Name: Izolacja mysich limfocytów T CD8 + rezydujących w nerkach do analizy cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Poznaj metodę izolacji limfocytów T CD8+ rezydujących w nerkach myszy do analizy cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badanie biologii komórek T w tkankach pozaśluzowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty NIH AI125701 i AI139721, program CLIP Instytutu Badań nad Rakiem oraz grant American Cancer Society RSG-18-222-01-LIB dla N.Z. Dziękujemy Karli Gorenie i Sebastianowi Montagnino z Zakładu Cytometrii Przepływowej. Dane wygenerowane w Flow Cytometry Shared Resource Facility były wspierane przez University of Texas Health Science Center w San Antonio (UTHSCSA), grant NIH/NCI P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] w UTHSCSA) oraz UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone zgodnie z tym protokołem muszą zostać zatwierdzone przez odpowiedni instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez IACUC UT Health San Antonio.
1. Adoptywny transfer limfocytów T P14 do biorców C57BL/6 i zakażenie LCMV
<ol>
	<li>Użyj myszy P14 w wieku 6-12 tygodni. Upewnij się, że płeć transgenicznej myszy dawcy P14 TCR powinna być zgodna z płcią myszy biorcy C57BL / 6. W przeciwnym razie komórki, takie jak męskie limfocyty T, przenoszące się do samic myszy, spowodują odrzucenie krążących limfocytów T dawcy za pośrednictwem układu immunologicznego w ciągu około 12 dni14.</li>
	<li>Oczyść naiwne limfocyty T CD8 + ze śledziony i węzłów chłonnych transgenicznej myszy P14 TCR za pomocą zestawu do oczyszczania mysich limfocytów T CD8 + zgodnie z protokołem producenta.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, wypreparuj śledzionę i węzły chłonne, zetrzyj próbki, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczych komórek.</li>
		<li>Aby wzbogacić się o naiwne limfocyty T, dodaj przeciwciało anty-CD44 biotyny podczas pierwszego etapu inkubacji przeciwciał13. 
		UWAGA: Zestaw komercyjny do selekcji negatywnej używany na tym etapie zawiera dwa główne składniki do dwóch etapów inkubacji (tj. inkubacji mieszaniny biotyny i przeciwciał oraz inkubacji streptawidyny i kulek magnetycznych).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki i wstrzyknąć od 1 000 do 10 000 oczyszczonych limfocytów T P14 w 200 μl PBS każdemu biorcy C57BL/6 dopasowanemu płciowo przez żyłę ogonową><.
	UWAGA: Szczegółowy protokół iniekcji żyły ogonowej jest opisany w kroku 2.</li>
	<li>Następnego dnia wszyscy biorcy C57BL/6 otrzymują 2 x 105 pfu LCMV Armstrong rozcieńczony w 200 μl PBS drogą dootrzewnową.</li>
</ol>
2. Wewnątrznaczyniowe znakowanie limfocytów T CD8+
UWAGA: W zależności od zainteresowań badawczych, po zakażeniu można wybrać różne punkty czasowe. Przedstawiono przykład 30 dnia po zakażeniu (dzień 30 po kroku 1.4), który jest często uważany za wczesny punkt czasowy pamięci dla odpowiedzi limfocytów T CD8.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało anty-CD8α biotyny do 15 μg/ml w PBS. Upewnij się, że każda mysz otrzymuje 200 μl PBS zawierającego 3 μg przeciwciała. 
	UWAGA: Zastosowano tutaj przeciwciało anty-CD8 z biotyną, dzięki czemu bardziej elastyczne będzie zaprojektowanie końcowego panelu barwiącego FACS. Przeciwciało znakowane barwnikiem fluorescencyjnym może być stosowane bezpośrednio. Jednak ważne jest, aby używać różnych klonów przeciwciał monoklonalnych do znakowania dożylnego w porównaniu z barwieniem FACS.</li>
	<li>Prawidłowo podgrzej żyłę ogonową myszy za pomocą górnej lampy grzewczej przez 5-10 minut, aby rozszerzyć żyły. 
	UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec przegrzaniu zwierząt. Zmniejsz ogień lub wyjmij lampę grzewczą, jeśli myszy przestały się poruszać.</li>
	<li>Pobrać 200 μl wstępnie rozcieńczonej mieszanki przeciwciał anty-CD8α do strzykawki insulinowej 100 U (28G) i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, przesuwając tłok w górę iw dół. Zegnij igłę, aby utworzyć kąt 150° między igłą a strzykawką, skośnie do góry, tak aby igła była równoległa do żyły.</li>
	<li>Unieruchomić mysz za pomocą urządzenia do ograniczania gryzoni o odpowiedniej wielkości i spryskać ogon 70% etanolem, aby żyła była wyraźnie widoczna. 
	UWAGA: Czas trwania unieruchomienia powinien być ograniczony do minimum.</li>
	<li>Przytrzymaj ogon na dystalnym końcu kciukiem i środkowymi palcami ręki niedominującej. Umieść palec wskazujący pod miejscem, w które zostanie wkłuta igła.</li>
	<li>Trzymać strzykawkę ręką dominującą i wprowadzać igłę do żyły równolegle w kierunku serca. 
	UWAGA: Przy prawidłowym umieszczeniu igła powinna płynnie wchodzić do żyły.</li>
	<li>Powoli wstrzyknąć 200 μl przeciwciała anty-CD8α przez żyłę ogonową. 
	UWAGA: Jeśli występuje opór lub nad igłą na ogonie widoczny jest biały obszar, oznacza to, że igła nie znajduje się wewnątrz żyły. Pierwsze wstrzyknięcie należy rozpocząć w pobliżu końca ogona. Jeśli to konieczne, przesunąć się do przodu w kierunku dolnej części ogona w celu wykonania kolejnych wstrzyknięć.</li>
	<li>Wyjąć igłę i delikatnie uciskać, aż krwawienie ustanie.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce i poddaj ją eutanazji po 3-5 minutach. 
	UWAGA: Myszy powinny zostać poddane eutanazji przez komorę izofluranową, a następnie zwichnąć szyjkę macicy. Inne metody, takie jak wdychanieCO2 trwają do 5 minut i mogą wprowadzać niepotrzebne zmiany czasu znakowania przeciwciał dożylnie.</li>
	<li>Wyciąć nerkę za pomocą nożyczek, przenieść całą nerkę do 1,5 ml probówek do mikrowirówek i pozostawić próbki na lodzie do dalszej obróbki. 
	UWAGA: Nienaruszoną całą nerkę można bezpiecznie przechowywać na lodzie przez kilka godzin przed późniejszym przetwarzaniem i trawieniem.</li>
</ol>
3. Trawienie enzymatyczne nerek
<ol>
	<li>Przygotować 6 dołków zawierających 3 ml roztworu wytrawiającego (RPMI/2% FCS/1 mg/ml kolagenazy B) dla każdej myszy, przechowywać na lodzie. 
	UWAGA: Podstawowy roztwór kolagenazy B o wyższym stężeniu (np. 20x) można przygotować i przechowywać w temperaturze -20°C lub niższej. Roztwór roboczy należy przygotować na świeżo. Proszę zapoznać się z Tabelą 1, aby zapoznać się z recepturami dla wszystkich roztworów/stosowanych w obecnym protokole.</li>
	<li>Dodać 300 μl roztworu wytrawiającego do probówek z mikrowirówką o pojemności 1,5 ml i zmielić próbki nerek prostymi nożycami sprężynowymi. 
	UWAGA: Tkankę nerkową należy rozdrobnić na równe kawałki o rozmiarach nie większych niż 1,5 mm średnicy. Nie jest wymagany żaden etap dekapsulacji.</li>
	<li>Przenieść zmielone próbki nerek na 6-dołkowe płytki zawierające roztwór wytrawiający 
	UWAGA: Płytki 6-dołkowe są używane dla wygody tylko wtedy, gdy do przetworzenia jest wiele próbek.</li>
	<li>Inkubować próbki w temperaturze 37 °C, delikatnie kołysząc (około 60 obr./min) przez 45 minut.</li>
	<li>Po strawieniu rozgnieć tkankę za pomocą kołnierza tłoka strzykawki o pojemności 3 ml bezpośrednio wewnątrz naczynia i przenieś do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Zwykle filtracja przez sitko komórkowe nie jest wymagana na tym etapie, ponieważ wirowanie w gradionym gradiencie gęstości jest wykonywane obok oczyszczenia żywych limfocytów.</li>
	<li>Odwirowywać próbki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w 3 ml RPMI/10% FCS.</li>
</ol>
4. Wirowanie w gradiencie gęstości w celu wzbogacenia limfocytów z trawionej nerki
<ol>
	<li>Odwirowywać próbkę w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 5 ml mieszanki 44% Percoll/RPMI (44% Percoll + 56% RPMI bez FBS).</li>
	<li>Umieść końcówkę pipety o pojemności 3 ml zawierającej 3 ml 67% Percollu/PBS (67% Percollu + 33% PBS) bezpośrednio na dnie każdej probówki i powoli uwalniaj roztwór, tak aby ciężki roztwór (67% Percoll/PBS) utworzył wyraźną warstwę na dnie, a lekki roztwór (44% Percoll/RPMI) został podniesiony do góry. Razem utworzą się warstwy koktajli. 
	UWAGA: W przypadku nowo dostarczonej pożywki o gradiencie gęstości od sprzedawcy, dodaj 1/10 objętości sterylnego 10x PBS do butelki, dobrze wymieszaj i rozważ pożywkę o zrównoważonym gradiencie gęstości PBS jako 100% roztwór.</li>
	<li>Wirować próbki przy ciśnieniu 900 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej przy zmniejszonym ustawieniu pedału przyspieszenia i hamulca. 
	UWAGA: W przypadku wirówek z ustawieniami przyspieszenia i hamulca (w skali 1-9 (1 oznacza minimum, a 9 oznacza maksimum)), użyj 6 dla przyspieszenia i 4 dla hamulca.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki, nie naruszając warstw; 
	UWAGA: Przezroczysta warstwa limfocytów jest identyfikowana między różową warstwą RPMI a bezbarwną warstwą PBS.</li>
	<li>Usuń górną warstwę za pomocą pipety transferowej, nie dotykając warstwy limfocytów.</li>
	<li>Przenieś warstwę limfocytów do nowej probówki o pojemności 15 ml, napełnij probówkę PBS/5% FCS i wymieszaj, odwracając probówkę 4-6 razy powoli, aby zapewnić wystarczające wymieszanie. 
	UWAGA: Ten krok jest ważny, aby wypłukać wszelkie pozostałości Percollu.</li>
	<li>Odwirowywać próbki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 500 μl kompletnego podłoża RPMI. Komórki są gotowe do barwienia cytometrią przepływową.</li>
</ol>
5. Barwienie i analiza cytometrii przepływowej
UWAGA: Proszę postępować zgodnie ze standardowym protokołem barwienia cytometrii przepływowej dla limfocytów T.
<ol>
	<li>Weź około 1 x 106 komórek na każde barwienie FACS. 
	UWAGA: Do barwienia FACS należy użyć 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U. Jeśli jednak w grę wchodzi tylko ograniczona liczba próbek, można również użyć probówek FACS o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić każdą próbkę w 50 μl buforu FACS zawierającego 10 μg/ml blokera FcR 2,4G2 (przeciwciało monoklonalne anty-CD16/32 w celu zablokowania interakcji między dodanym przeciwciałem FACS a FcR). Inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
	<li>Bez dalszego wirowania dodać 50 μl mieszaniny przeciwciał barwiących powierzchnię do każdej próbki, tak aby końcowa objętość barwienia wynosiła 100 μl/każdą próbkę. Inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności. 
	UWAGA: Włączyć znakowaną fluorescencyjnie streptawidynę (2 μg / ml lub postępować zgodnie z zaleceniami producenta) do mieszaniny przeciwciał w celu oznaczenia CD8α + wewnątrznaczyniowych limfocytów T CD8 + i użyć znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała anty-CD8β do znakowania wszystkich limfocytów T CD8. Mieszaninę przeciwciał wytwarza się przez dodanie żądanych ilości zainteresowanych przeciwciał do buforu FACS.</li>
	<li>Umyć próbki dwukrotnie PBS. Przy każdym przemyciu napełniać studzienki na płytce 96-dołkowej zimnym PBS, wirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 100 μl/studzienkę rozcieńczonego barwnika żywego/śmierci. Inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności. 
	UWAGA: Nawet przy średnim wirowaniu gradientu gęstości, etap trawienia enzymatycznego często indukuje znaczną śmierć komórek w komórkach T rezydujących w tkance z powodu sygnalizacji ARTC2.2 / P2RX7 15. Barwienie żywym/śmiertelnym barwnikiem jest wysoce zalecane przed utrwaleniem. Anty-ARTC2 nano może być podawany myszom przed eutanazją, aby zapobiec śmierci komórki wywołanej izolacją komórki.</li>
	<li>Dwukrotnie przemyć próbki buforem FACS. Przy każdym przemyciu należy napełnić dołki 96-dołkowej płytki zimnym buforem FACS, wirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze utrwalającym 100 μl/studzienkę. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 min. 
	UWAGA: Bufor utrwalający jest wytwarzany na świeżo przez rozcieńczenie formaldehydu z PBS do końcowego stężenia 2% formaldehydu.</li>
	<li>Dwukrotnie przemyć próbki buforem FACS. Przy każdym przemyciu należy napełnić studzienki płytki 96-dołkowej zimnym buforem FACS, wirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS o stężeniu 250 μl/studzienkę. Uszczelnić płytkę, przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem do czasu analizy FACS. 
	UWAGA: Przed analizą FACS przefiltruj próbki przez nylonową siatkę 70 μM, aby usunąć ewentualne skupiska komórek, które mogą zatkać maszynę FACS.</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cell+subsets%2C+migration+patterns%2C+and+tissue+residence%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence.</a> Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).</li>
<li>Mueller, S. N., Mackay, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+memory+T+cells%3A+local+specialists+in+immune+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence.</a> Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).</li>
<li>Park, C. O., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+resident+memory+T+cells+in+protective+immunity+and+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease.</a> Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).</li>
<li>Schenkel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+memory.+Resident+memory+CD8+T+cells+trigger+protective+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses.</a> Science. 346, 98-101 (2014).</li>
<li>Thome, J. J., Farber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+tissue-resident+T+cells%3A+lessons+from+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans.</a> Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).</li>
<li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hobit+and+Blimp1+instruct+a+universal+transcriptional+program+of+tissue+residency+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes.</a> Science. 352, 459-463 (2016).</li>
<li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-box+Transcription+Factors+Combine+with+the+Cytokines+TGF-beta+and+IL-15+to+Control+Tissue-Resident+Memory+T+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate.</a> Immunity. 43, 1101-1111 (2015).</li>
<li>Milner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx3+programs+CD8%28%2B%29+T+cell+residency+in+non-lymphoid+tissues+and+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours.</a> Nature. 552, 253-257 (2017).</li>
<li>Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Specific+Control+of+Tissue-Resident+Memory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells.</a> Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Memory+CD8+T+Cells+Reveals+Regionalization+of+Immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance.</a> Cell. 161, 737-749 (2015).</li>
<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281(2018).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).</li>
<li>Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+Controls+the+Formation+of+Kidney-Resident+T+Cells+via+Promoting+Effector+T+Cell+Extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation.</a> Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+patterns+of+peripheral+migration+by+memory+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells.</a> Nature. 477, 216-219 (2011).</li>
<li>Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARTC2.2%2FP2RX7+Signaling+during+Cell+Isolation+Distorts+Function+and+Quantification+of+Tissue-Resident+CD8%28%2B%29+T+Cell+and+Invariant+NKT+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets.</a> Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).</li>
<li>Fernandez-Ruiz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-Resident+Memory+CD8%28%2B%29+T+Cells+Form+a+Front-Line+Defense+against+Malaria+Liver-Stage+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection.</a> Immunity. 45, 889-902 (2016).</li>
<li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalizing+the+environment+recapitulates+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice.</a> Nature. 532, 512-516 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie posiadają żadnych istotnych informacji finansowych.

Ponieważ odporność swoista tkankowo jest szybko rozwijającym się obszarem badań, coraz więcej dowodów sugeruje, że komórki odpornościowe, zwłaszcza populacja limfocytów, mogą być zidentyfikowane w prawie wszystkich narządach u dorosłych ludzi lub zakażonych lub uodpornionych myszy. Model infekcji myszy LCMV jest dobrze ugruntowanym modelem do badania odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu, różnicowania efektorów i komórek T pamięci, w tym biologii TRM w wielu tkankach. Tutaj opisaliśmy protokół ana...

Pamięć rezydująca w tkance (TRM) Limfocyty T reprezentują jedną z najliczniejszych populacji limfocytów T u dorosłych ludzi i zakażonych myszy. Komórki TRM stanowią pierwszą linię obrony immunologicznej i są krytycznie zaangażowane w różne procesy fizjologiczne i patologiczne1,2,3,4,5. W porównaniu z krążącymi limfocytami T, komórkiT RM mają wyraźne markery powierzchniowe z unikalnymi programami transkrypcyjnymi6,7,8. Poszerzenie naszej wiedzy na temat biologii TRM jest kluczem do zrozumienia odpowiedzi limfocytów T, co ma zasadnicze znaczenie dla przyszłego rozwoju szczepionek i immunoterapii opartych na limfocytach T.
Oprócz powszechnie stosowanych markerów molekularnych TRMs we wszystkich tkankach nielimfoidalnych, coraz więcej dowodów sugeruje, że cechy specyficzne dla tkanek są centralnym składnikiem biologii TRM9. Nerka zawiera wiele komórek odpornościowych, w tym limfocyty TRM po zakażeniu, i daje doskonałą okazję do zbadania biologii komórek TRM w tkance niebłonowej . Ostre zakażenie LCMV (limfocytarnym wirusem zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych) drogą dootrzewnową jest dobrze ugruntowanym modelem infekcji ogólnoustrojowej do badania odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu u myszy. Infekcja zwykle ustępuje w ciągu 7-10 dni u myszy typu dzikiego i pozostawia dużą liczbę limfocytów T pamięci specyficznych dla LCMV w różnych tkankach, w tym w nerce10. Transgeniczne myszy P14 TCR (receptor komórek T) są nosicielami limfocytów T CD8 + rozpoznają jeden z dominujących immunologicznie epitopów LCMV prezentowanych przez cząsteczkę MHC-I (główny kompleks zgodności tkankowej klasy I) H2-Db u myszy C57BL / 6. Łącząc wrodzony transfer adoptywny limfocytów T P14 i infekcję LCMV u myszy, śledzone są efektory CD8 + i limfocyty T pamięci, w tym różnicowanie TRM i homeostaza.
W niektórych tkankach barierowych, takich jak przedziały limfocytów śródnabłonkowych jelit (IEL) i gruczoły ślinowe, ustalona procedura izolacji limfocytów daje wysoki procent limfocytów TRM z minimalnym zanieczyszczeniem limfocytami T przenoszonymi przez krew w mysim modelu LCMV11. Jednak w tkankach niebarierowych, takich jak nerki, gęsta sieć naczyniowa zawiera dużą liczbę krążących limfocytów T CD8 +. Zostało dobrze udokumentowane, że nawet udana perfuzja nie może skutecznie usunąć wszystkich krążących limfocytów T CD8 +. Aby pokonać tę przeszkodę techniczną, wewnątrznaczyniowe barwienie przeciwciałami zostało uznane za jedną z najczęściej stosowanych technik w TRM labs12. Krótko mówiąc, 3-5 minut przed eutanazją dożylnie podaje się 3 μg/mysie przeciwciało anty-CD8 (do znakowania limfocytów T CD8 +). Nienaruszona ściana naczynia krwionośnego zapobiega szybkiej dyfuzji przeciwciała w tym krótkim czasie (tj. 3-5 minut) i znakowane są tylko komórki wewnątrznaczyniowe. Zgodnie ze standardowym protokołem izolacji limfocytów, komórki wewnątrznaczyniowe i zewnątrznaczyniowe można łatwo odróżnić za pomocą cytometrii przepływowej.
Tutaj opiszemy standardowy protokół powszechnie używany w laboratoriach TRM do wykonywania wewnątrznaczyniowego znakowania, izolacji limfocytów i analizy cytometrii przepływowej limfocytów T CD8+ nerek przy użyciu myszy C57BL/6, która otrzymała limfocyty T CD45.1+ P14 i infekcję LCMV 30 dni przed13. Ten sam protokół można zastosować do badania zarówno efektorowych, jak i pamięciowych limfocytów T w nerce.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-130</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki stożkowe</td><td>Corning</td><td>431470</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 3 ml</td><td>Inkubator BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>37C VWR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotyna Przeciwciało A-CD8a (klon 53-6,7)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>Collegenase B</td><td>Millipore Sigma</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety do przenoszenia z podziałką</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>Mikro preparacyjne nożyczki sprężynowe</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS 5692</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Mojosort CD8 Na&iuml; ve Zestaw do izolacji limfocytów T Górna</td><td></td> lampa grzewcza <td>Biolegend</td> 480043 <td></td></tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>B00333PZZG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>rocker</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Mysz z litego mosiądzu Ogranicznik</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>SAI-MBR</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z wiadrem obrotowym z lodówką</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kultura tkankowa 6-dołkowa</td><td>płytka Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja mysich limfocytów t cd8 + rezydujących w nerkach do analizy cytometrii przepływowej

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Limfocyt T pamięci rezydującej w tkankach (TRM) to szybko rozwijająca się dziedzina badań immunologicznych. Wyizolowanie limfocytów T z różnych tkanek nielimfoidalnych jest jednym z kluczowych etapów badania TRM. Istnieją niewielkie różnice w protokołach izolacji limfocytów dla różnych narządów. Nerka jest niezbędnym narządem nielimfatycznym z licznym naciekiem komórek odpornościowych, zwłaszcza po ekspozycji na patogeny lub aktywacji autoimmunologicznej. W ostatnich latach wiele laboratoriów, w tym nasze, zaczęło charakteryzować limfocyty T CD8 + rezydujące w nerkach w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych zarówno u myszy, jak i u ludzi. Ze względu na obfitość limfocytów T, nerka stanowi atrakcyjny narząd modelowy do badania TRMs w tkankach niebłonowych lub niebarierowych. W tym miejscu opiszemy protokół powszechnie stosowany w laboratoriach skoncentrowanych na TRM do izolowania limfocytów T CD8 + z nerek myszy po ogólnoustrojowej infekcji wirusowej. Krótko mówiąc, używając modelu zakażenia wirusem ostrego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (LCMV) u myszy C57BL / 6, demonstrujemy wewnątrznaczyniowe znakowanie limfocytów T CD8 +, trawienie enzymatyczne i wirowanie w gradiacji gęstości w celu wyizolowania i wzbogacenia limfocytów z nerek myszy w celu przygotowania próbek do późniejszej analizy cytometrii przepływowej.

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu został przedstawiony w formie schematu blokowego (Rycina 1A). W 30. dniu po zakażeniu LCMV przeprowadzono znakowanie wewnątrz naczyniowe limfocytów T CD8+. Po 5 minutach obie nerki zwierzęcia wypreparowano, posiekano i poddano trawieniu kolagenazą. Limfocyty z utrawionych próbek oczyszczono za pomocą centryfugacji w gradiencie Percoll, a następnie poddano analizie cytometrycznej. Jak pokazano na Rycynie 1B, na...

Po infekcji wirusowej, nerka zawiera stosunkowo dużą liczbę limfocytów T CD8+ i daje możliwość badania nieśluzówkowych komórekT RM. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji limfocytów nerkowych myszy do analizy cytometrii przepływowej.

Izolacja mysich limfocytów T CD8 + rezydujących w nerkach do analizy cytometrii przepływowej

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Limfocyty T CD8 + mają wyraźne cechy w różnych tkankach, jako krytyczny przykład tkanki niebłonowej i nielimfoidalnej. Niezbędne jest bezpośrednie scharakteryzowanie komórek rezydujących w nerkach, aby w pełni zrozumieć biologię komórek T. Tutaj zademonstrujemy naszą wygodną metodę izolowania limfocytów T CD8 + rezydujących w nerkach, a następnie analizy metodą cytometrii przepływowej.Metoda ta może dostarczyć informacji na temat badań efektorowych i pamięciowych limfocytów T CD8+ generowanych po infekcjach, a także po odpowiedziach autoimmunologicznych. Zabieg zostanie przeprowadzony przez dr Chaoyu Ma, naukowca pracującego dla mojego laboratorium. Zacznij od rozcieńczenia przeciwciała biotyny anty CD8 alfa do 15 mikrogramów na mililitr w PBS, upewniając się, że jest go wystarczająco dużo, aby podać 200 mikrolitrów każdej myszy.Przed wstrzyknięciem należy podgrzać żyłę ogonową myszy za pomocą górnej lampy grzewczej przez pięć do 10 minut, aby ją rozszerzyć. Pobrać 200 mikrolitrów wstępnie rozcieńczonej mieszanki przeciwciał do strzykawki insulinowej o rozmiarze 28 i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, przesuwając tłok w górę iw dół. Zegnij igłę, aby utworzyć kąt 150 stopni międz

isolation-mouse-kidney-resident-cd8-t-cells-for-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Komórki DNabT są rzadkie wśród obwodowych limfocytów T, jednak są obfite w niektórych tkankach nielimfatycznych. Trudność w wyizolowaniu limfocytów DN T z tkanki nielimfatycznej utrudnia ich analizę funkcjonalną pomimo rosnącego rozpoznanego znaczenia patofizjologicznego. Opisujemy nowy protokół izolacji wysoce oczyszczonych limfocytów T DN z mysiej nerki.

Izolacja podwójnie ujemnych limfocytów T αβ z nerki

Ten protokół opisuje enzymatyczne trawienie skóry myszy w pożywce bogatej w składniki odżywcze, a następnie separację gradientową w celu wyizolowania leukocytów.  Uzyskane w ten sposób ogniwa mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań końcowych. Jest to skuteczna, ekonomiczna i ulepszona alternatywa dla maszyn do dysocjacji tkanek i ostrzejszych protokołów trawienia tkanek opartych na trypsynie i dyspazie.

Izolacja naciekających leukocytów ze skóry myszy za pomocą trawienia enzymatycznego i separacji gradientowej

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w patogenezie udaru niedokrwiennego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że działa jak miecz obosieczny, który zaostrza wczesne uszkodzenie mózgu, ale także przyczynia się do późniejszej naprawy. Protokół ten opisuje izolację komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu i ich późniejsze fenotypowanie metodą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Makrofagi to plastyczne komórki układu krwiotwórczego, które odgrywają kluczową rolę w ochronnej odporności i homeostazie. W tym raporcie opisujemy zoptymalizowane techniki in vitro do fenotypowego i funkcjonalnego charakteryzowania makrofagów regulatorowych naciekających przeszczepy, które gromadzą się w przeszczepionym narządzie w warunkach tolerogennych.

Charakterystyka funkcjonalna makrofagów regulatorowych, które hamują odporność reaktywną przeszczepu

Techniki, które są niezawodne i skuteczne w izolacji komórek odpornościowych nerek, są potrzebne do dalszych zastosowań. Wymaga to znakowania powierzchniowego przeciwciałami niewielkiej liczby komórek odpornościowych nerek. W niniejszym artykule opisujemy zwięzłą metodę izolacji komórek odpornościowych nerek, która pozornie osiąga ten cel.

Niezawodna i wysokowydajna izolacja komórek odpornościowych nerek

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię identyfikacji i ilościowego określania funkcjonalnych podzbiorów limfocytów T obecnych w mysich nerkach, aorcie i węzłach chłonnych za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego i cytometrii przepływowej. Model nadciśnienia indukowanego angiotensyną II został wybrany, aby krok po kroku wyjaśnić procedury i podstawowe zasady cytometrii przepływowej i barwienia wewnątrzkomórkowego.

Barwienie wewnątrzkomórkowe i cytometria przepływowa w celu identyfikacji podzbiorów limfocytów w obrębie mysiej aorty, nerek i węzłów chłonnych w modelu nadciśnienia tętniczego

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania pojedynczych komórek z mysiej grasicy, węzła chłonnego drenującego trzustkę i śledziony do dalszego badania tych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto protokół ten wykorzystano do określenia podzbiorów regulatorowych limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej.

Oznaczanie podzbiorów regulatorowych limfocytów T w grasicy myszy, węźle chłonnym drenującym trzustkę i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej

Napływ wapnia, miara sygnalizacji limfocytów T, jest skutecznym sposobem analizy reakcji na stymulację receptorów limfocytów T. Ten protokół multipleksowania Indo-1 z panelami przeciwciał skierowanymi na cząsteczki powierzchniowe komórki wykorzystuje wysoce elastyczne możliwości cytometrii przepływowej w pełnym spektrum.

Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

Poznaj metodę izolacji limfocytów T CD8+ rezydujących w nerkach myszy do analizy cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badanie biologii komórek T w tkankach pozaśluzowych.

Izolacja mysich limfocytów T CD8 ⁺ rezydujących w nerkach do analizy cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów