśli myszy z AID-/- nie są dostępne, porównaj obserwowany wzorzec mutacji i częstość z opublikowaną literaturą. Regiony Ig V akumulują 10-3-10-4 mutacje na podział par zasad, co jest około 10 6-krotnie wyższe niż tempo mutacji innych loci genów 73,75. Wyniki mogą się różnić w zależności od wieku zwierzęcia76 lat. Alternatywnie, komórki B220 + PNALO, które oznaczają inne niż GCBC, mogą być używane jako kontrola negatywna pod nieobecność myszy AID / - 52. Jeśli częstość mutacji w WT GCBC jest niższa niż oczekiwano, sekwencja intronowa WT germinu JH4 może być nieproporcjonalnie reprezentowana. W takim przypadku należy upewnić się, że GCBC zostały odpowiednio wybarwione i posortowane, a PCR są wolne od zanieczyszczenia intronami linii zarodkowej WT JH4. Ponadto surowe dane sekwencjonowania w elektroferogramach powinny być dokładnie analizowane, aby upewnić się, że mutacje w danych tekstowych sekwencji nie są artefaktami błędów sekwencjonowania. Na przykład słabe wyniki sekwencjonowania Sangera mogą zmniejszyć wiarygodność danych sekwencji (rysunek 4). Ta kontrola jakości danych sekwencji Sangera zwiększy dokładność i odtwarzalność analizy mutacji intronów JH4.

B, członkowie adaptacyjnego układu odpornościowego, rozpoznają i eliminują antygeny poprzez wytwarzanie przeciwciał, znanych również jako immunoglobuliny (Ig). Każdy Ig składa się z dwóch ciężkich (IgH) i dwóch lekkich (IgL) polipeptydów łańcuchowych, które są utrzymywane razem przez wiązania dwusiarczkowe, tworząc charakterystyczną strukturę w kształcie litery "Y" klasy Ig1. N-końce IgH i IgL obejmują zmienny region (V) każdego polipeptydu i razem tworzą miejsce wiązania antygenu Ig, podczas gdy stały region IgH nadaje funkcję efektorową Ig. Rozwój limfocytów B w szpiku kostnym powoduje przegrupowanie eksonów kodujących V IgH i IgL w procesie znanym jako rekombinacja V(D)J2,3,4. Transkrypcja rekombinowanych eksonów V, w połączeniu z odpowiednimi eksonami o stałym regionie, tworzy mRNA, które ulega translacji do Ig.
Dojrzałe limfocyty B wyrażające Ig związane z błoną, znane również jako receptor komórek B (BCR), krążą do wtórnych narządów limfatycznych, takich jak śledziona, węzły chłonne lub plamy Peyera, gdzie badają środowisko w poszukiwaniu antygenów i wchodzą w interakcje z innymi komórkami układu odpornościowego1. W centrach rozrodczych (GC) wtórnych narządów limfatycznych aktywowane są limfocyty B, które rozpoznają antygen przez BCR. Wspomagane przez pęcherzykowe komórki dendrytyczne i pęcherzykowe limfocyty pomocnicze T, aktywowane limfocyty B mogą następnie namnażać się i różnicować w komórki plazmy i pamięci, które są ważnymi efektorami silnej odpowiedzi immunologicznej5,6,7,8,9. Dodatkowo te aktywowane limfocyty B mogą ulegać wtórnym procesom dywersyfikacji genu Ig - rekombinacji przełącznika klasy (CSR) i hipermutacji somatycznej (SHM). Podczas CSR limfocyty B wymieniają domyślny μ stały region polipeptydu IgH z innym stałym regionem (γ, α, ε) poprzez reakcję rekombinacji delecyjalno-rekombinacji DNA (<silna klasa = "xfig">Figura 1). Pozwala to na ekspresję innego stałego eksonu i translację nowego Ig. Limfocyt B przełączy się z ekspresji IgM na inny izotyp (IgG, IgA, IgE). CSR zmienia funkcję efektora Ig bez zmiany jego swoistości antygenowej10,11,12. Jednak podczas SHM komórki B mutują regiony kodujące V IgH i IgL, aby umożliwić produkcję i selekcję Igs o wyższym powinowactwie, co może skuteczniej wyeliminować antygen13,14,15 (Rysunek 1). Co ważne, zarówno CSR, jak i SHM zależą od funkcji jednego enzymu: indukowanej aktywacją deaminazy cytydynowej (AID)16,17,18. Ludzie i myszy z niedoborem AID nie mogą ukończyć CSR lub SHM i mają podwyższone miana IgM w surowicy lub Hyper-IgM17,19.
W CSR, AID deaminuje deoksycytydyny (C) w powtarzających się regionach przełączania, które poprzedzają każde stałe kodowanie eksonów, przekształcając je w deoksyurydyny (U)20,21, co tworzy niedopasowane parowanie zasad między deoksyurydynami i deoksyguanozynami (U:G). Te niedopasowania U:G są przekształcane w dwuniciowe pęknięcia DNA, które są wymagane do rekombinacji DNA, przez naprawę przez wycięcie zasady (BER) lub niedopasowanie ścieżka naprawy (MMR)22,23,24,25,26,27,28,29. W SHM AID deaminuje C w eksonach kodujących V. Replikacja w niedopasowaniu U:G generuje mutacje przejściowe C:G do T:A, podczas gdy usunięcie zasady uracylu przez białko BER, glikozylazę DNA uracylu (UNG), przed replikacją DNA powoduje zarówno mutacje przejściowe, jak i transwersyjne16. Mutacje zerowe w UNG znacząco zwiększają mutacje przejściowe C:G do T:A21,22. Podobnie jak w przypadku CSR, SHM wymaga komplementarnych ról MMR i BER. Podczas SHM MMR generuje mutacje w parach zasad A:T. Mutacje inaktywujące w homologii MutS 2 (MSH2) lub polimerazie DNA η (Polη) znacznie redukują mutacje na zasadach A:T, a mutacje złożone w MSH2 i Polη praktycznie znoszą mutacje w zasadach A:T21,30,31. Zgodnie z krytyczną rolą BER i MMR w przekształcaniu U generowanego przez AID w mutacje przejściowe lub transwersyjne, myszy z niedoborem zarówno MSH2, jak i UNG (MSH2-/-UNG-/-) wykazują tylko mutacje przejściowe C:G do T:A wynikające z replikacji w niedopasowaniu U:G21.
Analiza SHM w regionach kodujących V pozostaje skomplikowana, ponieważ rozwijające się komórki B mogą rekombinować dowolne egzony kodujące V(D)J w loci1,2,4. Dokładna analiza tych unikalnie rekombinowanych i somatycznie zmutowanych regionów V wymaga identyfikacji i izolacji klonów limfocytów B lub Ig mRNA11,13. Intron JH4, który jest 3' ostatniego eksonu kodującego J w locus IgH, jest siedliskiem mutacji somatycznych spowodowanych rozprzestrzenianiem się mutacji 3' promotora V<klasa sup="xref">32,33,34 i dlatego jest często używany jako marker zastępczy dla SHM w regionach V31,35 (Rysunek 1). Aby eksperymentalnie wyjaśnić, w jaki sposób określone geny lub mutacje genetyczne zmieniają wzorce lub tempo SHM, intron JH4 można zsekwencjonować z komórek B centrum rozrodczego (GCBC) z łatami Peyera (PP), które przechodzą wysokie wskaźniki SHM36,37,38. GCBC można łatwo zidentyfikować i wyizolować za pomocą fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym komórki (B220 + PNAHI) 17,39.
Przedstawiono szczegółowy protokół charakteryzujący mutacje intronów JH4 w PP GCBC od myszy przy użyciu kombinacji FACS (sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją), PCR i sekwencjonowania Sangera (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).

<table><tbody><tr><td>0,2 ml 8-tubowy pasek FLEX-FREE do PCR, dołączone przezroczyste płaskie nakrętki, mieszane</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4708</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Fisher</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>APC-eFluor780 anty-CD45R/B220</td><td>eBioscience</td><td>47-0452-80</td><td>klon RA3-6B2</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD</td><td>643186</td><td>cztery lasery (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) i 12 filtrów (PacBlue (450/50), AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40), PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60))Końcówka</td></tr> <tr><td>BD strzykawka 1mL</td><td>Fisher</td><td>14-823-434</td><td>sterylna</td></tr><tr><td>biotynylowana aglutynina z orzeszków ziemnych (PNA)</td><td>Myszy Vector Labs</td><td>B-1075-5</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Corning Falcon probówka z zatrzaskiem sitka do komórek</td><td>Fisher</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td><td>Fisher</td><td>D1306</td><td>0,5 mg / ml</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B kompetentne ogniwa</td><td>Fisher</td><td>18-290-015</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek Falcon 40mm</td><td>Fisher</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Rurki polistyrenowe okrągłodenne Falcon (rurki FACS)</td><td>Fisher</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Rurki z polistyrenu okrągłodennego Falcon (z nakrętką)</td><td>Fisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>R& D Systems (Atlanta Biologicals)</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Gibco PBS pH 7,4</td><td>Fisher</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Lasergene Biologia molekularna (MegAlign Pro)</td><td>DNA Star</td><td></td><td>wersja 15</td></tr><tr><td>PE anty-CD45R/B220</td><td>BD</td><td>553090</td><td>klon RA3-6B2</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Fisher</td><td>BP1700-100</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1,5 ml mikrowirówki</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna APC-eFluor 780 Koniugat</td><td>eBioscience</td><td>47-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M020L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania Thermo Scientific CloneJET PCR</td><td>ThermoFisher</td><td>FERK1231</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowej 6-dołkowa</td><td>Fisher</td><td>08-772-1B</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>Nieoznakowana anty-mysz CD16/CD32 (blok Fc), BD</td><td>Fisher</td><td>BDB553142</td><td>Clone 2.4G2</td></tr></tbody></table>

analiza hipermutacji somatycznej w intronie jh4 komórek b centrum rozrodczego z mysich plastrów peyera

Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches

W centrach rozrodczych narządów limfoidalnych, dojrzałe limfocyty B zmieniają swoją ekspresję immunoglobuliny (Ig) poprzez wprowadzanie nieszablonowych mutacji do zmiennych eksonów kodujących loci genów ciężkiego i lekkiego łańcucha Ig. Ten proces hipermutacji somatycznej (SHM) wymaga indukowanej aktywacją enzymu deaminazy cytydyny (AID), która przekształca deoksycytydyny (C) w deoksyurydyny (U). Przetwarzanie niedopasowań U:G generowanych przez AID w mutacje za pomocą szlaków wycinania zasady i naprawy niedopasowania wprowadza nowe sekwencje kodujące Ig, które mogą wytwarzać wyższe powinowactwo Ig. Mutacje w genach AID lub genach naprawy DNA mogą blokować lub znacząco zmieniać typy mutacji obserwowanych w loci Ig. Opisujemy protokół ilościowego oznaczania mutacji intronów JH4, który wykorzystuje sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), PCR i sekwencjonowanie Sangera. Chociaż test ten nie mierzy bezpośrednio dojrzewania powinowactwa Ig, wskazuje na mutacje w sekwencjach kodujących zmienne Ig. Ponadto metody te wykorzystują popularne techniki biologii molekularnej, które analizują mutacje w sekwencjach Ig wielu klonów komórek B. Tym samym test ten jest nieocenionym narzędziem w badaniu dywersyfikacji SHM i Ig.

Cytometria przepływowa 
Dojrzałe limfocyty B krążą do centrów rozmnażania, gdzie przechodzą dojrzewanie powinowactwa, ekspansję klonalną oraz różnicowanie w komórki plazmatyczne lub komórki pamięci40,41,42,43,44. Komórki B centrów rozmnażania (GCBC) można zidentyfikować za pomocą licznych markerów powierzchniowych, w tym wysokiej ekspresji receptora CD45R/B220 oraz wiązania aglutyniny z orzeszków ziemnych (PNA)45,46. W celu izolacji aktywowanych GCBC, komórki Peyerów (PP) barwiono przeciwciałami anty-B220 sprzężonymi z fykoerytryną (PE) oraz biotynilowaną PNA, a następnie streptawidyną sprzężoną z APC-eFluor780. Martwe komórki eliminowano za pomocą fluorescencyjnego barwnika 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI), który barwi kwasy nukleinowe umierających lub martwych komórek47,48. Obarwione komórki poddano następnie analizie i sortowaniu za pomocą cytometrii przepływowej. Płatki Peyerów składały się w ~80% z komórek B220+49,50. PP typu WT zawierają średnio 4 x 106 komórek na mysz (Rycyna 3A). Około 8% komórek PP typu WT było B220+PNAHI, co stanowi połowę liczby zaobserwowanych u myszy AID-/ - (Rycyna 3B). Zatem po sortowaniu uzyskano 0,3-0,6 x 106 komórek B220+PNAHI GCBC, co było wystarczające do analizy mutacji w intronie JH4.
Analiza sekwencji JH4 
Intron JH4 został amplifikowany za pomocą zagnieżdżonej reakcji PCR z użyciem wspólnych starterów rodziny VHJ558 (J558FR3Fw i VHJ558.2), a następnie starterów obejmujących intron JH4, VHJ558.3 i VHJ558.435,37. Spośród 105 unikalnych sekwencji uzyskanych z GCBC typu WT, zidentyfikowano łącznie 226 mutacji (Rycina 5A). Analiza spektrum mutacji GCBC u myszy WT wykazała szereg przejść i transwersji przy częstotliwości 4 x 10-3 mutacji/bp, obliczonej poprzez podzielenie całkowitej liczby zmutowanych zasad przez całkowitą liczbę zsekwencjonowanych zasad32,36,37,38. Dodatkowo, każdy produkt PCR JH4 z GCBC typu WT zawierał od 1 do 25 mutacji (Rycina 5B), przy czym w jednej sekwencji często stwierdzano wiele mutacji33,36. W 113 sekwencjach AID-/- zidentyfikowano tylko dwie mutacje (Rycina 5A). Limfocyty B AID-/- wykazywały częstotliwość 1,66 x 10-5 mutacji/bp, co było wartością znacznie niższą niż w przypadku limfocytów B typu WT (p &#60;0,05)36 i było porównywalne z częstością błędów polimerazy o wysokiej wierności (5,3 x 10-7 sub/base/doubling)51,52. Zatem limfocyty B AID-/- stanowiły użyteczną kontrolę negatywną w tym badaniu.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61551/61551fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Schemat locus genu IgH oraz regionów docelowych dla AID podczas CSR i SHM.&#160;Czerwony pasek oznacza intron JH4 o długości 580 bp, znajdujący się na 3’ końcu rearanżacji VDJH4, który jest analizowany w niniejszym protokole. W procesie CSR zależna od AID deaminacja intronowych regionów przełączeń (Sμ i Sε) sprzyja powstawaniu DSB, co umożliwia rekombinację delecyjną i ekspresję nowego izotypu przeciwciała (z IgM na IgE). Podczas SHM regiony V (szare pola) kumulują mutacje (niebieskie linie), co może prowadzić do powstania przeciwciał o wyższym powinowactwie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61551/61551fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61551/61551fig02.jpg" /> 
Rycina 2: Schemat analizy SHM intronu JH4 w GCBC wyizolowanych z PPs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61551/61551fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61551/61551fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Charakterystyka GCBC z PP.&#160;(A) Całkowita liczba komórek PP od myszy WT oraz AID-/- (n = 4 na genotyp). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe od średniej. (B) Procent GCBC B220+PNAHI uzyskanych z PP myszy WT oraz AID-/- (n = 4 na genotyp)36. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe od średniej, *p&#60;0.05 przy użyciu testu t Studenta. (C) Reprezentatywne wykresy FACS służące do sortowania GCBC B220+PNAHI z PP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61551/61551fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61551/61551fig04.jpg" /> 
Rycina 4: Analiza danych z sekwencjonowania metodą Sangera dla JH4.&#160;(A) Przykładowe dopasowania sekwencji z danych sekwencjonowania Sangera produktu PCR JH4 z GCBC typu WT (góra) i AID-/- (dół) do referencyjnej sekwencji genomowej (NG_005838), która znajduje się bezpośrednio pod ponumerowanymi znacznikami. Dopasowania zostały wygenerowane przy użyciu programu Clustal Omega. (B) Elektroferogram wysokiej jakości danych z sekwencjonowania Sangera, wykazujący wyraźne piki dla każdej zasady. (C) Elektroferogram niskiej jakości danych sekwencyjnych, wykazujący niejednoznaczne piki i nieokreślone zasady (N). Nukleotyd zaznaczony na czerwono musi zostać ręcznie adnotowany w pliku tekstowym sekwencji.&#160;&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61551/61551fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61551/61551fig05.jpg" /> 
Rycina 5: Analiza mutacji w intronie JH4 w GCBC typu WT i AID-/-.&#160;(A) W tabelach zestawiono całkowitą liczbę mutacji przejść (czerwone) i transwersji (niebieskie) w zasadach A, C, G i T dla każdego genotypu. Całkowita liczba analizowanych sekwencji jest wskazana poniżej tabeli. (B) Liczba mutacji na amplikon PCR dla każdego genotypu przedstawiona jest na wykresach kołowych. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Choi i wsp.36 Copyright 2020. The American Association of Immunologists, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61551/61551fig05large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Koktajl barwiący dla GCBCs</td>
			<td colspan="2">Objętość: 500 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeciwciało lub barwnik</td>
			<td>Fluorofor</td>
			<td>Rozcieńczenie</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>PE</td>
			<td>1000</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidina</td>
			<td>APC-eFluor780</td>
			<td>500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>N/D</td>
			<td>500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Koktajle barwiące dla GCBCs. Do barwienia komórek PP w 500 μL na potrzeby cytometrii przepłyewowej użyto koktajlu wskazanych przeciwciał lub barwnika (oznaczonego kursywą) w określonych rozcieńczeniach.
&#160; &#160;
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Barwienia pojedyncze do kompensacji</td>
			<td colspan="2">Tom: 500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeciwciało lub barwnik</td>
			<td>Fluorofor</td>
			<td>Rozcieńczanie</td>
			<td>&#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>PE</td>
			<td>1000</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>APC-eFluor780&#160;</td>
			<td>750</td>
			<td>0.67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
			<td>500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Kontrole pojedynczego barwienia do kompensacji. Przeciwciała B220 sprzężone z wskazanymi fluoroforami zostały użyte jako kontrole pojedynczego barwienia w celu kompensacji nakładania się widm.
&#160; &#160;
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="5">PCR #1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Odczynnik</td>
			<td >Objętość</td>
			<td colspan="3">Warunki termocyklera</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor 5x</td>
			<td >4 μL</td>
			<td >1</td>
			<td >95 °C</td>
			<td >3 min</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >10 mM dNTP</td>
			<td >2 μL</td>
			<td >2</td>
			<td >94 °C</td>
			<td >30 sec</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >10 μM J558FR3Fw</td>
			<td >1 μL</td>
			<td >3</td>
			<td >55 °C</td>
			<td >30 sec</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >10 μM VHJ558.2</td>
			<td >1 μL</td>
			<td >4</td>
			<td >72 °C</td>
			<td >1:30 min</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Polimeraza DNA o wysokiej wierności (High Fidelity)</td>
			<td >0,25 μL</td>
			<td colspan="3" rowspan="2">Cykle 2-4 9x</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >DNA</td>
			<td >x (standaryzować do próbki o najniższym stężeniu)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >H2O</td>
			<td >do 20 μL</td>
			<td >5</td>
			<td >72 °C</td>
			<td >5 min</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="5">Przed przejściem do PCR #2 rozcieńczyć produkt PCR w H2O w stosunku 1:5</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3: Zagnieżdżona PCR intronu JH4. Składniki PCR i warunki termocyklera dla pierwszej reakcji amplifikacji. Produkt pierwszej PCR należy rozcieńczyć wodą w stosunku 1:5 i wykorzystać 1 μL tego roztworu do drugiej reakcji PCR.
&#160; &#160;
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">PCR nr 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Objętość</td>
			<td colspan="3">Warunki termocyklera nr 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor 5x</td>
			<td>4 &#956;L</td>
			<td>1</td>
			<td>94 &#176;C</td>
			<td>3 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP</td>
			<td>2 &#956;L</td>
			<td>2</td>
			<td>94 &#176;C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;M VHJ558.3</td>
			<td>1 &#956;L</td>
			<td>3</td>
			<td>55 &#176;C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;M VHJ558.4</td>
			<td>1 &#956;L</td>
			<td>4</td>
			<td>72 &#176;C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td>
			<td>0.25 &#956;L</td>
			<td colspan="3" rowspan="2">Cykl 2-4 21x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczony PCR#1</td>
			<td>1 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. 20 &#956;L</td>
			<td>5</td>
			<td>72 &#176;C</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Składniki PCR i warunki termocyklera dla drugiej reakcji PCR.
&#160; &#160;
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Objętość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor 2x</td>
			<td>10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oczyszczony produkt PCR</td>
			<td>x (standaryzować do próbki o najniższym stężeniu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plazmid z tępymi końcami</td>
			<td>1 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligaza</td>
			<td>1 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>do 20 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min lub przez noc w temperaturze 16°C&#186;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Reakcja ligacji. Składniki do ligacji oczyszczonego produktu PCR intronu JH4 do plazmidu.
&#160; &#160;
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bufor do FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inaktywuj termicznie FBS w temperaturze 56°C &#730;C przez jedną godzinę przed użyciem. Do PBS o pH 7,4 (Gibco, #10010049) dodać 2,5% (v/v) inaktywowanego termicznie FBS. Przechowywać w temperaturze 4&#730;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do ekstrakcji DNA (100 mM Tris pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5% (w/v) SDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodać 50 ml 1 M Tris o pH 8,0, 100 ml 0,5 M EDTA oraz 12,5 ml 20% SDS. Dopełnić wodą destylowaną do objętości 500 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor TE (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodać 2,5 ml 1 M Tris pH 8,0 oraz 500 µl 0,5 M EDTA. Dopełnić wodą destylowaną do objętości 250 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 6: Składy buforów.
&#160; &#160;
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="3">Lista oligonukleotydów</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >J558FR3Fw</td>
			<td colspan="2">5’-GCCTGACATCTGAGGACTCTGC-3’</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >VHJ558.2</td>
			<td colspan="2">5’-CTGGACTTTCGGTTTGGTG-3’</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >VHJ558.3</td>
			<td colspan="2">5’-GGTCAAGGAACCTCAGTCA-3’</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >VHJ558.4</td>
			<td colspan="2">5’-TCTCTAGACAGCAACTAC-3’</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 7: Oligonukleotydy użyte w teście.
&#160; &#160;
Rycina uzupełniająca 1: Reprezentatywne zdjęcie żelu agarozowego po zakończeniu kroku 5.4. Produkt zagnieżdżonej reakcji PCR intronu JH4 rozdzielono na żelu agarozowym 1,5% i wycięto amplikon o wielkości 580 bp. WT PP oznacza, że jako matryca dla pierwszej reakcji PCR wykorzystano genomiczne DNA WT PP GCBC, a AID PP oznacza, że jako matryca dla pierwszej reakcji PCR wykorzystano genomiczne DNA AID-/- PP GCBC. ɸ oznacza kontrolę PCR bez matrycy, a znak - oznacza, że do dołka żelu agarozowego nic nie nałożono. Ostatnia ścieżka przedstawia drabinkę DNA 100 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61551/61551supfig01.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>

Prezentowany tutaj jest test do ilościowego określenia hipermutacji somatycznej w locus genu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny przy użyciu komórek B centrum zarodkowego z mysich plastrów Peyera.

Analiza hipermutacji somatycznej w intronie JH4 komórek B centrum rozrodczego z mysich plastrów Peyera

Within the germinal centers of lymphoid organs, mature B cells alter their expressed immunoglobulin (Ig) by introducing untemplated mutations into the ...

Protokół ten pozwala użytkownikom badać, w jaki sposób układ odpornościowy wytwarza przeciwciała przeciwko patogenom lub drobnoustrojom komensalnym. Ponadto szlaki molekularne, które regulują dywersyfikację genów immunoglobulin, można badać przy użyciu genetycznie modyfikowanych myszy. Protokół wykorzystuje kombinację popularnych technik biologii molekularnej, w tym PCR i sekwencjonowania Sangera, i nie wymaga sortowania pojedynczych komórek ani głębokiego sekwencjonowania.Plastry Peyera można łatwo pomylić z otaczającą je tkanką tłuszczową. Tak więc wizualna demonstracja tej metody może być pomocna dla tych, którzy nie są zaznajomieni z tym narządem, w zidentyfikowaniu jego lokalizacji i obserwacji jego sekcji. Zacznij od ułożenia myszy na podkładce sekcyjnej z odsłoniętym brzuchem.Obficie spryskaj ciało myszy 70% etanolem przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć w celu wysterylizowania obszaru sekcji. Wykonaj nacięcie w skórze w poprzek brzucha i pociągnij jednocześnie po obu stronach nacięcia palcami lub kleszczami. Następnie przetnij jamę otrzewnej nożyczkami, aby odsłonić narządy wewnętrzne.Zlokalizuj jelito cienkie i usuń je, przecinając poniżej żołądka i powyżej jelita ślepego. Usuń tkankę łączną i tłuszcz łączący ze sobą fałdy jelita cienkiego. Zbadaj zewnętrzną powierzchnię jelita cienkiego pod kątem łat Peyera, które są małymi owalnymi strukturami, które wydają się białe pod cienką warstwą półprzezroczystych komórek nabłonka.Ostrożnie wytnij nożyczkami wszystkie widoczne plastry Peyera i zbierz je do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr buforu FACS na lodzie. Jeśli pobrana tkanka opada na dno tubki, w rzeczywistości jest to plaster Peyera, a nie tkanka tłuszczowa. Umieść filtr o średnicy 40 mikrometrów w naczyniu z sześcioma dołkami z jednym mililitrem zimnego buforu FACS, a następnie wlej plastry Peyera z rurki 1.5 mililitra na filtr.Użyj płaskiego końca tłoka z jednomililitrowej strzykawki jako tłuczka, aby zmiażdżyć plastry Peyera na filtrze, aż pozostanie tylko tkanka łączna. Umyj filtr i tłok jednym mililitrem zimnego buforu FACS, aby uwolnić komórki do naczynia z sześcioma dołkami. Zbierz komórki i przefiltruj je przez rurkę FACS z 40-mikrometrową nasadką sitkową.Następnie umyj nakrętkę sitka jednym mililitrem zimnego buforu FACS. Granuluj komórki, odwirowując je w temperaturze 600 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 0,4 mililitra zimnego buforu FACS z blokiem FC.Inkubować próbki na lodzie przez 15 minut, a następnie umyć i granulować komórki. Aby wybarwić komórki B centrum germinalnego lub GCBC, ponownie zawieś komórki typu dzikiego w 80 mikrolitrach buforu FACS. Usuń 10 mikrolitrów komórek z plastrów Peyera typu dzikiego dla każdej kontroli barwienia.Pozostawienie 40 mikrolitrów zawiesiny komórek do próbek eksperymentalnych. Alternatywnie użyj koralików kompensacyjnych do kontroli barwienia. Zabarwić każdą z próbek eksperymentalnych w 500 mikrolitrach zimnego buforu FACS z 2,5 mikrolitrami biotyny PNA przez 15 minut na lodzie.Następnie umyj komórki barwiące PNA. Wybarwić każdą próbkę 500 mikrolitrami koktajlu GCBC w ciemności i na lodzie przez 15 minut, upewniając się, że komórki są całkowicie ponownie zawieszone w koktajlu. Aby przygotować kontrole pojedynczego barwienia dla matrycy kompensacyjnej, należy wybarwić komórki w 500 mikrolitrach zimnego buforu FACS przy użyciu rozcieńczenia określonego w tekście.Inkubować kontrole barwienia w ciemności na lodzie przez 15 minut. Dodaj dwa mililitry zimnego buforu FACS, aby zmyć wszystkie próbki plam i kontrole. Osadzać komórki i wyrzucać supernatant przed ponownym zawieszeniem komórek w końcowej objętości 500 mikrolitrów zimnego buforu FACS do uruchomienia na cytometrze.Następnie użyj sortera komórek, aby zebrać komórki o wysokiej zawartości PNA B220 z każdej barwionej próbki eksperymentalnej. Aby wyekstrahować DNA z komórek B centrum rozrodczego lub GCBC, ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach buforu do ekstrakcji DNA i pięciu mikrolitrach proteinazy K. Następnie wytnij DNA za pomocą 500 mikrolitrów izopropanolu i jednego mikrolitra glikogenu. I dokładnie wymieszaj probówkę, odwracając ją pięć lub sześć razy.Po inkubacji próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej odwirować ją przez 15 minut w temperaturze 21 000 G i 25 stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i przemyć osad DNA jednym mililitrem 70% etanolu. Odwiruj DNA w temperaturze 21 000 g przez 10 minut, a następnie usuń etanol i wysusz osad na powietrzu przez pięć do 10 minut.Ponownie zawiesić DNA w 30 mikrolitrach buforu TE i inkubować go przez noc w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Wykonaj zagnieżdżony PCR dla JH4 Intron. Normalizacja całkowitej ilości genomowego DNA użytego w pierwszej reakcji PCR do próbki o najmniejszym stężeniu.Po umieszczeniu produktów PCR na żelu, należy wyciąć amplikon i oczyścić go za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Następnie przeprowadź proces amplikonu w plazmid i przekształć elektrokompetentne komórki bakteryjne za pomocą dwóch mikrolitrów reakcji ligacji. Elektroporuj ogniwa pod napięciem 1,65 kilowolta i uratuj je w 600 mikrolitrach pożywki SOC przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem przy 225 obr./min.Umieść 100 mikrolitrów przekształconych bakterii na płytkach agarowych LB uzupełnionych ampicyliną i inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Sekwencjonuj DNA osocza z kolonii bakteryjnych i dopasuj sekwencje uzyskane dla każdego PCR do sekwencji referencyjnej intronu JH4 za pomocą oprogramowania Clustal Omega. Zidentyfikuj różnice w sekwencji referencyjnej jako mutacje.Komórki B centrum zarodkowego zidentyfikowano poprzez pomiar ekspresji receptora B220 i wiązanie aglutyniny orzeszków ziemnych. Łatki Peyera typu dzikiego zawierały średnio 4 miliony komórek na mysz. Około 8% komórek miało wysoki poziom PNA B220, co stanowi połowę tego, co obserwowano u myszy z nokautem AID.Spośród 105 unikalnych sekwencji uzyskanych z komórek B centrum germinalnego typu dzikiego znaleziono łącznie 226 mutacji. Analiza spektrum mutacji wykazała szereg przejść i wersji trans w tempie czterokrotnym 10 do ujemnych trzecich mutacji na parę zasad. Tylko dwie mutacje zostały zidentyfikowane w 113 sekwencjach nokautujących AID.Ponadto każdy produkt JH4 PCR z komórek B centrum germinalnego typu dzikiego zawierał od jednej do 25 mutacji z wieloma mutacjami często występującymi w jednej sekwencji. Próbując tego protokołu, pamiętaj, aby trzymać komórki na lodzie, aby zachować ich żywotność. Po zabarwieniu komórek utrzymuj je w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu fluoroforów.Aby skorelować hipermutację somatyczną z dojrzewaniem powinowactwa przeciwciał, zalecamy stosowanie protokołu immunizacji i oznaczania mian przeciwciał specyficznych dla antygenu i mutacji regionu V.

analysis-somatic-hypermutation-jh4-intron-germinal-center-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Po ekspozycji na antygen subpopulacje aktywowanych limfocytów B przechodzą proces znany jako rekombinacja przełączająca klasę (CSR), aby wytworzyć izotypy przeciwciał o odrębnych funkcjach efektorowych. Protokół opisany w niniejszym raporcie wyjaśnia, w jaki sposób CSR można indukować i analizować in vitro w celu badania funkcji limfocytów B.

Indukcja i ocena rekombinacji przełączającej klasy w oczyszczonych komórkach B myszy

Opisujemy sposób przeprowadzania infekcji retrowirusowych lub lentiwirusowych konstruktami do nadekspresji lub zawierającymi shRNA w ludzkiej linii komórek B Ramos oraz metodę pomiaru hipermutacji somatycznej w tych komórkach.

Ocena hipermutacji somatycznej w limfocytach B linii Ramos po nadekspresji lub wyciszeniu specyficznych genów

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem funkcji immunologicznych określonych subpopulacji komórek w łatach Peyera (PP), głównych miejscach indukcyjnych tkanek limfatycznych związanych z jelitami.  W tym miejscu przedstawiamy równoległe protokoły przygotowania preparatów pojedynczych komórek PP do analizy cytometrii przepływowej i kriosekcji PP do barwienia immunologicznego.

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Szlaki naprawy DNA są niezbędne do utrzymania integralności genomu oraz zapobiegania mutacjom i nowotworom. Celem tego protokołu jest ilościowe określenie niestabilności genomu poprzez bezpośrednią obserwację aberracji chromosomowych w rozprzestrzenianiu się metafazy z mysich komórek B przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) dla powtórzeń telomerowego DNA.

Szybka analiza aberracji chromosomowych w mysich limfocytach B przez PNA-FISH

Ten protokół opisuje podejście do badania rekombinowanych regionów VDJ łańcucha ciężkiego immunoglobuliny chłoniaków poprzez głębokie sekwencjonowanie i odzyskanie rearanżacji VDJ i statusu hipermutacji somatycznej w celu nakreślenia klonalnej architektury pojedynczego guza. Porównanie architektury klonalnej między sparowaną diagnozą a próbkami nawrotu chłoniaka ujawnia tryby ewolucji klonalnej nawrotu chłoniaka.

VDJ-Seq: Analiza głębokiego sekwencjonowania przegrupowanego genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w celu ujawnienia wzorców ewolucji klonalnej chłoniaka z komórek B

W tym artykule opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi immunoglobuliny (Ig) zależnej od T i niezależnej od T u myszy za pomocą testu ELISA. Ta metoda stosowana samodzielnie lub w połączeniu z cytometrią przepływową pozwoli naukowcom zidentyfikować różnice w odpowiedziach izotypu Ig za pośrednictwem komórek B u myszy po immunizacji antygenu T zależnej i niezależnej od T.

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

W tym badaniu prezentujemy nowatorski i skuteczny protokół izolacji limfocytów z plastrów Peyera (PPs), który może być następnie wykorzystany do testów funkcjonalnych in vivo i in vitro, a także do badań cytometrycznych komórek T pomocniczych pęcherzyków i komórek B centrum rozrodczego.

Odkrywanie kluczowych graczy odporności humoralnej: zaawansowany i zoptymalizowany protokół izolacji limfocytów z plastrów mysich Peyera

Ten protokół opisuje generowanie mieszanych chimer mysiego szpiku kostnego ze spontanicznymi autoimmunologicznymi centrami zarodkowymi, w których autoreaktywne limfocyty zawierają fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (PA-GFP). Daje to możliwość powiązania lokalizacji komórkowej w tkankach z dalszymi analizami molekularnymi i funkcjonalnymi.

Badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Tutaj opisujemy dokładną metodę pobierania limfocytów przewodu piersiowego i obserwacji migracji limfocytów tropikalnych jelitowych w plamach Peyera szczura przez 3 godziny za pomocą fotografii poklatkowej. Ta technika może wyjaśnić, w jaki sposób dynamika limfocytów wpływa na stan zapalny.

Obserwacja mikroskopowa dynamiki limfocytów w szczurzych łatach Peyera

Poznaj metodę analizy hipermutacji somatycznej w intronie JH4 komórek B centrum rozrodczego z mysich plastrów Peyera. Protokół łączy FACS, PCR i sekwencjonowanie Sanger do badania mechanizmów dywersyfikacji genów immunoglobulin.

Analiza hipermutacji somatycznej w intronie JH4 komórek B centrum rozrodczego z mysich plastrów Peyera

Przeglądaj więcej filmów