Izolacja mysich limfocytów T CD8 ⁺ rezydujących w nerkach do analizy cytometrii przepływowej

Limfocyty T CD8 + mają wyraźne cechy w różnych tkankach, jako krytyczny przykład tkanki niebłonowej i nielimfoidalnej. Niezbędne jest bezpośrednie scharakteryzowanie komórek rezydujących w nerkach, aby w pełni zrozumieć biologię komórek T. Tutaj zademonstrujemy naszą wygodną metodę izolowania limfocytów T CD8 + rezydujących w nerkach, a następnie analizy metodą cytometrii przepływowej.

Metoda ta może dostarczyć informacji na temat badań efektorowych i pamięciowych limfocytów T CD8+ generowanych po infekcjach, a także po odpowiedziach autoimmunologicznych. Zabieg zostanie przeprowadzony przez dr Chaoyu Ma, naukowca pracującego dla mojego laboratorium. Zacznij od rozcieńczenia przeciwciała biotyny anty CD8 alfa do 15 mikrogramów na mililitr w PBS, upewniając się, że jest go wystarczająco dużo, aby podać 200 mikrolitrów każdej myszy.

Przed wstrzyknięciem należy podgrzać żyłę ogonową myszy za pomocą górnej lampy grzewczej przez pięć do 10 minut, aby ją rozszerzyć. Pobrać 200 mikrolitrów wstępnie rozcieńczonej mieszanki przeciwciał do strzykawki insulinowej o rozmiarze 28 i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, przesuwając tłok w górę iw dół. Zegnij igłę, aby utworzyć kąt 150 stopni między igłą a strzykawką, skośnie do góry, tak aby igła była równoległa do żyły ogonowej.

Utrzymaj mysz za pomocą ogranicznika gryzoni i spryskaj ogon 70% etanolem, aby żyła była wyraźnie widoczna. Przytrzymaj ogon na dystalnym końcu kciukiem i środkowymi palcami ręki niedominującej, a następnie umieść palec wskazujący pod miejscem wstrzyknięcia. Ręką dominującą wprowadź igłę do żyły równolegle w kierunku serca i powoli wstrzyknij 200 mikrolitrów przeciwciała.

Wyjąć igłę i delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia, aż krwawienie ustanie. Po eutanazji myszy wypreparuj nerkę nożyczkami i przenieś ją do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Próbki należy pozostawić na lodzie do czasu dalszego przetwarzania.

Przygotuj sześciodołkowe płytki z trzema mililitrami roztworu wytrawiającego w każdej studzience, używając jednego dołka na mysz i przechowuj je na lodzie. Dodać 300 mikrolitrów roztworu wytrawiającego do każdej probówki z próbką i zmielić próbki nerek prostymi nożyczkami sprężynowymi. Przenieść zmielone próbki nerek na sześciodołkowe płytki z roztworem wytrawiającym.

Inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie kołysząc przez 45 minut, a następnie homogenizować tkankę za pomocą kołnierza tłoka trzymililitrowej strzykawki i przenieść ją do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Obracaj próbki w temperaturze 500 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach RPMI z 10% FCS.

Wiruj próbkę w temperaturze 500 razy g i czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy za pomocą pięciu mililitrów pożywki o gradiencie gęstości 44% i mieszanki RPMI. Umieść końcówkę trzymililitrowej pipety zawierającej trzy mililitry pożywki o gradiencie gęstości 67% i PBS bezpośrednio na dnie każdej probówki i powoli uwalniaj roztwór, tak aby ciężki roztwór utworzył wyraźną warstwę na dnie. Wirować próbki z prędkością 900 razy g przez 20 minut ze zmniejszonymi ustawieniami przyspieszenia i hamulca, a następnie ostrożnie wyjąć probówki z wirówki, nie naruszając warstw.

Usuń górną warstwę za pomocą pipety transferowej bez dotykania warstwy limfocytów i przenieś warstwę limfocytów do nowej 15-mililitrowej probówki. Napełnij probówkę PBS i 5% FCS, a następnie wymieszaj, powoli odwracając probówkę cztery do sześciu razy. Po odwirowaniu próbek w temperaturze 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 500 mikrolitrów kompletnej pożywki RPMI.

Komórki są teraz gotowe do barwienia cytometrią przepływową. Nawet po wzbogaceniu limfocytów za pośrednictwem wirowania gęstości, bardzo często obserwowano dużą część nie-limfocytów w produkcie końcowym. Jednak po uzyskaniu na żywych limfocytach, limfocyty T CD8 + były łatwe do zidentyfikowania.

Zgodnie z oczekiwaniami, tylko zewnątrznaczyniowe limfocyty T CD8 + skutecznie nabywały fenotypy komórek T pamięci rezydującej w tkance, takie jak regulacja w górę CD69 i regulacja w dół Ly6C. W przeciwieństwie do zakażonych myszy, zdecydowana większość limfocytów T CD8 + wyizolowanych od młodych naiwnych myszy przebywających w placówce SPF była znakowana przeciwciałem alfa CD8 i dlatego należała do przedziału wewnątrznaczyniowego. Technika ta znacznie przyspieszyła badania komórek odpornościowych rezydujących w tkankach w gęsto unaczynionych narządach.